利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法与流程

本发明属于细胞低温冻存技术领域，具体涉及一种雪旺细胞的低温冻存方法。

背景技术：

近年来，随着活体细胞和组织在医学，生物学，药学等多个领域的广泛应用，对活体细胞和组织的需求也日益增长，而离体的细胞和组织在常温下难以实现长期保存和长途运输，且细胞的体外培养本身过于耗时耗材。因此，低温冻存作为目前最常用的对活体细胞和组织的保存技术，逐渐成为近年来的研究热点。在传统的低温冻存过程中，随着温度的下降，细胞的生理活动被迫停止，而当温度恢复至生理温度，细胞复苏，细胞又可恢复活性，发挥其生理功能。然而现有的冻存方法会对细胞造成一定程度的冰晶损伤，以及由于冻存保护剂的加入和难以去除带来的毒性伤害，体积变化损伤和渗透损伤。

目前将凝胶应用于低温冻存的研究报道中，多为利用水凝胶包埋活细胞的方法来减少低温损伤。hang等研究了利用海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸微胶囊做微囊化肝细胞冻存相对于直接对肝细胞冻存的影响，复苏后的检测结果表明，微囊化冻存组相对直接冻存组，生存能力更强，附件效率也更高。haishuihuang等发现海藻酸盐水凝胶微囊化的细胞可以在冻存后的复苏过程中有效的抑制反玻璃化，从而保护细胞免受其内部的冰晶对细胞造成的伤害。但微胶囊的包裹会限制甚至阻碍贴附型细胞的贴壁、迁移、增殖和分化。例如：kuldipsidhu等研究了海藻酸盐水凝胶微囊化的人体胚胎干细胞(hescs)和未被包埋的胚胎干细胞的活性和干性。研究结果表明，被海藻酸盐凝胶包埋的的活性和干性都较未包埋的hescs低，且海藻酸盐凝胶囊膜难以去除。

与传统凝胶通过化学交联的方法形成凝胶态不同，超分子水凝胶由低分子的有机化合物即凝胶因子在水中通过分子间非共价键作用(如氢键，静电作用，π-π共轭)形成交联得到三维网络状结构，进而形成凝胶态。因而超分子水凝胶的交联方式属于物理交联，更加接近自然界中生物体的交联结构。因此，超分子水凝胶的生物相容性极佳。此外，分子间非共价键的作用本身可逆，因而超分子凝胶通常也是可逆的，并且还可能具备自修复特性和刺激响应性。因此，作为一种软物质材料，超分子水凝胶在药物载体，生物医学等领域的应用广泛。

目前相关的报道多利用水凝胶微胶囊来冻存细胞或组织，而基于超分子凝胶在微流控装置中的低温保存研究却很少。微流控技术作为一种可以在截面尺寸为微米级的微型通道内操控流体的中心技术，在许多微型系统包括化学，生物和医药等方面应用广泛。常见的微通道包括由软刻蚀技术制得的pdms硅胶通道和由毛细管构成的玻璃微通道。相比pdms硅胶微通道形成的微流控装置，玻璃毛细管微流控装置的制作成本更为低廉，方法更为简便，且存储量更大。

雪旺细胞最早是在1939年被theodorschwann发现和命名的一种胶质细胞。雪旺细胞通过在外周神经系统中增殖，迁移和分化等形成鞘突，鞘和轴突一起构成了一个神经纤维。研究表明，雪旺细胞对周围神经的发育和再生等影响重大。wang等通过移植技术将雪旺细胞移植到坐骨神经损伤处，成功使坐骨神经再生。因此，雪旺细胞对神经修复有重要意义。对雪旺细胞进行冷冻保存可以帮助更好地研究其生物学特征和临床应用。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种雪旺细胞的低温冻存方法，减少被包埋的雪旺细胞在冻存过程中受到的损伤，提高复温后雪旺细胞的存活率，并保证其正常的增殖情况。

