本发明涉及一种拟滇桂石斛的组织培养方法。
背景技术：
：拟滇桂石斛(始兴石斛)den.nidiangui(den.shixingense)life是近年发现的新品种，在广西浙江以及广东一带亚热带季风性雨林，生于河谷大树干上，河谷湿度极高,从低矮的河边树干到高大大树树冠都有着生，植株10-40cm，叶子绿色略带红色，叶质较滇桂石斛的薄。花期5-7月，花序一般在花茎顶端2、3节抽出，每花茎着1-4朵花，开粉红色花，舌胎紫红，非常漂亮。此花观赏价值极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一，既可作切花，也可盆栽观赏，具有较高的园艺价值。目前，拟滇桂石斛通过苗木组培及设施栽培方式基本实现了产业化设施种植。不过，组织培养快繁虽然在一定程度上加快了拟滇桂石斛繁殖，但是不管采用瓶外生根或者瓶内生根的方法，仍然存在萌发率低及生根率低的问题，而且苗的成活率很低。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种拟滇桂石斛组织培养方法。为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：一种拟滇桂石斛组织培养方法，包括拟滇桂石斛种子培养萌发成原球茎，壮苗培养，诱导生根和炼苗四个步骤，其中，所述拟滇桂石斛种子培养萌发成原球茎中使用的种子培养基包含以下组分：一、种子培养基配方所述壮苗培养中使用的壮苗培养基包含以下组分：二、壮苗培养基配方试剂名称含量(mg/l)试剂名称含量(mg/l)硝酸钾2000硫酸亚铁27.8硝酸铵1750甘氨酸2.0硫酸镁370盐酸硫胺素0.2磷酸二氢钾170盐酸吡哆醇0.65氯化钙550烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇50氯化钴0.025naa1.0-3.0硫酸锰16.96-ba0.5-2.5硫酸锌8.6香蕉200000硼酸6.2碳粉500碘化钾0.83蔗糖30000钼酸钠0.25琼脂4500na2-edta37.3所述诱导生根中使用的生根培养基包含以下组分：三、生根培养基配方试剂名称含量(mg/l)试剂名称含量(mg/l)硝酸钾1650硫酸亚铁27.8硝酸铵1350甘氨酸2.0硫酸镁270盐酸硫胺素0.2磷酸二氢钾130盐酸吡哆醇0.65氯化钙450烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇5氯化钴0.025naa1.0-3.0硫酸锰16.96-ba0.5-2.5硫酸锌8.6香蕉100000硼酸6.2碳粉500碘化钾0.83蔗糖18000钼酸钠0.25艾比蒂生根粉0.1-1.5na2-edta37.3琼脂4500所述种子培养萌发成原球茎步骤中，成熟拟滇桂石斛种子经消毒处理后播种于种子培养基中培养，7-10天转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大并萌发形成绿色原球茎；培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为8-12h/d。所述的消毒处理过程为：拟滇桂石斛种子经自来水加洗洁精冲洗3分钟后用75％酒精消毒30秒，之后用35％双氧水消毒10分钟，然后用无菌水冲洗三次。所述壮苗步骤中，原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，获得高度达到1.5-4cm的幼苗，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为8-12h/d。本发明具有以下优点：1.本发明提供的拟滇桂石斛的组织培养方法，拟滇桂石斛种子萌发率高，在90％以上，获得的幼苗粗壮，主根系发达，种植成活率在90％以上。2.种子培养基对拟滇桂石斛种子的萌发有重要影响，本发明提供的种子培养基可以使拟滇桂石斛种子萌发在90％以上，而且缩短了转绿时间。3.本发明采用的壮苗培养基可以促进原球茎生成粗壮的幼苗。4.本发明采用的生根培养基可以促进幼苗生根，所得的主根系发达，有利于在炼苗及种植中成活。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。实验例一取成熟拟滇桂石斛种子进行消毒处理，先用自来水加洗洁精冲洗3分钟，然后用75％酒精消毒30秒，再用35％双氧水消毒10分钟，最后用无菌水冲洗三次后播种于种子培养基中培养，待转绿后，继续培养20-30天，经过种胚膨大并萌发形成绿色原球茎。培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。本发明采用的种子培养基为在种子改良ms培养基(以下简称为种子改良ms)的基础上添加naa0.5-1.3mg/l、6-ba0.8-2.3mg/l、马铃薯100000mg/l和水解乳蛋白700mg/l构成。其中的种子改良ms培养基包含以下组分：硝酸钾1500mg/l、硝酸铵1350mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、氯化钙440mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁21.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、碳粉250mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂4.5g/l。