一种抑制滴灌灌水器微生物堵塞的方法与流程

本发明属于节水灌溉技术领域，具体涉及一种抑制滴灌灌水器微生物堵塞的方法。

背景技术：

滴灌技术是目前被认为是最节水的灌溉方式，能够将水和肥精确地输送到植物根部，是节水灌溉发展的方向。随着水资源紧缺与污染问题的加剧，再生水、河湖库地表水、雨水以及养殖废水等非常规水资源在滴灌技术中的利用，加剧了滴灌系统关键部件灌水器的堵塞问题。非常规水资源引起的灌水器堵塞以生物堵塞为主，堵塞生物膜的生长造成过滤设备的腐蚀、损坏，增加水动力阻力从而增加能耗，以及输水管道及灌水器流道堵塞，严重降低输水效率和灌水均匀度，严重时会导致整个系统的报废。因此，堵塞问题解决的好坏直接决定了滴灌工程的使用寿命和应用效益。

如何有效去除和控制生物膜的生长是解决滴灌灌水器堵塞问题的关键，大量科研学者针对此进行了大量研究，包括：化学加氯、定期反向冲洗、脉冲流清洗技术、微泡技术、表面改性、表面涂层技术、紫外光、强磁场、超声波、群体淬灭技术等，但总体而言，现有的方法在运用成本、环境污染、资源消耗、运行能耗等方面都会存在一定的缺点。微生物群体繁殖和生长是导致管道内部附生生物膜难以去除的关键原因，利用微生物的拮抗关系可以抑制甚至杀死形成生物膜的关键微生物，从而干扰和控制生物膜的形成发展，这为限制附生生物膜生长提供了一种绿色环保的控制新思路。如中国农业科学院农田灌溉研究所高胜国等(cn202168387u)公开了一种滴灌系统抗生物堵塞装置，其借助臭氧发生器，有效杀死流道内微生物。但是臭氧溶于水后对土壤微生物群落产生负面影响，降低土壤健康质量。白志辉等公开了一种防治滴灌灌水器堵塞的微生物控制方法(cn106957804a)，该方法提出利用筛选出来的枯草芽孢杆菌n14菌株来缓解滴灌灌水器堵塞，可使已经发生堵塞的灌水器流量得到恢复；但是针对灌溉水质的复杂性，对于不同的水源该菌株是否均具有良好的微生物防治效果，值得商榷。因此，随着分子生态网络分析方法的提出，为明确影响生物膜生长的关键菌提出了可行方法，但是未见相关专利及文献报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的问题，本发明提出一种针对不同灌溉水源滴灌系统堵塞的方法，可有效解决滴灌水源对灌水器的堵塞。

为此本发明的技术方案如下：

一种抑制滴灌灌水器微生物堵塞的方法，包括以下步骤：

(1)采用发育分子生态网络分析确定导致滴灌灌水器堵塞的关键菌，然后进行抑制滴灌灌水器堵塞的拮抗菌筛选；

(2)将筛选出的拮抗菌于含有沼液的培养基中进行发酵，制备成拮抗菌剂；

(3)将拮抗菌剂应用于滴灌系统。

上述方法中，所述拮抗菌筛选的方法，包括以下步骤：

(1)培养灌水器流道内附生生物膜，然后提取堵塞物质生物膜微生物；

(2)提取生物膜中微生物的总dna，扩增16srrna的v3-v4可变区，纯化，定量检测以及测序；

(3)将生物膜微生物的测序结果用于构建发育分子生态网络，根据细菌之间的相关性，筛选出影响生物膜生长的关键菌；同时根据滴灌作物，选择具有生物防治功能的菌种作为备选菌，然后结合上述筛选出来的关键菌进行拮抗实验，筛选出备选菌中和关键菌出现拮抗作用的菌种作为拮抗菌。

上述方法中，所述培养灌水器流道内附生生物膜的方法，可以选择下述方法，包括：

利用滴灌灌水器抗堵塞性能综合测试装置(cn102288409a)进行生物膜培养。在灌水器堵塞程度达到50％时进行生物膜提取。

上述方法中，所述发育分子生态网络的构建和分析方法为：首先对各菌种的out(operationaltaxonomicunit，运算的分类单位)原始数据进行标准化处理后，利用mena网络分析系统计算otu节点之间的连接强度，通过网络分析得到网络性质参数，然后进行可视化处理，得到网络结构图，找出其中与其他out链接数高的out，即为影响生物膜生长的关键菌。

上述方法中，所述发育分子生态网络的构建和分析方法为：首先对各菌种的otu原始数据进行标准化处理后，利用mena网络分析系统计算otu节点之间的连接强度，然后进行可视化处理，得到网络结构图，找出其中与其他out链接数高的out，即为影响生物膜生长的关键菌。

所述发育分子生态网络的构建和分析方法为：首先对各菌种的otu原始数据进行标准化处理后，利用mena网络分析系统计算otu节点之间的连接强度，

所述发育分子生态网络系统的构建和分析方法，可以是以下方法，包括：

首先根据测序结果，得到out丰度矩阵的原始数据，每一行对应一个out,每一列对应otu在不同样品中的丰度，对原始数据进行标准化处理；

利用mena分析网站，基于随机矩阵理论的分子生态学界面方法构发育分子生态网络系统：

例如，可以使用的方法包括：计算任意两个otu的皮尔森相关性(pearsoncorrelation)后构建相关性矩阵；将相关性矩阵转换为相似性矩阵；根据随机矩阵原理自动设定一个阈值(similaritythreshold)，然后将相似性矩阵转换成邻接矩阵，从而计算otu节点之间的连接强度。以默认阈值为准，利用mena网络分析(analyzethenetworks)计算网络性质参数。

