本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种余甘子组织培养的方法。
背景技术：
余甘子(phyllanthusemblical.)为大戟科(euphorbiaceae)，叶下珠属(phyllanthus)，落叶小乔木或灌木。在我国主要分布于南亚热带地区。余甘子果可生食、渍制或榨取果汁，果具清热解毒、降血压、防治肝胆病、收敛止泻作用，是重要的中药材和制药原料，同时树皮为重要的栲胶原料。余甘子在干热河谷、石质山地等生态脆弱区已作为优良的生态经济兼用造林树种。
我国余甘子良种化起步晚，虽然只有少数地区开始采用良种，但发展势头很快。近几年引进的国外品种已表现出较好的适应性和生长特性。进行品种苗的无性繁殖，是果用品种生产的最好方法。目前，余甘子良种苗木多采用嫁接方法进行无性繁殖，扦插等无性繁殖方法并没有成功。余甘子离体繁殖的研究国内外甚少，仅限于印度sehgal-cb对余甘子胚乳再生三倍体植株的研究。采用对余甘子进行组织培养的方法，可以缩短育种周期，加速优良品种的繁殖和培育。然而，组织培养的余甘子生根率低仍是阻碍余甘子大量繁殖所面临的技术问题。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种余甘子组织培养的方法，提高余甘子的生根率，缩短培育时间，提高繁殖系数。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种余甘子组织培养的方法，包括以下步骤：
(1)将余甘子半木质化枝条插入诱导培养基上进行诱导培养，得到丛生芽；
(2)将步骤(1)得到的丛生芽分割成带有一个侧芽的芽段，每个芽段分别接种于增殖培养基中增殖培养进行增殖培养，得到丛生不定芽；
(3)从步骤(2)得到的丛生不定芽中分离单个不定芽，接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗；
所述生根培养基以1/2ms培养基为基准，包括naa0.2～0.8mg/l，kt0.1～0.6mg/l，含铈可溶性化合物0.1～0.2mm，琼脂8～11g/l和蔗糖25～35g/l；
(4)将步骤(3)得到的生根苗炼苗后移栽，得到余甘子组培苗。
优选的，所述余甘子半木质化枝条的长度为3～4cm。
优选的，步骤(1)中，所述诱导培养基以ms培养基为基准，包括6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/l、蔗糖25～35g/l、卡拉胶6.5～7.5g/l和聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l。
优选的，步骤(2)中，所述增殖培养基以ms培养基为基准，包括6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/l、萘乙酸0.005～0.02mg/l、蔗糖25～35g/l和卡拉胶6.5～7.5g/l。
优选的，所述含铈可溶性化合物包括硝酸铈、氯化铈或氧化铈。
优选的，所述余甘子组织培养的条件为：培养温度20～30℃、湿度50～60％、光照时间12～16h/d、光照强度为1500～30001x。
优选的，所述生根培养的时间为15～25d。
优选的，步骤(4)中，所述移栽为将带有生根培养基的生根苗一同移栽至育苗基质中。
优选的，所述育苗基质为体积比包括3∶1～1.5∶0.5～1的营养土、蛭石和河沙。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种余甘子组织培养的方法，将余甘子半木质化枝条作为外植体，依次进行诱导培养、增殖培养和生根培养，得到的生根苗经炼苗移栽后，得到余甘子组培苗。本发明的生根培养基以ms培养基为基准，包括naa0.2～0.8mg/l，kt0.1～0.6mg/l，含铈可溶性化合物0.1～0.2mm，琼脂8～11g/l和蔗糖25～35g/l。本发明的生根培养基中含有萘乙酸、激动素及含铈可溶性化合物，将上述三种物质进行合理配比，促进芽苗根系的形成和生长，生根率能够达到80％～85％，有效的解决了生产中余甘子组培繁殖过程中生根率低的限制。本发明所述余甘子组织培养的方法成本低、繁殖时间短、增殖系数高，为余甘子生产繁殖和规模化种植提供了技术保障，克服了余甘子生根难、繁殖系数低的问题。
具体实施方式
本发明提供了一种余甘子组织培养的方法，包括以下步骤：
(1)将余甘子半木质化枝条插入诱导培养基上进行诱导培养，得到丛生芽；