表4不同种子培养基种子萌发情况种子培养基及组合萌发率％转绿时间(天)ms培养基5515种子改良ms7512种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯8010种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa0.3+6-ba0.38010种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa0.6+6-ba1.2957种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa0.9+6-ba2.3908种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa1.2+6-ba4.84010种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa0.6+6-ba0.3709种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa1.2+6-ba0.6759种子改良ms+水解乳蛋白+马铃薯+naa1.8+6-ba0.9658由表4结果可见，本发明提供的种子培养基较普通ms培养基大大地提高了种子萌发率，而且芽转绿时间也明显缩短，说明本发明的种子培养基与现有ms培养基相比更适合拟滇桂石斛种子的萌发和生长，而且其中，激素组合优选naa0.9mg/l，6-ba2.3mg/l。实验例二拟滇桂石斛原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，进行80-90天壮苗培养，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。本发明采用的壮苗培养基为在壮苗改良ms培养基(以下简称为壮苗改良ms)的基础上添加naa1.0-3.0mg/l、6-ba0.5-2.5mg/l和香蕉200000mg/l构成。其中，壮苗改良ms培养基包含以下组分：硝酸钾2000mg/l、硝酸铵1750mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、氯化钙550mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.65mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇50mg/l、碳粉500mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂4.5g/l。表5不同壮苗培养基壮苗情况从表5中可以看出，培养基中种苗激素浓度过高时会对种苗产生毒害作用，导致部分种苗畸形、生长异常等，当naa浓度过高时种苗虽然长得较快较高，但是比较细弱，如果在继续升高则种苗会出现生长障碍；当6-ba浓度过高种苗发芽率较高，长的侧芽较多，但是种苗太细且弱，继续升高则会造成种苗畸形。只有当种苗处于适合的激素配比的改良培养基中时，种苗才长的壮而且长得快。在本发明中，激素naa和6-ba的配比优选为naa2.0mg/l，6-ba1.0mg/l。实验例三将拟滇桂石斛幼苗转入生根培养基进行诱导生根，长成具有发达主根系的生根苗。本发明采用的生根培养基为在生根改良ms培养基(以下简称为生根改良ms)的基础上添加naa1.0-3.0mg/l、6-ba0.5-2.5mg/l和艾比蒂生根粉0.1-1.5mg/l构成。其中，生根改良ms培养基包含以下组分：硝酸钾1650mg/l、硝酸铵1350mg/l、硫酸镁270mg/l、磷酸二氢钾130mg/l、氯化钙450mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.65mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇5mg/l、香蕉100000mg/l、碳粉500mg/l、蔗糖18000mg/l、琼脂4500mg/l。相对于现有ms培养基，生根改良ms培养基的大量元素、有机添加物、糖等都适量减少，特别是肌醇大幅度减少以促进生根，更加适合拟滇桂石斛生根培育。表6不同生根培养基促进生根情况由表6的结果可见，本发明的生根改良ms能有效地提高幼苗的生根率，添加适量的艾比蒂生根粉能够促进根系生长。由表中可见，当艾比蒂生根粉添加量大于2.0mg/l时，不仅不能促进根系生长，还会使种苗出现畸形甚至是死苗。在本发明中，激素naa和6-ba的添加量分别优选为naa2.0mg/l，6-ba1.0mg/l，艾比蒂生根粉添加量优选为1.5mg/l。实施例1实施例一(1)种子萌发成为原球茎：取成熟拟滇桂石斛种子进行消毒处理，用自来水加洗洁精冲洗3分钟，然后75％酒精消毒30秒，再用35％双氧水消毒10分钟，最后用无菌水冲洗三次后播种于种子培养基中培养，7天转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色原球茎，种子的萌发率在95％以上。培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。种子培养基包含以下组分：硝酸钾1500mg/l、硝酸铵1350mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、氯化钙440mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁21.