一种动物红细胞保存液的配制方法及其应用与流程

本发明涉及红细胞保存
技术领域：
，具体地说是一种骆驼科动物红细胞保存液的配制方法及其应用。
背景技术：
：骆驼科动物作为经济动物有一定范围的饲养规模，骆驼科动物中部分种如野骆驼为濒危野生动物，在对濒危物种急救及经济动物兽医救治过程中，输血疗法是重要的手段，但目前尚无针对骆驼科动物的红细胞体外保存液。人类红细胞寿命大约为120天，受损或衰老的红细胞的膜脆性增加，致使抗原暴露，暴露的抗原与自身igg结合，最终被巨噬细胞吞噬。另外，红细胞老化致使表面cd47含量下降，也会导致红细胞被吞噬。由于老化红细胞易被吞噬清除，故而对于如何更好的保存红细胞以满足输血治疗的目的，是输血医学中一直不断探索的问题。红细胞输注的目的是输送具有正常生物功能的红细胞进入受血者体内，减轻或治疗受血者因缺乏红细胞或缺乏具有正常生物功能的红细胞造成的症状。日常输血中最常用的红细胞体外保存方法是4℃保存，不同的配方及添加剂决定了红细胞保存时间的长短。由于红细胞在保存期间持续代谢，所以红细胞4℃体外保存只能起到短时体外保存的作用。临床上对体外保存后的红细胞输注效果的评判标准是输注后24h输注的红细胞成活率应高于70％(pittigliodh，1983)，而实验中评价红细胞保存效果最常用的是细胞形态学外观、游离血红蛋白/溶血率及atp三类指标(pittigliodh，1983；hessjr，2002)。红细胞在保存期间，随时间变化，其形态学发生较大变化，如皱缩、出脊等，故形态学观察可直接评价细胞保存体系的优劣，游离血红蛋白/溶血率作为通过肉眼可以观察到的最直观的指标，是一个红细胞保存体系好坏的直接评价。体外保存红细胞发生溶血后，输血过程中大量游离血红蛋白进入机体，会诱发黄疸，还导致脑部缺氧，过多的血红蛋白代谢还会导致肾脏疾病(heatonwa，1992；cf，1999)。atp是红细胞保持正常生理功能的基础。1983年pittiglio发现，红细胞内atp含量与输注后24h红细胞成活率有直接关系(pittigliodh，1983)，随着红细胞保存时间的延长。由于骆驼科动物血液钠离子含量远高于人类血浆中钠离子含量，故直接使用人类红细胞保存液对骆驼科动物红细胞进行保存时，由于渗透压差造成红细胞破碎溶血，故而需要配制专用与骆驼科的红细胞保存液对骆驼科红细胞进行保存，至今未见有关骆驼科动物红细胞保存液的公开文献报道。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种动物红细胞保存液的配制方法及其应用，采用atp与谷胱甘肽、柠檬酸钠、葡萄糖、柠檬酸、磷酸二氢钠和甘露醇配置的溶液，用于骆驼科动物红细胞的输注和体外保存，有效保存期达30天，对保存期间骆驼红细胞形态学、红细胞atp含量及保存液上清游离血红蛋白进行测定，保持了骆驼科动物特有的红细胞形态，体外保存效果良好，红细胞成活率>70％，保存液配置方法简单，试剂材料易得，是一种高效、经济且符合能源资源节约的绿色制备方法。实现本发明目的的具体技术方案是：一种动物红细胞保存液的配置方法，其特点是该红细胞保存液由atp与谷胱甘肽、柠檬酸钠、葡萄糖、柠檬酸、磷酸二氢钠、甘露醇和去离子水按1：1：80～100：110～130：12～20：15～22：16～25：545～565摩尔比配制，其混合溶液经0.22μm的滤膜过滤，制得动物红细胞保存液，所述atp浓度为0.08～0.12mmol/l；所述谷胱甘肽浓度为0.08～0.12mmol/l；所述柠檬酸钠浓度为80～100mmol/l；所述葡萄糖浓度为110～130mmol/l；所述柠檬酸浓度为12～18mmol/l；所述磷酸二氢钠浓度为16～20mmol/l；所述甘露醇浓度为18～22mmol/l。一种动物红细胞保存液的配制方法制备的动物红细胞保存液的应用，其特点是该保存液作为试剂用于骆驼科动物临床红细胞的输注和体外保存，所述骆驼科动物临床红细胞的输注，其骆驼科动物红细胞与保存液的体积比为1：1.5～2.5；所述骆驼科动物临床红细胞的体外保存，其骆驼科动物红细胞与保存液的体积比为1：2；所述保存温度为2～8℃；所述保存时间≤30天；所述红细胞成活率>70～90％。本发明与现有技术相比具有体外有效保存动物红细胞达30天，可用于骆驼科动物临床红细胞的输注，保存液的配置方法简单，试剂材料易得，是一种高效、经济且符合能源资源节约的绿色制备方法。附图说明：图1为骆驼红细胞体外保存0天的光学显微图像；图2为骆驼红细胞体外保存15天的光学显微图像；图3为骆驼红细胞体外保存30天的光学显微图像；图4为骆驼红细胞体外保存45天的光学显微图像；图5为骆驼红细胞体外保存天数与atp的曲线图；图6为骆驼红细胞体外保存天数与游离血红蛋白的曲线图。具体实施方式以下通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1按下述表1的配方表和表2的浓度进行配制，将各种组份称量后溶解于去1000ml的去离子水中，并使用0.22μm滤膜进行过滤，配制成动物红细胞保存液待用。