为达到上述目的，采用技术方案如下：

利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法，包括以下步骤：

将已贴壁的雪旺细胞经消化，离心，加入溶有凝胶因子的细胞全培养基并吹散，得到含有凝胶因子的雪旺细胞悬浮液；

将所得细胞悬浮液和冻存保护剂导入微流控装置中；

将微流控装置置于0～2℃冰水浴中，平衡4～5min；

最后将微流控装置直接置于程序降温盒，并放入-82～-78℃冰箱。

按上述方案，所述的凝胶因子为低分子量的氨基酸类凝胶因子；其浓度为0.75g/l，相转变温度为6-7℃。

按上述方案，所述的细胞全培养基为含有10vol％胎牛血清和1vol％双抗的rpmi1640全培养基。

按上述方案，所述的微通道装置由圆形毛细管、方形毛细管、聚四氟乙烯管、聚氨酯管组装而成：

将圆形毛细管一端插入到方形毛细管中，保证方形毛细管的内壁和圆形毛细管的外壁紧贴；所述方形毛细管的长度较长；

使用聚四氟乙烯管一端套住圆形毛细管的伸出端并密封；

使用聚氨酯管套住聚四氟乙烯管、圆形毛细管和方形毛细管；所述聚氨酯管与方形毛细管重合的一端缩小管口径并密封，另一端即为冻存保护剂的入口；

所用聚氨酯管侧面开有孔，聚四氟乙烯管口从孔中伸出，即为细胞悬浮液入口。

按上述方案，所述的冻存保护剂为二甲基亚砜；浓度为6-10vol％。

本发明低分子量的氨基酸类凝胶因子通过非共价键自组装形成超分子水凝胶具有良好的生物相容性。由于非共价键具有热可逆性，因此所得超分子水凝胶也是热可逆的。该超分子水凝胶通过调节凝胶因子浓度可保证其在低温时形成凝胶相，在复温即37℃时由凝胶相转变为液相，因此可通过离心与细胞分离。同时，在细胞培养基和传统的冻存保护剂中加入超分子凝胶，利用超分子凝胶的三维网络结构和热可逆性来降低细胞在冻存和复温过程中的损伤，并解决复温后囊膜材料的去除问题。

本发明微流控装置制备简单，可提供超分子水凝胶的受限空间。使超分子水凝胶形成纤维网络更为紧密的球形三维网络结构，在冻存过程中对细胞起到更好的保护作用。具体表现为：束缚水分子，降低体系冰点，限制冰晶的生长空间，减少冰晶损伤；减小渗透速率，减缓由于冻存保护剂的加入和去除而引起的渗透压的变化，从而减少细胞渗透和体积变化损伤，以提高细胞复温后的存活率。

本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：

在冻存过程中利用超分子水凝胶特殊的三维网络多孔结构保护细胞免受冻存伤害，提高细胞复温后的存活率，又保证了它在复温后能完全去除，不影响细胞的贴壁，增殖和分化等活动。

由于超分子水凝胶在受限空间中形成的交联网络结构较非受限空间更加紧密，因此在微通道中的超分子水凝胶比微通道外的超分子水凝胶对细胞的冷冻保护更好。微流控技术作为一种微米规模的技术手段，其尺度刚好与细胞大小吻合，且相对传统的细胞培养技术，微流控设备可以对细胞所处的微环境做更为灵活精准的控制。与软刻蚀法得到的微通道装置相比，利用玻璃毛细管得到的微流控装置成本更低，制作更为简单，且可冻存体积更大。

由于受限空间内超分子水凝胶的结构可起到很好的冷冻保护作用，因而可通过微流控精准调控冻存保护剂的用量，在传统用量的基础上适当降低所加入冻存保护剂的浓度，这样就更进一步的减少了细胞的毒性伤害，再次提高细胞的存活率。

附图说明

图1：dsc分析图；

图2：微流控装置的示意图；

图3：载玻片上的超分子水凝胶微观形貌；

图4：微流控装置内超分子水凝胶的微观形貌；

图5：各组复温后雪旺细胞的存活率；

图6：各组复温后细胞的存活和增殖情况；

其中：1-方形毛细管，2-圆形毛细管，3-聚氨酯管，4-聚四氟乙烯管。

具体实施方式

以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。

实施例1：超分子水凝胶的制备及其性能研究

以boc-l-酪氨酸甲酯、dmf和溴代十二烷等为原料合成凝胶因子十二烷基-boc-l-酪氨酸，记为凝胶因子bdt。该凝胶因子的合成方法如下：

(1)十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)的合成(boc-l-酪氨酸甲酯烷基化)：

称取3.998g(0.0135mol)boc-l-酪氨酸甲酯置于25ml圆底烧瓶中，加入10mldmf，待原料完全溶解后，再加入3.7113gk2co3(0.027mol)作为缚酸剂，后加入4ml溴代十二烷(0.0167mol)，室温反应12h。反应结束后加20ml水洗涤，抽滤、洗涤滤饼、真空干燥24h后得到得白色固体。无水乙醇(20ml)重结晶1次，得纯净的白色固体。

