技术领域：
：本发明属于天然产物领域，具体涉及亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a及其制备方法和在海洋污损生物防除中的应用。
背景技术：
：：海洋污损生物是指固着或栖息在船舶和人工设施水下部位，对人类经济活动产生不利影响的各类生物，其危害主要为增大阻力，降低航速，增加燃料消耗；堵塞管道系统，改变金属腐蚀过程，引发腐蚀穿孔；增大动力载荷效应，造成人造设施漂移、失衡甚至倾覆；与养殖对象争夺附着基和饵料，妨碍其生长发育，降低水产品品质。因此，在发展海洋经济产业的过程中，海洋污损生物防除始终是不可或缺的一个重要部分。海洋污损生物由动物、植物和微生物组成，其中危害较大且难以清除的种类主要是具石灰质外壳、营固着生活的无柄蔓足类(藤壶)和双壳类软体动物(贻贝和牡蛎)。在热带、亚热带沿岸海域，网纹藤壶是无柄蔓足类的典型代表，也是污损生物群落中的绝对优势种；翡翠股贻贝则是东海和南海主要的双壳类软体动物。污损生物通常分为两个生活阶段，从幼虫脱出卵膜发育至时断时续地探索物体表面准备附着为止，为浮游生活阶段；幼虫选好定居位置，在附着基表面附着、变态形成幼体后，则为固着或附着生活阶段。从防除角度来看，其对人类产生危害始于固着或附着以后。如能有效地抑制幼虫附着，就能达到防除目的。因此，本发明的验证试验采用网纹藤壶和翡翠股贻贝作为实验对象，所获得的研究成果将具有科学合理性和广泛的代表性。传统海洋污损生物防除技术具有成本高，作用时间短，目标生物针对性差等缺陷，甚至还会产生危害环境的问题，因此，弄清海洋生物天然化学防污作用机制可为开发无公害防污技术提供借鉴，而且海洋生物本身也应是新型防污剂的重要来源。基于抗附着活性物质在海洋动物、微生物体内的含量比较少，且结构相对复杂，不便于深入开发和广泛应用。故而从分布广泛、资源量大的海洋植物中寻找天然防污剂，不仅是一种全新的尝试，而且具有重要的理论和现实意义。亨氏马尾藻(sargassumhenslowianumc.agardh)隶属于褐藻门、褐藻纲、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属，广泛分布于福建、广东和香港等地沿海低潮带岩石上。其藻体大，资源丰富，生长周期短，可规模化养殖，具备开发利用的良好前景，近来人们已发现其含有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗氧化和清除自由基等生物活性的成分。然而，对于亨氏马尾藻是否含有抗海洋污损生物幼虫附着和孢子萌发的有效成分以及能否将其应用于海洋污损生物防除领域等方面的内容，目前未见任何报道。技术实现要素：：本发明的目的是提供亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a及其制备方法和在海洋污损生物防除中的应用。本发明的第一个目的是提供一种亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a的制备方法，包括以下步骤：将亨氏马尾藻用乙醇水溶液提取，乙醇提取液经浓缩后得到膏状提取物；膏状提取物依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经浓缩干燥后得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为洗脱剂，从石油醚-丙酮体积比100:0，50:1进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比50:1洗脱的组分fr.1，再经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为洗脱剂，从体积比100:1，50:1，20:1，10:1进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比10:1洗脱的组分，得到亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a。所述的乙醇水溶液优选为体积分数95％乙醇水溶液。本发明的第二个目的是提供一种按照上述的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a的制备方法制备得到的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a。本发明的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在涂覆量为10μg/cm2时，藤壶幼虫72小时后的附着率为30.4％，显著低于对照组的73.1％，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a对藤壶幼虫产生明显的抑制作用。在亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a涂覆量为10μg/cm2时，贻贝幼虫72小时后的附着率仅为4.2％，远远低于对照组，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a能有效地抑制贻贝幼虫的附着。由此可见亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a对无柄蔓足类和双壳类软体动物的幼虫附着有很好的抑制作用。因此，本发明的第三个目的是提供亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在海洋污损生物防除中的应用。所述的海洋污损生物优选为无柄蔓足类和双壳类软体动物。所述的无柄蔓足类优选为网纹藤壶，所述的双壳类软体动物优选为翡翠股贻贝。优选，所述的应用是将亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a涂覆于固体表面，涂覆量为10μg/cm2以上。本发明的第四个目的是提供亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在制备海洋污损生物防除剂中的应用。所述的海洋污损生物防除剂优选为藤壶幼虫防除剂或者贻贝幼虫防除剂。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a低剂量涂覆于固体表面时，即有明显的抑制海洋生物附着的作用，因此能够用于制备海洋污损生物防除剂。