表1保存液配方表名称含量(mmol/l)柠檬酸钠90葡萄糖120柠檬酸15.5磷酸二氢钠18甘露醇20atp1谷胱甘肽1表2各组份物质浓度表名称含量范围(mmol/l)柠檬酸钠90±9葡萄糖120±12柠檬酸15.5±2磷酸二氢钠18±2甘露醇20±2atp1±0.2谷胱甘肽1±0.2实施例2将上述实施例1制备的保存液按下述步骤进行骆驼红细胞的体外保存：a、将采集的骆驼抗凝全血在3000rpm转速下离心5min，然后将血浆用5ml移液器移去，并使用1ml微量移液器尽量吸除白膜层。b、将剩余红细胞按照骆驼红细胞:保养液为1:2的体积比例进行混合使用。c、将上述骆驼红细胞混合体分装于5ml不抗凝采血管中。d、将上述分装好的骆驼红细胞实验管保存在4℃的冰箱中。对上述体外保存的骆驼红细胞样品每15天测定上清游离血红蛋白和全血atp含量一次(每组各一支)，所述atp为采血后全血血样测定，溶血率按照采集全血后血浆游离血红蛋白为初始值，并分别进行下述各项目的检测：(一)保存期间的骆驼科红细胞形态学检测将混匀后的骆驼保养体系，使用保存液稀释10倍后，使用100×光学显微镜即可判断骆驼红细胞状态。(二)保存期间的骆驼科红细胞保存体系游离血红蛋白检测a、按照试剂盒操作说明，将50μl去离子水加入96孔平底透明板中，作为空白孔，另一孔加入50μl标准液，作为标准孔，空白孔和标准孔内各再加入200μl去离子水。b、将50μl保养液上清加入到96孔平底透明板中，加入200μl测定液后整板放置5min，在800rpm转速下离心3min后放入化学发光仪中，于400nm波长下对样品进行吸光度检测，(样品吸光度-空白吸光度)/(标准品吸光度-空白吸光度)*100mg/dl，即为该样品游离血红蛋白浓度。(三)骆驼红细胞体外保存体的atp检测a、按照增强型atp检测试剂盒(碧云天；产品编号:s0027)说明书要求，将标准品10μm配制atp标准品浓度梯度：2.5μm、1.25μm、0.25μm、0.125μm。b、每份待测血样，取20μl保存体系，加入100μl裂解液后在25％功率下超声2s后停2s，在两个循环的条件下进行超声破碎，超声后的样品在4℃温度下离心5min，其离心速度为12000rpm，然后取上清液。c、采用atp检测母液，加试剂盒配套的稀释剂配制成检测工作液，母液和稀释液的体积比为1:9。d、使用96孔白板，每孔加入100μlatp检测工作液，室温下放置2min，分别在孔中加入20μlatp标准品或待测血样制备的上清液，混匀后采用平板在800rpm转速下离心3min后立刻用光密度仪，使用rlu参数，检测荧光参数。e、血红蛋白含量测定：取5μl保存体系样品，加入到500μl去离子水中，在25％功率下超声2s后停2s，在两个循环的条件下进行超声破碎，超声后的样品在4℃温度下离心5min，其离心速度为12000rpm，然后取上清液，并按说明书要求的步骤进行游离血红蛋白的实验操作。f、用atp总量除以血红蛋白量，即得单位血红蛋白atp含量。(四)实验结果分析将骆驼红细胞体外保存体混合均匀后自然沉降，观察上清颜色，作为是否溶血的直观标准，通过观察保存期为0天、15天、30天和45天的骆驼红细胞保存体，发现使用实施例1制备的存液对骆驼红细胞的体外保存效果良好。参阅附图1，使用100×光学显微镜观察新鲜的骆驼红细胞作为骆驼红细胞状态的判断标准，通过保存期为0天的骆驼红细胞的形态学观察，发现细胞外部形态保持良好，保持了骆驼科动物特有的红细胞形态，说明实施例1制备的保存液对骆驼红细胞的体外保存效果良好。参阅附图2，使用100×光学显微镜观察新鲜的骆驼红细胞作为骆驼红细胞状态的判断标准，通过保存期为15天的骆驼红细胞的形态学观察，发现细胞外部形态保持良好，保持了骆驼科动物特有的红细胞形态，说明实施例1制备的保存液对骆驼红细胞的体外保存效果良好。参阅附图3，使用100×光学显微镜观察新鲜的骆驼红细胞作为骆驼红细胞状态的判断标准，通过保存期为30天的骆驼红细胞的形态学观察，发现细胞外部形态保持良好，保持了骆驼科动物特有的红细胞形态，说明实施例1制备的保存液对骆驼红细胞的体外保存效果良好。参阅附图4，使用100×光学显微镜观察新鲜的骆驼红细胞作为骆驼红细胞状态的判断标准，通过保存期为45天的骆驼红细胞的形态学观察，发现细胞外部形态保持良好，保持了骆驼科动物特有的红细胞形态，说明实施例1制备的保存液对骆驼红细胞的体外保存效果良好。参阅附图5，通过atp与游离血红蛋白检测发现，根据人类红细胞体外保存相关评价标准，该保存液可应用于骆驼红细胞在4℃温度下的30天体外保存。参阅附图6，通过骆驼红细胞保存体游离血红蛋白检测发现，根据人类红细胞体外保存相关评价标准，该保存液可应用于骆驼红细胞在4℃温度下，体外保存30天。以上各实施例只是进一步说明本发明，并非用以限制本发明专利，凡为本发明等效实施，均应包含于本发明专利的权利要求范围之内。当前第1页12