本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体来说，涉及一种板蓝根的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
板蓝根是一种主产于中国的常用中草药，常用别名有靛青根、蓝靛根、大青根，是十字花科植物菘蓝(isatistinctorial.)的根，通常在秋季进行采挖，炮制后可入药，其味先微甜后苦涩，性寒，归心、肝、胃经，具有清热解毒、预防感冒、利咽之功效。主要用于治疗温毒发斑、大头瘟疫、舌绛紫暗、烂喉丹痧、痤疮等疾病，药用价值极高。根据利用方式，地上部分称为板蓝根，以叶入药的称为大青叶，在生活中以鲜叶作为菜用的称为菜用板蓝根，板蓝根食用价值高，芽苗菜具有清热解毒、排毒养颜的功效，其口感清淡，略带苦味，即可凉拌，也可炒菜、做汤，是一种保健蔬菜。菜用板蓝根一年四季均可栽培，可有效利用土地，同时增加农民收入。
我国板蓝根种植区，品种复杂且混乱，市场上伪劣品比较多，严重影响药厂投料的真实性及临床疗效。
技术实现要素：
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种板蓝根的组织培养快速繁殖方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种板蓝根的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)准备外植体：取板蓝根种子，清洗并灭菌后放入ms或1/2ms培养基中培养，得到板蓝根幼苗，挑选幼嫩的板蓝根叶片或子叶节作为外植体；
(2)愈伤组织的诱导及芽分化：将幼嫩的板蓝根叶片或子叶节清洗并灭菌，切口向下栽在培养基上，诱导愈伤组织与不定芽；
(3)继代增殖：将步骤(2)得到的愈伤组织或不定芽转接到继代增殖培养基上进行继代增殖，产生丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)得到的丛生芽转接到无糖培养容器中进行生根培养，得到生根的板蓝根苗；
(5)练苗与移栽：打开无糖培养容器的盖子，将生根后的板蓝根苗在室温放置一天，然后浇水并在室温放置5-6天，将生根后的板蓝根苗分成单株取出后栽于苗床。
进一步的，所述幼嫩的板蓝根叶片清洗及灭菌的具体操作为：将幼嫩的板蓝根叶片用洗洁精洗干净后，流水冲12h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇8-10min，无菌蒸馏水冲洗4-6次，5min/次。
进一步的，所述幼嫩的板蓝根叶片清洗及灭菌的具体操作为：将幼嫩的板蓝根叶片用洗洁精洗干净后，流水冲12h，暗处理6h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；10％-20％体积分数的84消毒液震摇30min，无菌蒸馏水冲洗4-6次，5min/次。
进一步的，所述子叶节清洗及灭菌的具体操作为：将子叶节用洗洁精清洗冲干净后，75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇5-8min，无菌蒸馏水冲洗4-6次，5min/次。
进一步的，所述愈伤组织的诱导及芽分化采用的培养基为ms、0.06-0.08mg/ltdz、0.4mg/lnaa、30g/l白砂糖、5.8g/l琼脂组合的ph5.8-5.9的培养基。
进一步的，所述继代培养基为ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa+30g/l白砂糖+5.8g/l琼脂，ph5.8-5.9的培养基。
进一步的，所述生根培养容器中的培养基为ms培养基。
本发明的有益效果：本发明针对板蓝根种子繁殖病虫害严重、品种杂乱不纯、菜用供不应求等问题，通过不同部位选取外植体、不同激素诱导、增殖以及生根移栽的方法，培育并纯化板蓝根品种、为药用板蓝根优良品种的选育与菜用板蓝根工厂化生产提供理论与技术支撑。本发明的培养方法简单、取材方便、操作简单、增殖速度快，具有良好的经济效益与生态效益。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
所用器材：超净工作台，高压灭菌锅，培养瓶，电子秤，剪刀，镊子，喷壶，纱布。
实施例1
(1)准备外植体：挑选成熟饱满的板蓝根种子，洗洁精清洗干净后用纱布包好，流水冲12h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇10min，无菌蒸馏水冲洗5次，无菌纸托着用镊子夹进ms和1/2ms营养液中培养，ms和1/2ms各16瓶，板蓝根种子内生菌极大，种子发芽露白以后，会导致营养液中长出真菌，污染严重，因此，待营养液中的板蓝根种子露白以后，尽快剥掉种皮转接在固体培养基上(不含激素)，让其生长。
(2)愈伤组织的诱导及芽分化：挑选幼嫩的板蓝根叶片，洗洁精洗干净后，流水冲12h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇8min，无菌蒸馏水冲洗6次，5min/次，切口向下分别栽在以下培养基上，诱导愈伤组织与不定芽；培养基配方为：
1)ms+1.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa
2)ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa
3)ms+1.0mg/l6-ba+2.0mg/lnaa