(2)将步骤(1)得到的丛生芽分割成带有一个侧芽的芽段，每个芽段分别接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到丛生不定芽；
(3)从步骤(2)得到的丛生不定芽中分离单个不定芽，接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗；
所述生根培养基以1/2ms培养基为基准，包括naa0.2～0.8mg/l，kt0.1～0.6mg/l，含铈可溶性化合物0.1～0.2mm，琼脂8～11g/l和蔗糖25～35g/l；
(4)将步骤(3)得到的生根苗炼苗后移栽，得到余甘子组培苗。
本发明中，余甘子外植体优选为余甘子优良资源。本发明实施例中的余甘子外植体采集的是野外资源。采集余甘子植株中上部的半木质化枝条，除去叶片后，作为本发明组织培养的外植体。
将采集的外植体进行组织培养，培育余甘子组培苗。
本发明中，采集的外植体先进行预处理。预处理采用中性洗衣粉和吐温-80的混合液浸泡振荡，除去外部污物。本发明对中性洗衣粉与吐温-80的混合比例没有特殊限制，采用本领域的常规比例即可。优选吐温-80的添加量为中性洗衣粉用量的20～35％。优选浸泡振荡的时间为3～5min。将浸泡后的外植体用清水冲洗。优选清水冲洗的时间为20～30min。
将预处理后的外植体进行消毒灭菌。
本发明中，进行消毒灭菌的半木质化枝条的长度优选为3～4cm，更优选为3.5cm。
本发明中，外植体依次用75％酒精和0.5％次氯酸钠溶液进行消毒灭菌。其中，外植体用75％酒精溶液浸泡的时间优选为20s～1min，更优选为30s。酒精浸泡后取出，用无菌水冲洗。本发明中优选用无菌水冲洗2～3次。将冲洗后的外植体再用0.5％次氯酸钠溶液浸泡，浸泡的同时轻微震荡。本发明中，优选0.5％次氯酸钠溶液浸泡的时间为10～15min，更优选为12～14min。取出外植体材料用无菌水冲洗，优选无菌水冲洗3～5次，更优选为4次。用无菌试纸吸去侧枝上多余的水分后，进行组织培养。
本发明的组织培养过程包括不定芽的诱导，芽的增殖培养和芽的生根培养。
本发明的组织培养优选在培养瓶中进行。本发明对培养瓶的材质没有特殊限定，透明培养瓶均能够应用于本发明中。本发明优选采用玻璃培养瓶。本发明对培养瓶的大小没有特殊限定。在本发明具体实施例中，采用培养瓶的容积为240ml，高90mm，口径62mm。本领域技术人员可以根据材料来源选择合适的培养瓶进行余甘子的组织培养。
本发明中，将灭菌后的外植体插入装有无菌诱导培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，诱导培养基的配方为ms+6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉胶6.5～7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8～15mg/l，优选为ms+6-苄氨基腺嘌呤0.6～0.8mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l。此配方的主要特点是，在ms培养基的基础上只添加细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤，不添加生长素，以充分诱导芽的分化和形成，同时添加聚乙烯吡咯烷酮，抑制余甘子外植体材料酚类物质的分泌，预防外植体材料的褐化过程。采用此配方得到的外植体材料芽的诱导率为1～5倍。本发明在不定芽的诱导过程中，优选插入的外植体长度为3.0～3.5cm，每个培养瓶优选接种1～2段外植体材料。将培养瓶加盖密封后放于培养室中培养，获得丛生芽。
本发明中，将得到的丛生芽切割成带有一个侧芽的芽段后，接种到装有无菌增殖培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，增殖培养基的配方为ms+6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.2mg/l+萘乙酸0.005～0.02mg/l+蔗糖25～35g/l+卡拉胶6.5～7.5g/l，优选为ms+6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l+萘乙酸0.01mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7g/l。本发明余甘子的组织培养，以快速出苗为目的，所以此配方主要是促进芽的高生长，配方中细胞分裂素含量较低，同时添加了生长素，经实验对比后以细胞分裂素∶生长素＝10∶1的效果最好，芽的增殖倍数为1～2倍，高生长明显。本发明中，优选芽段的长度为1.5～2.5cm，更优选为2.0cm，每个培养瓶中优选接种10～12个芽段。加盖密封后放于培养室中培养。
