本发明涉及一种灵芝的栽培方法，特别是一种多糖含量高灵芝段木栽培方法。
背景技术：
灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属，在我国有两千多年的药用史。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为灵芝能治疗多种疾病，是滋补强壮扶正固本的珍贵药物。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，存在于灵芝的子实体、孢子粉和菌丝体中，具有抑制肿瘤、增强机体对自由基清除的能力，故能减少自由基对机体的损伤、有延缓衰老之功效，还可以提高免疫力、抗炎症、降血脂、降血糖等作用。
随着灵芝的保健功效被人们广泛的认识和接受，野生灵芝已远远不能满足人们的需求。但是现有技术栽培灵芝时，不利于产出灵芝的品质保证。特别是不能保证灵芝中多糖的含量，使得最终得到的灵芝中多糖含量低。
技术实现要素：
本发明的目的，是提供一种灵芝段木栽培方法。所述方法栽培后得到的灵芝的品质好，灵芝中的有效成分多糖含量高。
本发明是这样实现的。
一种灵芝段木栽培方法，包括菌材处理、接种、培育菌丝、入畦、出芝管理和采收。
前述的灵芝段木栽培方法，具体包括以下步骤：
(1)菌材处理：选择柞树、枫树、椴树、榆树、千金榆或胡桃楸，截成段，每段长12-17cm，将截成段的段木于90-100℃的蒸汽下灭菌12-14h后，装入聚乙烯袋中，每袋装1段，用绳系紧；
(2)接种：无菌状态下，将栽培种按每平方米750毫升菌种量接入段木中，接种时间为3月份；
(3)培育菌丝：接好种的段木菌袋要放在温度为25-30℃，湿度为55-65％条件下培养18-22天后，对聚乙烯袋刺孔，继续培养48-52天，即得菌丝；
(4)入畦：去掉聚乙烯袋，取出培育有菌丝的段木，置于畦中，畦深10-12cm，宽1.2-1.5m，长1.5-2.0m，段木之间间隔10-12cm，空隙填满潮湿的细土，然后再覆1-2厘米厚的沙子；
(5)出芝管理：采用干湿管理法，即三天湿，即空气湿度95％以上，一天偏干，以土壤表面泥土稍发白为准，每隔10-20天按每亩100-200kg肥料进行施肥；
(6)采收：下地30-40天后即可采收。
前述的灵芝段木栽培方法，所述步骤(5)中，所述肥料按重量份计算，主要由尿素25-35份、氯化铵5-15份、硫酸铵5-15份、磷酸钾1-10份、钼酸铵2-4份、干鸡粪10-20份、干牛粪10-20份、玉米秆10-20份、稻壳5-10份、豆饼10-20份和中药渣10-20份制备而成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述肥料按重量份计算，主要由尿素28-32份、氯化铵8-12份、硫酸铵8-12份、磷酸钾4-7份、钼酸铵2-4份、干鸡粪13-17份、干牛粪13-17份、玉米秆13-17份、稻壳6-8份、豆饼13-17份和中药渣13-17份制备而成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述肥料按重量份计算，主要由尿素30份、氯化铵10份、硫酸铵10份、磷酸钾6份、钼酸铵3份、干鸡粪15份、干牛粪15份、玉米秆15份、稻壳7份、豆饼15份和中药渣15份制备而成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述肥料这样制备：取尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸钾、钼酸铵、干鸡粪、干牛粪、玉米秆、稻壳、豆饼和中药渣粉碎成细颗粒后，混匀，造粒，干燥，即得。
前述的灵芝段木栽培方法，所述中药渣按重量份计算，主要由枇杷叶10-20份、百部1-10份、桔梗5-15份、苦参1-10份和黄芪1-10份制成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述中药渣按重量份计算，主要由枇杷叶13-17份、百部3-7份、桔梗8-12份、苦参3-7份和黄芪3-7份制成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述中药渣按重量份计算，主要由枇杷叶15份、百部5份、桔梗10份、苦参5份和黄芪5份制成。
前述的灵芝段木栽培方法，所述中药渣这样制备：枇杷叶、百部、桔梗、苦参和黄芪加3-5倍量沸水，煎煮40-50min后，过滤，取滤渣，干燥，粉碎成细颗粒，即得。
前述的灵芝段木栽培方法，所述中药渣这样制备：枇杷叶、百部、桔梗、苦参和黄芪加4倍量沸水，煎煮45min后，过滤，取滤渣，干燥，粉碎成细颗粒，即得。
申请人灵芝栽培方法进行了大量的研究，部分实验如下：
实验例多糖含量测定
1测定项目：
1.1灵芝1：按实施例1进行栽培，采收得到灵芝1。
1.2灵芝2：栽培方法同实施例1，但所施的肥料种不含中药渣。
2方法
2.1苯酚溶液的配制
精确称量分析纯苯酚晶体5g于250ml，加入蒸馏水60ml，放入50℃水浴中使其溶解，再于100ml容量瓶中定容，即得5％苯酚溶液。苯酚可以被空气氧化，所以苯酚溶液现配现用。
2.2样品多糖提取方法
2.2.1灵芝1样品溶液：取5g赤灵芝1样品，粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。
2.2.1灵芝2样品溶液：取5g赤灵芝2样品，粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。
2.3分光光度法测定多糖含量
2.3.1标准曲线的绘制。精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只。分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml，加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。
2.3.2灵芝1多糖含量测定：取lml灵芝1样品多糖提取液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(％)＝cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。