4)ms+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa
5)ms+0.03mg/ltdz+0.2mg/lnaa
6)ms+0.04mg/ltdz+0.2mg/lnaa
7)ms+0.05mg/ltdz+0.2mg/lnaa
8)ms+0.06mg/ltdz+0.2mg/lnaa
9)ms+0.07mg/ltdz+0.2mg/lnaa
10)ms+0.03mg/ltdz+0.3mg/lnaa
11)ms+0.04mg/ltdz+0.3mg/lnaa
12)ms+0.05mg/ltdz+0.3mg/lnaa
13)ms+0.06mg/ltdz+0.3mg/lnaa
14)ms+0.07mg/ltdz+0.3mg/lnaa
15)ms+0.03mg/ltdz+0.4mg/lnaa
16)ms+0.04mg/ltdz+0.4mg/lnaa
17)ms+0.05mg/ltdz+0.4mg/lnaa
18)ms+0.06mg/ltdz+0.4mg/lnaa
19)ms+0.07mg/ltdz+0.4mg/lnaa
每l以上培养基中加蔗糖30g，琼脂5.8g，ph值调至5.80-5.90之间，在121℃下灭菌20min(以下培养基均同此处理)。将外植体剪切成边长1cm的小块，每瓶接4块，光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。
(3)继代增殖：采用ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa、ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa和ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa培养基，每瓶接4个芽或5块愈伤块(剪成边长5mm的小块)，20d后将诱导的丛生芽分离成单个的芽、愈伤剪切成小块继续继代增殖，继代增殖3次；
(4)生根培养：将步骤(3)继代增殖3次后得到的丛生芽用剪刀和镊子分离成单个的芽，多余的培养基和坏死的组织等在无菌蒸馏水中清洗干净后，用镊子夹着按顺序栽在事先准备好的无糖培养容器的蛭石中，株距、行距均约为2cm，接种完以后用保鲜膜封口写上标记放在培养架上培养，光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。20-30d后便可练苗移栽。
(5)练苗与移栽：打开无糖培养容器的封口，将生根后的板蓝根苗在室温放置一天，然后浇水并在室温放置6天，将生根后的板蓝根苗分成单株取出后栽于苗床。
愈伤组织的诱导及芽分化步骤中，诱导率约为13％，由于板蓝根内生菌比较大污染率高达36％。由表1可以看出，0.06mg/l和0.07mg/ltdz与0.4mg/lnaa组合的培养基，诱导率明显高于其他培养基。其他激素组合的培养基，出愈率低，愈伤不明显，而且新生芽与愈伤的生长很缓慢。
表1不同激素组合对叶片愈伤组织与不定芽诱导的影响
继代增殖培养基采用不同浓度的6-ba、tdz、naa的ms培养基，对第一次诱导出的愈伤组织进行再次诱导。
转接在培养基ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa上的板蓝根愈伤和芽出现了明显的发黄状态，转接在培养基ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa上的板蓝根愈伤和芽生长较慢，转接在培养基ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa上的板蓝根愈伤和芽长得很快，7-10d就需要继续转接，而且愈伤块诱导出芽也快。
表2继代增殖的污染率及诱导成芽率
由表2可以看出，继代增殖的的愈伤组织污染率很低，为1.85％；枯死率高达26.67％，诱导成芽率为42.59％，试验结果显示这种现象与培养基的配方有很大的关系。
实施例2
愈伤组织的诱导及芽分化步骤中0.1％升汞震摇时间为10min，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：挑选幼嫩的板蓝根叶片，洗洁精洗干净后，流水冲12h，暗处理6h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；10％体积的蓝月亮84消毒液震摇30min，无菌蒸馏水冲洗4次，5min/次，形态学下端朝下栽在不同配方的培养基上。其余步骤与实施例1相同。
实施例4
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：挑选幼嫩的板蓝根叶片，洗洁精洗干净后，流水冲12h，暗处理6h；75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；20％体积的蓝月亮84消毒液震摇30min，无菌蒸馏水冲洗6次，5min/次，形态学下端朝下栽在不同配方的培养基上。其余步骤与实施例1相同。
实施例5
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：剪取子叶节(1-1.5cm刚出土露出两片子叶的板蓝根幼苗)，洗洁精清洗冲干净后，75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇5min，无菌蒸馏水冲洗4次，5min/次，切口向下栽在培养基上。培养基配方为：
ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa
ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa
ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa
每l以上培养基中加蔗糖30g，琼脂5.8g，ph值调至5.80-5.90之间，在121℃下灭菌20min(以下培养基均同此处理)。光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。其余步骤与实施例1相同。
实施例6
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：剪取子叶节(1-1.5cm刚出土露出两片子叶的板蓝根幼苗)，洗洁精清洗冲干净后，75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇6min，无菌蒸馏水冲洗4次，5min/次，切口向下栽在培养基上。培养基配方为：
ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa
ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa
ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa
每l以上培养基中加蔗糖30g，琼脂5.8g，ph值调至5.80-5.90之间，在121℃下灭菌20min(以下培养基均同此处理)。光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。其余步骤与实施例1相同。
实施例7
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：剪取子叶节(1-1.5cm刚出土露出两片子叶的板蓝根幼苗)，洗洁精清洗冲干净后，75％酒精消毒30s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇7min，无菌蒸馏水冲洗4次，5min/次，切口向下栽在培养基上。培养基配方为：
ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa
ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa
ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa
每l以上培养基中加蔗糖30g，琼脂5.8g，ph值调至5.80-5.90之间，在121℃下灭菌20min(以下培养基均同此处理)。光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。其余步骤与实施例1相同。
实施例8
愈伤组织的诱导及芽分化步骤为：剪取子叶节(1-1.5cm刚出土露出两片子叶的板蓝根幼苗)，洗洁精清洗冲干净后，75％酒精消毒60s，无菌蒸馏水冲洗3次；0.1％升汞震摇8min，无菌蒸馏水冲洗6次，5min/次，切口向下栽在培养基上。培养基配方为：
ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa
ms+0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa
ms+0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa
每l以上培养基中加蔗糖30g，琼脂5.8g，ph值调至5.80-5.90之间，在121℃下灭菌20min(以下培养基均同此处理)。光照下培养(12h，2000lx)，培养温度为24±2℃。其余步骤与实施例1相同。
实施例9
对比实施例1-4愈伤组织的诱导及芽分化步骤中诱导率及污染率：
由表3可以看出，不同材料的板蓝根诱导率相差很大，实施例1的诱导率为3.33％，而实施例2的诱导率为0，外植体脱分化的能力与诱导材料的基因有很大的关系；0.1％升汞震摇8min(实施例1)的污染率高于震摇10min(实施例2)，10％(实施例3)体积的84消毒液震摇30min的污染率高于20％(实施例4)体积的84消毒液震摇30min；0.1％升汞与10％和20％体积的84消毒液对板蓝根外植体灭菌效果无明显差异，而升汞的內渗性与毒性明显大于84消毒液，所以用20％体积的84消毒液对板蓝根材料灭菌处理优于其它灭菌剂。
表3不同材料与灭菌方式对诱导率及污染率的影响
实施例10
对比实施例5-8不同灭菌时间对子叶节诱导不定芽与污染率的影响：
75％酒精灭菌时间不宜过长，否则易脱水枯死。由表4可以看出，0.1％升汞灭菌时间为7分钟时可大大降低污染率，从而提高诱导出芽率；0.1％升汞灭菌时间为7分钟时的出芽率与5、6、8分钟之间具有显著性差异。一部分的子叶节在培养一周以后开始长出新芽，但是没有明显的愈伤产生，20天以后，叶片开始发黄変枯。
表4不同灭菌时间对子叶节诱导不定芽与污染率的影响
因此，综合考虑，0.06mg/l-0.08mg/ltdz+0.4mg/lnaa组合的培养基对板蓝根叶片诱导产生愈伤组织和丛生芽的诱导率较高；20％体积的84消毒液对外植体的灭菌效果优于其它消毒剂；0.1mg/ltdz+0.4mg/lnaa组合的培养基对板蓝根继代培养中愈伤块的增殖、不定芽的诱导与预防愈伤块枯死的效果较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。