本发明涉及经济甲壳类分子标记辅助育种技术，具体的说是对具有抱卵习性的虾蟹进行活体无损取样的方法及应用。
背景技术：
经济甲壳类的生长通过蜕皮进行，克氏原螯虾一生蜕皮（脱壳）次数达20次以上，在甲壳类中很难运用类似与鱼类的物理的体表标记方法，家系选育在大多数经济甲壳类中很难进行甚至还无法进行，目前经济甲壳类的选育主要通过群体选择育种的方法。传统的选择育种在生长性状方面选育具有优势，但对繁殖、抗病等性状由于遗传力低，选择育种效率很低。针对繁殖、抗病等遗传力低的性状选育，通过寻找与性状连锁的分子标记进行标记辅助选育一直是育种工作者的追求。
对经济甲壳类育种亲本取样用于分子检测时，通常采用断肢取肌肉的方法，此法造成取样目标的伤残，活力下降，部分个体因为感染死亡，因此，该法不适用于虾蟹分子连锁标记辅助育种。大部分克氏原螯虾通常每年的9、10月开始产卵，随着气温降低，抱卵虾钻洞过冬，至第二年开春幼体孵化出来，中间经历近半年，抱卵虾的活力对成活率非常重要。寻找有效的活体无损检测方法对经济甲壳类的分子标记辅助选育非常必要。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供了一种克氏原螯虾的活体无损取样方法及应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种克氏原螯虾活体无损取样方法，包括以下步骤：
步骤1，挑选克氏原螯虾抱卵亲本，选择个体健壮，生长良好，附肢齐全的克氏原螯虾抱卵亲本；
步骤2，将克氏原螯虾固定螯足，暴露腹部受精卵，对每个抱卵虾在螯足底部进行套环标记，对标记好的每个个体分别在抱卵虾腹部抱卵区前、中、后三个部分采集不同发育期的受精卵各5-10个，合并于一个采样管中。
进一步，所述的克氏原螯虾活体无损取样方法，步骤2中对每个抱卵虾在螯足底部进行套环标记采用带数字编号的自锁式尼龙扎带进行。
进一步，所述的克氏原螯虾活体无损取样方法，步骤2中的采样管为Eppendorf管。
以上所述的克氏原螯虾活体无损取样方法得到的不同发育期受精卵在分子育种中的应用。
进一步，所述的应用，分子育种方法包括以下步骤：
（1）对每个抱卵虾的不同发育期的受精卵提取DNA，进行与目标性状连锁的分子标记检测；
（2）筛选出含有目标性状连锁标记的抱卵虾，进行单独培育，孵化，幼体培育，养殖，获得选育一代群体；
（3）对选育一代群体按上述（1）-（2）的方法再进行一轮检测筛选，对获得的含目标连锁标记的纯合亲本做为选育二代亲本；对选育二代亲本进行单独培育，孵化，幼体培育，养殖，获得选育二代群体，直至该群体含有目标连锁标记的基因频率达到100%。
进一步，所述的克氏原螯虾活体无损取样方法应用于中华绒螯蟹、日本沼虾、罗氏沼虾的分子育种的活体无损取样中。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
本发明为克氏原螯虾分子检测提供了简易可行的活体无损取样方法。对经济甲壳类取样用于分子检测时，通常采用断肢取肌肉的方法，此法造成取样个体的伤残，活力下降，部分个体因为感染死亡。克氏原螯虾抱卵量通常在150-600粒，克氏原螯虾以抱卵的方式进行孵化，受精卵附着于腹部附肢的刚毛上，卵粒圆形，直径达1mm左右，胚胎发育至I、II期幼体仍附着寄生在母虾腹部附肢上。这些特性使得克氏原螯虾不同发育期受精卵（胚胎）易于采集而且不伤母体，采集受精卵进行分子检测既可以达到检测目的又可以做到对母体无损伤。
用于经济甲壳类分子标记辅助选育的育种亲本必须做到个体健壮、附肢健全，用传统采样方法很难做到无损取样，本发明为克氏原螯虾分子标记辅助选育提供了有效可行的取样方法，为用分子标记辅助选育的方法进行克氏原螯虾良种选育提供了可能性。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明的方案进行进一步说明。
一种克氏原螯虾活体无损取样方法，包括以下步骤：
步骤1，挑选克氏原螯虾抱卵亲本，选择个体健壮，生长良好，附肢齐全的克氏原螯虾抱卵亲本；
步骤2，将克氏原螯虾固定螯足，暴露腹部受精卵，对每个抱卵虾在螯足底部进行套环标记，对标记好的每个个体分别在抱卵虾腹部抱卵区前、中、后三个部分采集不同发育期的受精卵各5-10个，合并于一个采样管中。
为了能够更好更顺利的取样，在步骤2取样过程中，可以采用一个取样员紧握克氏原螯虾，另一个采样员利用带数字编号的自锁式尼龙扎带将螯足底部进行套环标记，然后再进行采集。采样管可以选择Eppendorf管，便于后期进一步处理。
取样后，可以进行分子育种，具体步骤如下：
（1）对每个抱卵虾的不同发育期的受精卵提取DNA，进行与目标性状连锁的分子标记检测；
（2）筛选出含有目标性状连锁标记的抱卵虾，进行单独培育，孵化，幼体培育，养殖，获得选育一代群体；
（3）对选育一代群体按上述（1）-（2）的方法再进行一轮检测筛选，对获得的含目标连锁标记的纯合亲本做为选育二代亲本；对选育二代亲本进行单独培育，孵化，幼体培育，养殖，获得选育二代群体，直至该群体含有目标连锁标记的基因频率达到100%。
实施例1
1.2016年10月份在江苏省盐都区养殖场收集个体健壮，生长良好，附肢齐全，克氏原螯虾抱卵亲本2000只。用带有数字编号的可以收紧的塑料套环扣在克氏原螯虾大螯基部，对每个抱卵虾进行编号；
2.对标记好的每个个体用干净消毒镊子分别在抱卵虾腹部抱卵区前、中、后三个部分采集不同发育期的受精卵各5-10个（总计15-30粒），合并于一个Eppendorf管中，速冻于液氮中带回实验室-80度冰箱暂存；
3.提取克氏原螯虾2000尾抱卵虾不同发育期的受精卵的基因组DNA，提取方式采用北京康为世纪生物试剂有限公司Soil Genomic DNA Kit。
4.微卫星微引物对（F:TATGCACCTTTACCTGAAT，R:TGTTGGTGTGGTCATCA）检测的微卫星位点与繁殖性状连锁，其中140bp条带的等位基因与高繁殖力性状连锁。用引物对（F:TATGCACCTTTACCTGAAT，R:TGTTGGTGTGGTCATCA）对克氏原螯虾不同发育期的受精卵的基因组DNA样品进行PCR扩增，PCR反应体系是25ul：10×PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，MgCl2 1.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，Taq酶0.3ul，DNA模板3ul，超纯水13.2ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min; 94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。把PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离和银染，根据银染结果统计PCR扩增产物的基因型。
5. 筛选出含有目标性状连锁的抱卵虾：筛选出带有140bp的目标条带的抱卵虾共560尾，进行单独培育，孵幼，幼体培育，获得选育一代群体，在采用同样方式获得选育二代群里，得到含有目标连锁标记的基因频率为100%的群体。
以上实施例提供的活体取样方法可以拓展应用于其他有抱卵习性的经济甲壳类，包括中华绒螯蟹、日本沼虾、罗氏沼虾等的分子育种的活体无损取样。