(2)bdt的合成(bdte的水解反应)：

将0.5007g(0.0011mol)bdte置于25ml烧瓶中用10ml乙醇溶解，在冰水浴下逐滴加入1mol/l的naoh溶液1.7ml(0.0017mol)，在0℃左右反应1h，室温反应5h。在强烈搅拌下向反应体系中逐滴加入0.2mol/l的冰盐酸(25ml)溶液至ph为1～2，抽滤，真空干燥24h得0.4858g白色固体。

该凝胶因子bdt可通过加热溶于细胞培养基，并在低温时形成具有三维网络结构的超分子水凝胶，且该超分子水凝胶热可逆，在温度回升至其相转变温度以上时可恢复至液态。

将1.5g/l的bdt在50～55℃条件下溶于细胞培养基溶液，记为溶液s。通过倒置法确定溶液s可在3～5℃冰水浴中形成超分子水凝胶，记为凝胶g。通过升高体系温度，利用落球法测试得到凝胶g的相转变温度为6.5℃，远低于细胞复温时的37℃。因此可选用溶液s导入到微通道作为细胞冻存时的培养基，使其在受限空间形成特殊的三维网络结构以保护细胞。

以加入了10vol％的dmso的rpmi1640培养基作为空白组，在空白组的基础上加入1.5g/l的bdt的混合溶液作为凝胶组，对两组培养基溶液做dsc测试，结果如图1所示，空白组体系冰点为-17.03℃，而加入了bdt的凝胶组体系冰点为-20.46℃，相比空白组冰点有所下降，说明g的空间网络结构可有效降低体系冰点，减少细胞在冻存过程中的冰晶损伤。

实施例2：微流控装置的制备和微流控装置内超分子水凝胶的形貌

微流控装置的制备主要采用购自北京中成石英玻璃制品有限责任公司的石英玻璃毛细管。具体制备过程如下：将长度为40mm的圆形毛细管(内径0.4mm，外径0.7mm)插入到聚四氟乙烯管(内径1.0mm，外径1.3mm，购自无锡海新塑料制品有限公司)中，连接处通过环氧树脂胶和硅胶质量比为1：1的环氧结构胶(购自美国itwdevcon公司)粘接密封，固化约30min。用剪刀在聚氨酯管(内径2.0mm，外径2.8mm，购自无锡海新塑料制品有限公司)的上方开一小孔，将聚四氟乙烯管的另一端自聚氨酯管内部插入，从小孔处插出，连接处用环氧结构胶粘结密封。将圆形毛细管的另一端插入到长度为110mm的方形毛细管(内径0.7mm，外径0.9mm)中，两管重合部分为20mm。方形毛细管的同一端插入到聚氨酯管有聚四氟乙烯管插入的一端中，连接处用环氧结构胶粘结密封，待环氧结构胶固化1～2h，微流控装置制作完成。

如图2所示，所述微流控装置由方形毛细管1、圆形毛细管2、聚氨酯管3、以及聚四氟乙烯管4组装而成。

用一次性注射器吸取0.5ml的溶液s，将一次性注射器针头插入到聚四氟乙烯管中，将一次性注射器固定在微量注射器泵(购自美国farmingdale公司)上，调节流速为50μl/min，将溶液s导入微通道中。将微流控装置置于0～2℃冰箱中20min，再置于光学显微镜下观察。此外将溶液s滴在载玻片上，待其自然流平，置于4℃冰箱中20min，也置于光学显微镜下观察。图3和图4分别为在s溶液在载玻片上以及微流控装置中所形成的超分子水凝胶的形貌。