2.3.3灵芝2多糖含量测定：取lml灵芝2样品多糖提取液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(％)＝cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。
3结果
3.1最大吸收波长的确定
取lml0.05mg/ml葡萄糖标准溶液，加入苯酚溶液和浓硫酸后反应一段时间后。在450-520nm波长区间进行光谱扫描，确定其最大吸收波长，发现在488nm波长处，所得吸光度值最大，无其他杂峰，则最佳测定波长选用488nm。
3.2苯酚溶液用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准液1ml于6支20ml具塞比色管中，分别加入0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml的5％苯酚溶液，再依次加入5ml98％浓硫酸，混合摇匀。放置于20℃温度下显色30分钟，在488nm波长处测定吸光度值。当加入苯酚溶液1.0ml时，吸光度值最大，加入苯酚溶液过多反而会引起吸光度降低，所以实验中5％苯酚溶液的最佳加入量应当为1ml。
3.3浓硫酸用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准溶液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各加入5％苯酚溶液lml，依次滴加浓硫酸4.0ml、4.5ml、5.0ml、5.5m、6.0ml。于488nm波长处测定其吸光度，发现硫酸加入量为5ml时所测得的吸光度值达到最大，加入硫酸过少则反应不够完全。加入硫酸过多可能导致其他副反应，导致测定结果降低，所以最佳硫酸加入量为5ml。
3.4显色温度的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃温度下显色30min，在489nm波长处测定其吸光度。在各温度下，测得的吸光度基本不变，所以温度对反应吸光度基本无影响，在室温下就能够完全反应。
3.5显色时间的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别于室温下显色10min、20min、30min、40min、50min，在488nm波长处测定其吸光度。发现，反应10分钟吸光度值较小，显色时间从20到50分钟，样品溶液的吸光度基本不变，所以反应时间控制在20分钟以上就基本能够反应完全。所以反应时间控制在20分钟以上就能达到最佳效果。
综合以上测定结果，得出苯酚硫酸法最佳测定条件参数：1m样品液，5％苯酚溶液加入量为1ml，98％浓硫,酸加入量为5ml，显色温度室温即可，显色时间为20分钟以上，最大吸收波长为488nm。
3.6标准曲线的绘制
精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只，分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml。加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、00.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速加入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。准确称量葡萄糖0.0520g。标准曲线方程为y＝9.0803x-0.0385，相关系数r值为0.9984，线性较好，线性范围10.5-63.0ug/ml。
3.7重复性试验
采用苯酚硫酸法平行取样品溶液测定5次，得到rsd＝1.18％，说明精密度较高，能满足定量分析的要求。
3.8加标回收率
分别准确移取灵芝1样品溶液和灵芝2样品溶液0.5ml于20ml具塞比色管中，分别准确移取0.005mg/ml、0.010mg/ml、0.015mg/ml的标准溶液，0.5ml加入样液中，测定多糖含量计算平均回收率。平均回收率为97.64％，rsd为1.2％。回收率高，说明此法结果准确率高。
4含量测定结果
分别取灵芝1和灵芝2，平行分成6份，制成灵芝1样品溶液和灵芝2样品溶液，按上述方法进行测定，记录数据，结果取平均值。得到结果见表1。
表1灵芝多糖含量测定结果
由表可知，本发明方法经栽培等工艺得的灵芝中多糖的含量较高。灵芝品质好。
与现有技术相比，本发明方法栽培后得到的灵芝的品质好，灵芝中的有效成分多糖含量高。
具体实施方式
实施例1。
中药渣原料：枇杷叶150kg、百部50kg、桔梗100kg、苦参50kg和黄芪50kg。
中药渣的制备：枇杷叶、百部、桔梗、苦参和黄芪加4倍量沸水，煎煮45min后，过滤，取滤渣，干燥，粉碎成细颗粒，即得。
肥料原料：尿素300kg、氯化铵100kg、硫酸铵100kg、磷酸钾60kg、钼酸铵30kg、干鸡粪150kg、干牛粪150kg、玉米秆150kg、稻壳70kg、豆饼150kg和中药渣150kg。
肥料的制备：取尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸钾、钼酸铵、干鸡粪、干牛粪、玉米秆、稻壳、豆饼和中药渣粉碎成细颗粒后，混匀，造粒，干燥，即得。
灵芝段木栽培方法：包括以下步骤：
(1)菌材处理：选择柞树、枫树、椴树、榆树、千金榆或胡桃楸，截成段，每段长12-17cm，将截成段的段木于90-100℃的蒸汽下灭菌12-14h后，装入聚乙烯袋中，每袋装1段，用绳系紧；
(2)接种：无菌状态下，将栽培种按每平方米750毫升菌种量接入段木中，接种时间为3月份；
(3)培育菌丝：接好种的段木菌袋要放在温度为25-30℃，湿度为55-65％条件下培养20天后，对聚乙烯袋刺孔，继续培养50天，即得菌丝；
(4)入畦：去掉聚乙烯袋，取出培育有菌丝的段木，置于畦中，畦深10-12cm，宽1.2-1.5m，长1.5-2.0m，段木之间间隔10-12cm，空隙填满潮湿的细土，然后再覆1-2厘米厚的沙子；
(5)出芝管理：采用干湿管理法，即三天湿，即空气湿度95％以上，一天偏干，以土壤表面泥土稍发白为准，每隔15天按每亩150kg肥料进行施肥；
(6)采收：下地35天后即可采收。
实施例2.