本发明中，将增殖培养的丛生芽中分离单个不定芽，接种于生根培养基上生根培养。所述不定芽为长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的余甘子芽。剪取不定芽带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的培养瓶中进行培养。本发明中，生根培养基的组成包括1/2ms培养基+naa0.2～0.8mg/l+kt(激动素)0.1～0.6mg/l+含铈可溶性化合物0.1～0.2mm+琼脂8～11g/l+蔗糖25～35g/l，优选为1/2ms培养基+naa0.4～0.6mg/l+kt(激动素)0.3～0.5mg/l+含铈可溶性化合物0.1～0.2mm+琼脂9～10g/l+蔗糖28～32g/l。本发明中，所述的含铈可溶性化合物是硝酸铈，还可以是氧化铈或氯化铈，稀土元素铈能调节细胞内酶的活性，促进细胞合成生物碱，调节细胞生长和分化，促进余甘子芽苗生根。本发明的生根培养基中含有萘乙酸、激动素及含铈可溶性化合物，将上述三种物质进行合理配比，促进芽苗根系的形成和生长，生根率达到80％～85％。本发明中，优选每个培养瓶接种10～12个芽，加盖密封后放于培养室中培养。
本发明的组织培养过程中，对培养基的配制方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的培养基配制方法进行配制。本发明对诱导培养基中所用的原料来源没有特殊限定，均为本领域技术人员所熟知的组织培养原料，采用市售商品即可。
本发明将余甘子组织培养的培养瓶置于无菌培养室中培养。本发明中，优选组织培养的温度控制在20～30℃，更优选为23～27℃，相对湿度为50％～60％，优选为53％～57％；光照强度为1500lx～3000lx，优选为2000lx～2500lx；光照时间为每天12～16h，更优选为13～14h。
生根培养15～25天的苗木，会在基部形成肿胀的愈伤组织或者根系呈“露白”状，为生根苗。
将生根苗进行炼苗处理。优选炼苗在塑料大棚中进行。炼苗过程采用自然光照和湿度，温度控制在25～30℃，更优选为26～28℃。炼苗过程中，为了使每瓶苗都有自然光照射，优选将培养瓶单层摆放。当培养瓶中的苗根系长至1.0～1.5cm时，在培养瓶中注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗2～5天，优选为3～4天后进行苗木移栽。
将炼苗后的生根苗进行移栽。优选先将生根苗连同生根培养基一同移栽至育苗袋中进行生长，避免移栽过程中对生根苗根部的破坏。同时生根培养基还有助于生根苗在育苗袋中继续进行生根生长。再将移栽成活的余甘子苗移栽至圃地中。
本发明中，将炼苗后的生根苗移栽至育苗袋中。优选将带有生根培养基的生根苗一同移栽入装有育苗基质的育苗袋中。本发明中，育苗基质选择适合于余甘子生长的育苗基质，优选包括营养土、蛭石和河沙，其体积比优选为3∶1～1.5∶0.5～1。如遇晴天，移栽应在下午4：00后进行，阴雨天可全天移栽，清洗后的苗木要在当天全部移栽完。苗木移栽后可加盖薄膜和75％荫网，移栽第一个星期内，余甘子苗生长环境湿度保持在90％左右，第二个星期后湿度保持在75％～85％左右，一个月后可撤掉薄膜只保留荫网，此时余甘子可按常规育苗措施进行管护。
采用本发明提供的余甘子组织培养的方法可以提高组织培养过程中余甘子的生根率至80～85％，有效的解决了生产中余甘子组培繁殖过程中生根率低的限制。本发明所述余甘子组织培养的方法成本低、繁殖时间短、增殖系数高，为余甘子生产繁殖和规模化种植提供了技术保障，克服了余甘子生根难、繁殖系数低的问题。
下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
野外采集余甘子中上部侧枝，适当修剪枝条，保留带顶梢部分，枝条长度10～15cm，用干净的湿毛巾包好，放入塑料封口袋中，然后放入带冰块的泡沫箱里，要求冰块不能直接接触芽条，箱内温度控制在4℃～10℃，于采集当天把材料带回实验室及时处理。
在实验室内，把野外采集回来的枝条去除所有叶片，放入容积为2l的干净量杯中，加入小半勺中性洗衣粉和2滴吐温-80浸泡并震荡3min，然后置于流水下冲洗25min，取出材料，剪除已经木质化的部分，保留半木质化枝条，放入超净工作台上干净碟子中备用。