实施例3：低温冻存大鼠雪旺细胞

1.细胞的获得与培养：雪旺细胞(atcc:crl:2765)是由湖北生物材料工程技术研究中心从健康成年的雄性大鼠上提取并提供而得。用25ml的t型培养瓶将雪旺细胞培养在含有10vol％胎牛血清和1vol％双抗的rpmi1640培养基中，将培养瓶放置在含有5％co2，且温度可持续维持在37℃的细胞培养箱中。细胞在培养瓶中贴壁生长，增殖。当细胞增殖到培养瓶底部没有空隙时，加入胰蛋白酶(0.25vol％)进行消化，使贴壁的细胞悬浮，将含有胰蛋白酶的细胞悬浮液移入离心管，以1000r/min的转速离心8min，吸弃上清，再次加入全培养基并吹散细胞，将细胞接种到多个培养瓶中，继续置于培养箱中培养。

2.添加凝胶因子的雪旺细胞的冻存管中冻存与复温

(1)将已贴壁且处于对数期的细胞用0.25％胰蛋白酶消化，使细胞悬浮于全培养基中，将含有胰蛋白酶的细胞悬浮液分为等量两组：空白组，凝胶组。将两组细胞悬浮液分别移入离心管，每组均用高速离心机离心8min，(设定转速为1000r/min)，使细胞沉于底部，弃上清。

(2)空白组用全培养基吹散细胞，凝胶组用加入了1.5g/lbdt的全培养基吹散细胞，调整细胞浓度为2×10⁶cells/ml，两组分别取0.5ml细胞悬浮液置于2ml冻存管中，在4℃冰水浴中滴加0.5ml的冷冻保护剂i(在全培养基中加入20vol％dmso，得到冷冻保护剂i)，在滴加冷冻保护剂过程同时应轻轻晃动冻存管使dmso和细胞悬浮液混合均匀，防止溶解放热等因素对细胞造成损伤。

(3)将两组冻存管放置于程序降温盒中，再将降温盒置于-80℃的恒温冰箱，程序降温盒可以使降温速率保持在1℃/min。

(4)复温：将程序降温盒置于-80℃恒温冰箱保存24h后，取出程序降温盒中的两组冻存管，并快速转移到37℃恒温水浴复温，使整个体系恢复至液态。将两组冻存管中的细胞悬浮液吸出，加入到15ml离心管中，加入9ml全培养基，经1000r/min的速度离心15min，使细胞沉淀在离心管下方，弃上清，再加入10ml全培养基，重复离心一次。弃上清，加入4ml全培养基，转移到培养瓶中，在细胞培养箱中培养。

3.添加凝胶因子的雪旺细胞的微流控技术冻存与复温

(1)在已贴壁的细胞中加入0.25％浓度的胰蛋白酶，使细胞消化后悬浮于全培养基中，将含有胰蛋白酶的细胞悬浮液吸出，加到离心管中，并用高速离心机离心8min，(设定转速为1000r/min)，弃上清。向细胞中加入含有1.5g/lbdt的全培养基并吹散，调整细胞浓度为：2×10⁶cells/ml，得到纯净的细胞悬浮液。

(2)将微流控装置分为a，b两组。向a组微流控装置中加入冷冻保护剂i，b组微流控装置中加入冷冻保护剂ii(在全培养基中加入12vol％dmso，得到冷冻保护剂ii)。两组操作步骤相同。具体操作过程如下：用注射器1吸取0.5ml冷冻保护剂，注射器2吸取0.5ml细胞悬浮液，注射器1和聚氨酯管相连，注射器2和聚四氟乙烯管相连。将两注射器分别固定于两台微流量注射泵上，调节流速为5～7μl/min，将含有凝胶因子bdt的雪旺细胞悬浮液和冷冻保护剂同时导入微流控装置中。将微流控装置置于0～2℃冰水浴中，平衡4～5min。

(3)将两组微流控装置置于梯度降温盒中，再将降温盒置于-80℃的恒温冰箱中，使整个体系以1℃/min的降温速率降至-80℃。因此，冻存时的两组含全培养基的细胞悬浮液中，加入的其他成分的最终配比分别为：微流控a组：0.75g/lbdt+10vol％dmso；微流控b组：0.75g/lbdt+6vol％dmso。

(4)复温：将程序降温盒置于-80℃恒温冰箱保存24h后，取出程序降温盒中的微流控装置，并置于37℃恒温水浴中解冻，使体系恢复至液态。用注射器吸取0.5ml全培养基，将聚四氟乙烯管和注射器相连，在方形毛细管出口端置于离心管中，再将注射器固定在微流量注射泵上，设定流速为30μl/min，将微流控装置中的雪旺细胞冲洗到离心管中，冲洗3-5次，经1000r/min的速度离心15min，使细胞沉淀在离心管下方，弃上清，再加入10ml全培养基，重复离心一次。弃上清，加入4ml全培养基，转移到培养瓶中，在细胞培养箱中培养。