并且亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a为天然存在的有机化合物，不会污染水体环境和通过食物链传递导致其在生物体中的富集，对环境友好，安全性高，在有效抑制海洋生物附着的同时，不含铜和锡等重金属元素，从环境保护角度而言具有良好的社会效益，并且亨氏马尾藻来源十分广泛，亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a分离制备途径简便，适合于大规模生产，推广潜力大，在海洋污损生物防除中具有良好的应用前景。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a是从亨氏马尾藻中提取获得，其分离提取步骤包括：(1)将亨氏马尾藻(sargassumhenslowianumc.agardh)用体积分数95％乙醇水溶液提取3次，得到乙醇提取液，45℃真空旋转蒸发浓缩，去除乙醇，得到膏状提取物；(2)膏状提取物以每克6毫升的比例加水重悬，先用等体积的石油醚分别萃取3次，弃去石油醚萃取组分，剩余水层用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得到乙酸乙酯萃取物；(3)将乙酸乙酯萃取物于常压硅胶柱(硅胶8000g，柱长180cm，柱直径20cm)中进行层析分离，以石油醚-丙酮和氯仿-甲醇为洗脱剂，从石油醚-丙酮体积比100:0，50:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，1:2和氯仿-甲醇体积比5:1，3:1，1:1，0:100进行梯度洗脱，采用薄层层析tlc进行跟踪检测，合并相似组分后得到25个组分，并编号为fr.1-25；(4)石油醚：丙酮体积比50:1洗脱的组分fr.1于常压硅胶柱(硅胶250g，柱长60cm，柱直径4cm)中进行硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮为洗脱剂，从体积比100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:100进行梯度洗脱，采用薄层层析tlc进行跟踪检测，合并相似组分，其中石油醚：丙酮体积比10:1洗脱得到组分经浓缩干燥后即为亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a。实施例2：实验组：将亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a用氯仿甲醇混合溶剂(氯仿甲醇混合溶剂是由氯仿和甲醇按体积比3:1混合而成)溶解，配制浓度为282.6μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1ml282.6μg/ml的溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a的剂量为10μg/cm2。然后在培养皿内加入13ml海水。对照组：加1ml氯仿甲醇混合溶剂(氯仿甲醇混合溶剂是由氯仿和甲醇按体积比3:1混合而成)，使其均匀分布于培养皿底部，待挥发完全再加入13ml海水。空白组：加入13ml海水到培养皿内。实验组、空白组和对照组各设4个平行样。于各样品中分别加入30只网纹藤壶金星幼虫。置于温度为30℃左右的恒温培养箱内于黑暗环境中培养。每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。表1列出了实验组、对照组和空白组金星幼虫的附着和死亡率。可见，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率为70.9％，对照组73.1％，空白组和对照组金星幼虫的附着率无显著差异(p>0.05)，表明氯仿甲醇混合溶剂挥发后不会遗留影响金星幼虫活性的有害物质。至于培养皿底部覆盖亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a的实验组，其金星幼虫的附着率为30.4％，小于对照组，且差异显著(p<0.05)，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在10μg/cm2的剂量下能有效地抑制网纹藤壶金星幼虫的附着。另外，空白组、对照组和实验组的幼虫死亡率均为0，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在该剂量不会对幼虫产生毒杀作用。表1：网纹藤壶金星幼虫72小时后的附着和死亡状况组别测试剂量附着率(％)死亡率(％)空白组－70.90对照组－73.10实验组10μg/cm230.40实施例3：实验组：将亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a用氯仿甲醇混合溶剂(氯仿甲醇混合溶剂是由氯仿和甲醇按体积比3:1混合而成)溶解，配制浓度为282.6μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1ml282.6μg/ml的溶液并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a剂量为10μg/cm2。然后再加入13ml海水。对照组：加1ml氯仿甲醇混合溶剂(氯仿甲醇混合溶剂是由氯仿和甲醇按体积比3:1混合而成)，使溶剂均匀分布于培养皿底部，待溶剂挥发完全，再加入13ml海水。空白组：在培养皿内加入13ml海水。实验组、空白组和对照组均设4个平行样，在各样品中加入约30个翡翠股贻贝面盘幼虫。在温度约为26℃的培养箱中于黑暗环境下培养。每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。表2列出了实验组、对照组和空白组翡翠贻贝幼虫的附着和死亡率。可见，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率约为47.7％，对照组约45.6％，空白组和对照组面盘幼虫的附着率无显著差异(p>0.05)，表明氯仿甲醇混合溶剂挥发后不会遗留影响面盘幼虫活性的有害物质。而经亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a处理的实验组，其幼虫的附着率仅为4.2％，远低于对照组，差异极其显著(p<0.01)，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a能有效地抑制翡翠贻贝幼虫的附着。另外，空白组、对照组和实验组的幼虫死亡率均为0，表明亨氏马尾藻乙酸乙酯萃取物分离组分a在该剂量不会对幼虫产生毒杀作用。表2：翡翠股贻贝面盘幼虫72小时后的附着和死亡状况组别测试剂量附着率％死亡率％空白组－47.70对照组－45.60实验组10μg/cm24.20当前第1页12