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、naa0.6mg/l、6-ba1.2mg/l、马铃薯100000mg/l、碳粉250mg/l、蔗糖30000mg/l、水解乳蛋白700mg/l、琼脂4500mg/l。(2)壮苗培养：将步骤(1)中产生的原球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，高度达到3.05cm，1/2苗高处的直径为2.1mm的粗壮幼苗出现，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。壮苗培养基包含以下组分：硝酸钾2000mg/l、硝酸铵1750mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、氯化钙550mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.65mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇50mg/l、naa2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、香蕉200000mg/l、碳粉500mg/l、蔗糖30000mg/l、琼脂4500mg/l。(3)诱导生根：将步骤(2)得到的幼苗转入生根培养基进行诱导生根，长成具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为56.5mm，根系平均直径为1.3mm。生根培养基为：硝酸钾1650mg/l、硝酸铵1350mg/l、硫酸镁270mg/l、磷酸二氢钾130mg/l、氯化钙450mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸锰16.9mg/l、硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、钼酸钠0.25mg/l、na2-edta37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.65mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇5mg/l、naa2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、香蕉100000mg/l、碳粉500mg/l、蔗糖18000mg/l、艾比蒂生根粉1.5mg/l、琼脂4500mg/l。(4)炼苗：将步骤(3)得到的生根苗进行炼苗驯化，使其适应外部生长环境。完成炼苗后，所得驯化苗移栽大棚或室外，同时种植管理，一个月后成活率100％，并且开始发芽。实施例二与实施例一不同的是：种子培育基中的激素含量为naa0.9mg/l、6-ba2.3mg/l，种子萌发率为90％，转绿时间为8天。培苗培养基中的激素含量为naa2.0mg/l、6-ba1.0mg/l，种苗平均高度为3.53cm，1/2苗高处的平均直径为1.6mm。生根培养基中的激素含量为naa2.0mg/l、6-ba1.0mg/l，艾比蒂生根粉含量为1.0mg/l。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为47.3mm，根系平均直径为1.2mm。炼苗移栽后种植一个月的成活率为96％，成活的拟滇桂石斛苗均开始发芽。实施例三与实施例一不同的是：种子培育基中的激素含量为naa0.5mg/l、6-ba0.8mg/l，种子萌发率为90％，转绿时间为7天。培苗培养基中的激素含量为naa1.0mg/l、6-ba0.5mg/l，种苗平均高度为2.80cm，1/2苗高处的平均直径为2.0mm。生根培养基中的激素含量为naa1.0mg/l、6-ba0.5mg/l，艾比蒂生根粉含量为1.0mg/l。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为35.6mm，根系平均直径为1.2mm。炼苗移栽后种植一个月的成活率为98％，成活的拟滇桂石斛苗均开始发芽。实施例四与实施例一不同的是：种子培育基中的激素含量为naa1.0mg/l、6-ba1.8mg/l，种子萌发率为90％，转绿时间为7天。培苗培养基中的激素含量为naa3.0mg/l、6-ba1.5mg/l，种苗平均高度为2.91cm，1/2苗高处的平均直径为1.8mm。生根培养基中的激素含量为naa3.0mg/l、6-ba1.5mg/l，艾比蒂生根粉含量为1.0mg/l。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为34.8mm，根系平均直径为1.5mm。炼苗移栽后种植一个月的成活率为98％，成活的拟滇桂石斛苗均开始发芽。实施例五与实施例一不同的是：种子培育基中的激素含量为naa0.8mg/l、6-ba1.0mg/l，种子萌发率为92％，转绿时间为7天。培苗培养基中的激素含量为naa2.5mg/l、6-ba2.0mg/l，种苗平均高度为3.05cm，1/2苗高处的平均直径为2.0mm。生根培养基中的激素含量为naa2.5mg/l、6-ba2.0mg/l，艾比蒂生根粉含量为0.8mg/l。获得具有3条主根系的生根苗，根到底平均长度为35.6mm，根系平均直径为1.8mm。炼苗移栽后种植一个月的成活率为98％，成活的拟滇桂石斛苗均开始发芽。当前第1页12