实施例4：复温后雪旺细胞的检测

1.台盼兰排斥实验

本发明使用台盼蓝排斥试验来检测复温后大鼠雪旺细胞的死活，从而计算和比较不同的冻存方式下每组雪旺细胞的存活率。具体操作方法如下：

(1)接种雪旺细胞：取每组复温后离心过的大鼠雪旺细胞悬浮液，调整细胞密度为6×10³cells/ml。按照每孔90μl的体积标准接种于96孔培养板中，每组接种6个孔；

(2)台盼蓝染色：在接种了细胞的96孔培养板中，选择一组中的一个孔，加入10μl0.4％的台盼蓝溶液(将4％台盼蓝母液用pbs缓冲溶液稀释10倍制得)，吹打混匀；

(3)计数：迅速将细胞悬浮液充入血球计数板，并移至倒置显微镜镜头下观察，在染色后3分钟内，于显微镜镜下观察，此时，淡蓝色的细胞是被台盼蓝染色成功的死细胞，没有被染上颜色的则是活细胞，快速记下死细胞和活细胞的数目。根据公式(4-1)求细胞存活率，并对其他每组各孔重复(2)、(3)，取各组细胞存活率的平均值。

图5为复温后各组雪旺细胞的平均存活率。

对比在冻存管中冻存的对照组和凝胶组，显然添加了0.75g/lbdt的凝胶组的雪旺细胞平均存活率更高。此外，在微流控装置中冻存的两组细胞复活率均高于冻存管中的两组细胞。综合比较来看，加入了6vol％dmso的微流控冻存组相比含有10vol％dmso的冻存管组的细胞平均存活率要更高。

2.mtt比色实验

本发明使用mtt比色实验的方法来检测经冻存管冻存和微通道冻存两种冻存方式冻存，复温后各组大鼠雪旺细胞的存活与生长情况。具体实验方法如下：

(1)接种雪旺细胞：雪旺细胞经两种冻存方式冻存24h复温并离心后，调整细胞悬浮液密度为6×10³cells/ml，按照每孔100μl的体积标准接种到96孔细胞培养板中，其中每组需要接种5块培养板，每块培养板中每组细胞至少接种6个孔；

(2)96孔培养板中的培养：将96孔培养板放置在细胞培养箱中，培养0.5天，1天，2天，3天，5天后分别取出一块培养板做后续测试和处理，培养过程中，若96孔板中全培养基颜色发生变化，则需立即更换全培养基，确保活细胞的正常生长和增殖；

(3)mtt呈色：将各组的96孔细胞培养板做相同mtt呈色处理：每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，随后继续放置在细胞培养箱中，4h后，取出96孔培养板，小心吸弃孔内培养上清液，每个孔都小心加入体积为150μl的dmso，孔底迅速出现紫色结晶。并将96孔细胞培养板置于摇床，震荡15min左右至紫色结晶完全溶解；

(4)测定吸光值：将96孔板置于酶标仪中，先用连续波长测定一个孔吸收曲线，找出吸收的峰值对应的波长为550nm，用次波长测定吸光值。记录数据；

(5)整理数据：将每组培养了0.5天，1天，2天，3天，5天的细胞经mtt比色实验所测吸光值整理，以所测吸光值为y轴，以测定的生长时间为x轴，得到细胞的增殖曲线。

图6为各组雪旺细胞复温后0.5天到5天内的存活和增殖情况。

实验结果显示，加入了凝胶因子bdt后的冻存组其雪旺细胞存活率相比空白组更高，且凝胶因子的加入没有影响到复温后细胞的增殖情况，说明超分子水凝胶在复温后被去除干净；在微通道中的冻存组复温后的存活率显然高于冻存管中的雪旺细胞。综合比较来看，加入了6vol％dmso的微流控冻存组相比含有10vol％dmso的冻存管组有更好的冻存保护效果。这意味着利用受限空间内的超分子水凝胶既可以减少细胞的冷冻伤害，又可以通过降低冷冻保护剂的浓度，减小对细胞的毒性伤害。