中药渣原料：枇杷叶200kg、百部100kg、桔梗150kg、苦参100kg和黄芪100kg。
中药渣的制备：枇杷叶、百部、桔梗、苦参和黄芪加5倍量沸水，煎煮50min后，过滤，取滤渣，干燥，粉碎成细颗粒，即得。
肥料原料：尿素350kg、氯化铵150kg、硫酸铵150kg、磷酸钾100kg、钼酸铵40kg、干鸡粪200kg、干牛粪200kg、玉米秆200kg、稻壳100kg、豆饼200kg和中药渣200kg。
肥料的制备：取尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸钾、钼酸铵、干鸡粪、干牛粪、玉米秆、稻壳、豆饼和中药渣粉碎成细颗粒后，混匀，造粒，干燥，即得。
灵芝段木栽培方法：包括以下步骤：
(1)菌材处理：选择柞树、枫树、椴树、榆树、千金榆或胡桃楸，截成段，每段长12-17cm，将截成段的段木于90-100℃的蒸汽下灭菌12-14h后，装入聚乙烯袋中，每袋装1段，用绳系紧；
(2)接种：无菌状态下，将栽培种按每平方米750毫升菌种量接入段木中，接种时间为3月份；
(3)培育菌丝：接好种的段木菌袋要放在温度为25-30℃，湿度为55-65％条件下培养22天后，对聚乙烯袋刺孔，继续培养52天，即得菌丝；
(4)入畦：去掉聚乙烯袋，取出培育有菌丝的段木，置于畦中，畦深10-12cm，宽1.2-1.5m，长1.5-2.0m，段木之间间隔10-12cm，空隙填满潮湿的细土，然后再覆1-2厘米厚的沙子；
(5)出芝管理：采用干湿管理法，即三天湿，即空气湿度95％以上，一天偏干，以土壤表面泥土稍发白为准，每隔20天按每亩100-200kg肥料进行施肥；
(6)采收：下地40天后即可采收。
实施例3.
中药渣原料：枇杷叶100kg、百部10kg、桔梗50kg、苦参10kg和黄芪10kg。
中药渣的制备：枇杷叶、百部、桔梗、苦参和黄芪加3倍量沸水，煎煮40min后，过滤，取滤渣，干燥，粉碎成细颗粒，即得。
肥料原料：尿素250kg、氯化铵50kg、硫酸铵50kg、磷酸钾10kg、钼酸铵20kg、干鸡粪100kg、干牛粪100kg、玉米秆100kg、稻壳50kg、豆饼100kg和中药渣100kg。
肥料的制备：取尿素、氯化铵、硫酸铵、磷酸钾、钼酸铵、干鸡粪、干牛粪、玉米秆、稻壳、豆饼和中药渣粉碎成细颗粒后，混匀，造粒，干燥，即得。
灵芝段木栽培方法：包括以下步骤：
(1)菌材处理：选择柞树、枫树、椴树、榆树、千金榆或胡桃楸，截成段，每段长12-17cm，将截成段的段木于90-100℃的蒸汽下灭菌12h后，装入聚乙烯袋中，每袋装1段，用绳系紧；
(2)接种：无菌状态下，将栽培种按每平方米750毫升菌种量接入段木中，接种时间为3月份；
(3)培育菌丝：接好种的段木菌袋要放在温度为25-30℃，湿度为55-65％条件下培养18天后，对聚乙烯袋刺孔，继续培养48天，即得菌丝；
(4)入畦：去掉聚乙烯袋，取出培育有菌丝的段木，置于畦中，畦深10-12cm，宽1.2-1.5m，长1.5-2.0m，段木之间间隔10-12cm，空隙填满潮湿的细土，然后再覆1-2厘米厚的沙子；
(5)出芝管理：采用干湿管理法，即三天湿，即空气湿度95％以上，一天偏干，以土壤表面泥土稍发白为准，每隔10天按每亩100-200kg肥料进行施肥；
(6)采收：下地30天后即可采收。