在超净工作台上，把预处理后的材料截成3.5cm长的小段，然后用75％酒精溶液浸泡加震荡30s，用干净的镊子取出材料，无菌水冲洗2次，再放入0.5％次氯酸钠溶液中浸泡加轻微震荡10min，取出材料用无菌水冲洗3次，然后用无菌试纸吸去侧枝上多余的水分，放入干净碟子中备用。
在超净工作台上，采用干净的器械，把已经灭菌消毒处理过的材料两端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段长度为3.5cm，然后插入装有无菌诱导培养基的玻璃培养瓶中，诱导培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.8mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7g/l+聚乙烯吡咯烷酮10mg/l，培养瓶的容积为240ml、高90mm、口径62mm，每瓶接种1段材料，加盖塑料密封盖后，置于培养室中培养。
在超净工作台上，选择上述培养获得的无菌不定芽作为增殖培养的材料，对长度超过4cm的芽，切割为约2.0cm长的芽段，然后接种到装有无菌增殖培养基的玻璃培养瓶中，培养瓶规格同上，培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l+萘乙酸0.01mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7g/l，每瓶接种10～12个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
在超净工作台上，对培养获得的有效芽进行生根培养，选取长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的芽，剪取带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的玻璃培养瓶中，培养基的组成包括1/2ms培养基+naa0.5mg/l+kt0.4mg/l+氯化铈0.1mm+琼脂10g/l+蔗糖30g/l，每瓶接种10～12个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
当苗木根系呈“露白”状时，把培养瓶转入塑料大棚内进行炼苗处理；大棚采用自然光照和湿度，温度控制在25℃左右；单层摆放培养瓶，使每瓶苗都有自然光照射。苗木根系长至1.0～1.5cm，打开瓶盖，注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗5天后可进行苗木移栽。
把开盖炼苗后的生根苗连同生根培养基一同从瓶中取出，移栽入装有育苗基质的塑料育苗袋中，育苗基质为体积比为3∶1∶0.5的营养土、蛭石和河沙。淋透水后遮盖塑料薄膜以保持苗床的湿度和温度；移栽第一个星期内，保持苗木生长环境湿度在90％左右，第二个星期后湿度保持在75～85％左右；20天后撤掉覆盖的薄膜，此后苗木可按常规育苗措施进行管护。本发明余甘子组织培养中，不定芽的生根率为83.2％，移栽成活率为87.6％。
对比例1
生根培养基的组成包括1/2ms培养基+naa0.5mg/l+琼脂10g/l+蔗糖30g/l，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
生根培养基的组成包括1/2ms培养基+iba0.5mg/l+琼脂10g/l+蔗糖30g/l，其他步骤与实施例1相同。
发现naa处理的幼苗在基部只形成大量的愈伤组织，无不定根的分化。iba处理的幼苗基部也形成大量的愈伤组织，在愈伤组织表面分化形成一些不定根，生根率低于20％。
由实施例1与对比例1～2可以看出，本发明的余甘子组培方法能够有效的提高余甘子的生根率，提高繁殖效率。
实施例2
野外采集余甘子中上部半木质化侧枝，采用实施例1的方法对采集的余甘子侧枝进行预处理后，作为组织培养的外植体进行组织培养。
在超净工作台上，采用干净的器械，把已经灭菌消毒处理过的余甘子半木质化侧枝两端各截去0.5cm，使保留的材料每段长度为3cm，插入装有无菌诱导培养基的玻璃培养瓶中，诱导培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/l+蔗糖25g/l+卡拉胶6.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮8mg/l，培养瓶的容积为240ml、高90mm、口径62mm，每瓶接种1段材料，加盖塑料密封盖后，置于培养室中培养。
在超净工作台上，选择上述培养获得的无菌不定芽作为增殖培养的材料，对长度超过4cm的芽，切割为约2.0cm长的芽段，然后接种到装有无菌增殖培养基的玻璃培养瓶中，培养瓶规格同上，培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/l+萘乙酸0.005mg/l+蔗糖25g/l+卡拉胶6.5g/l，每瓶接种10个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
在超净工作台上，对培养获得的有效芽进行生根培养，选取长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的芽，剪取带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的玻璃培养瓶中，培养基的组成包括1/2ms培养基+naa0.2mg/l+kt0.1mg/l+氯化铈0.2mm+琼脂8g/l+蔗糖25g/l，每瓶接种10个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
当苗木根系呈“露白”状时，把培养瓶转入塑料大棚内进行炼苗处理；大棚采用自然光照和湿度，温度控制在27℃左右；单层摆放培养瓶，使每瓶苗都有自然光照射。苗木根系长至1.0～1.5cm，打开瓶盖，注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗5天后可进行苗木移栽。
把开盖炼苗后的生根苗连同生根培养基一同从瓶中取出，移栽入装有育苗基质的塑料育苗袋中，育苗基质为体积比为3∶1∶1的营养土、蛭石和河沙。淋透水后遮盖塑料薄膜以保持苗床的湿度和温度；移栽第一个星期内，保持苗木生长环境湿度在90％左右，第二个星期后湿度保持在75～85％左右；20天后撤掉覆盖的薄膜，此后苗木可按常规育苗措施进行管护。本发明余甘子组织培养中，不定芽的生根率为80.4％，移栽成活率为85.3％。
实施例3
野外采集余甘子中上部半木质化侧枝，采用实施例1的方法对采集的余甘子侧枝进行预处理后，作为组织培养的外植体进行组织培养。
在超净工作台上，采用干净的器械，把已经灭菌消毒处理过的材料两端各截去0.5cm左右，使保留的材料每段长度为4cm，然后插入装有无菌诱导培养基的玻璃培养瓶中，诱导培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/l+蔗糖35g/l+卡拉胶7.5g/l+聚乙烯吡咯烷酮15mg/l，培养瓶的容积为240ml、高90mm、口径62mm，每瓶接种1段材料，加盖塑料密封盖后，置于培养室中培养。
在超净工作台上，选择上述培养获得的无菌不定芽作为增殖培养的材料，对长度超过4cm的芽，切割为约2.0cm长的芽段，然后接种到装有无菌增殖培养基的玻璃培养瓶中，培养瓶规格同上，培养基的组成包括ms培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/l+萘乙酸0.02mg/l+蔗糖35g/l+卡拉胶7.5g/l，每瓶接种10个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
在超净工作台上，对培养获得的有效芽进行生根培养，选取长度超过3cm、生长健壮、叶色浓绿的芽，剪取带顶梢部分，插入装好无菌生根培养基的玻璃培养瓶中，培养基的组成包括1/2ms培养基+naa0.8mg/l+kt0.6mg/l+氯化铈0.2mm+琼脂11g/l+蔗糖35g/l，每瓶接种10个芽，加盖塑料密封盖后放于培养室中培养。
当苗木根系呈“露白”状时，把培养瓶转入塑料大棚内进行炼苗处理；大棚采用自然光照和湿度，温度控制在22℃左右；单层摆放培养瓶，使每瓶苗都有自然光照射。苗木根系长至1.0～1.5cm，打开瓶盖，注入清水，使水面超过培养基表面0.5～1.0cm，开盖炼苗5天后可进行苗木移栽。
把开盖炼苗后的生根苗连同生根培养基一同从瓶中取出，移栽入装有育苗基质的塑料育苗袋中，育苗基质为体积比为3∶1∶0.5的营养土、蛭石和河沙。淋透水后遮盖塑料薄膜以保持苗床的湿度和温度；移栽第一个星期内，保持苗木生长环境湿度在90％左右，第二个星期后湿度保持在75～85％左右；20天后撤掉覆盖的薄膜，此后苗木可按常规育苗措施进行管护。本发明余甘子组织培养中，不定芽的生根率为81.7％，移栽成活率为85.6％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。