利用cytoscape3.4.0软件对网络进行可视化处理；得到网络结构图及相关信息：包括节点数即群落中的物种(otu)；节点之间的连线即物种之间相互作用关系(正相关，co-occurrence；负相关，competition)；连通度(connectivity)即一个节点与其它所连接的节点之间的连通强度；路径长度(geodesicdistance)即2个节点之间的最短距离；聚集系数(clusteringcoefficient)即一个节点与其它节点之间连通度的好坏；以及模块性(modularity)即表征分子生态网络中模块特性，一个网络被分割成多个模块，单个模块被考虑为生态系统中一个功能单元。

最后，利用maslov-sneppen方法，在不改变原有网络节点和连线数的基础上，重新连接原网络中不同位置的节点并构建了100次随机网络，然后比较分子生态网络和随机网络之间的差别。

关键菌判别：生物膜细菌群落的分子生态网络可反映群体之间的相互作用，其中out与其他out之间链接数高的，即为影响生物膜生长的关键菌，控制关键菌即可抑制生物膜的生长，起到清除滴灌灌水器生物膜的作用。

上述方法中，所述具有生物防治功能的菌种包括：滴灌作物生育期间可能导致作物发病的病原菌和作物根部中促进作物生长的益生菌。

上述方法中，所述病原菌包括细菌类、病毒类、真菌类或其他病原菌；所述益生菌包括农杆菌、固氮菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、伯克氏菌、假单胞菌、微球菌、根瘤菌类或弗兰克菌。

上述方法中，所述拮抗菌剂的制备方法包括以下步骤：将新鲜沼液进行浓缩，然后将沼液和拮抗菌进行发酵培养，制备拮抗菌剂。

上述方法中，所述浓缩的方法包括：将新鲜沼液，在真空状态下置入反应釜中进行浓缩，浓缩压力为1×10⁵pa，浓缩至沼液含水率约为60％，浓缩时间约为1h。

上述方法中，将沼液和拮抗菌进行发酵培养的方法包括：按照重量份数计，将拮抗菌15～20份、亚硒酸钠0.4～0.8份、红糖6～8份加入75～85份沼液中，在25-28℃温度条件下均匀搅拌并且发酵4-10天，得到液体菌肥，向液体菌肥中施加微纳米气泡，得到拮抗菌剂。

上述方法中，将拮抗菌剂应用于滴灌系统的方法包括：在灌水器相对平均流量下降25％时或系统累积运行100h后，将制作的拮抗菌剂与滴灌水源按照质量比1:500-1500比例混合，输入滴灌系统。

上述方法中，所述将拮抗菌剂应用于滴灌系统的方法还包括：进行周期性施加，施加频率为1次/1～2周，每次施加2～3h。

本发明的有益效果：

(1)本发明的方法，利用分子生态网络分析的方法来获得导致滴灌灌水器生物膜生长的关键菌，结合微生物拮抗原理，筛选出能够拮抗导致生物膜生长的关键菌，同时根据滴灌作物需要，进一步选择对作物病害有生物防治和根际促生作用的益生菌，从而获得兼具控堵、生防和促生的多功能的拮抗菌，应用于滴灌系统，抑制灌水器生物膜的生长。使该方法适用于不同灌溉水质，能够针对性、靶向性的解决灌水器堵塞问题。

(2)本发明的方法，采用沼液作为液态发酵培养基，进一步筛选出在微纳米气泡水滴灌过程占据优势的优势拮抗菌，利用优势拮抗菌菌株进行多功能拮抗菌剂的制作，实现液态农用微生物菌剂的低成本生产。

(3)本发明的方法，应用拮抗菌剂于滴灌系统，结合控制滴灌灌水器生物堵塞的多功能液态菌剂施用模式。可以保证滴灌系统安全运行300h以上，实现滴灌系统安全运行，非常规水源高效利用。

附图说明

图1为抑制滴灌灌水器微生物堵塞的方法的流程图。

图2为道内附生生物膜中细菌群落网络分析图。

图3为菌剂拮抗试验结果。

图4为灌水器相对平均流量变化。

图5为表2中灌水器结构示意图；其中(1)为n锯齿尖角形；(2)为锯齿圆弧形1；(3)为锯齿圆弧形2；(4)为v锯齿尖角形；(5)为锯齿圆弧形3；(6)为锯齿圆弧形4。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

本发明可广泛应用于非常规水源滴灌系统堵塞控制。我们以再生水滴灌灌水器堵塞清除为例，介绍本发明的实施过程，流程如图1所示。

包括以下步骤：

(1)堵塞物质生物膜培养

采用周期性循环活性污泥法(cyclicactivatedsludgesystem，cass)、和深池曝气污水再利用技术(sequencingbatchaerationwastewaterrecycling，sbwl)处理后达标的两种再生水水源作为试验水源。水质检测结果如表1所示。

利用滴灌灌水器抗堵塞性能综合测试装置(具体见cn102288409a)进行生物膜培养。试验选用6种不同流道结构灌水器培养生物膜，灌水器结构参数见表2。

试验前用naclo溶液对整个装置、储水桶等消毒，然后用去离子水冲洗干净。设置120目叠片过滤器作为过滤处理系统。在运行过程中，系统运行工作压力保持100kpa，系统每天运行14h(7:00-21:00)，系统累积运行784h，共计56d，每3天清洗一次过滤器，储水桶中的水每7d更换一次。同时考虑到一天之内温度变化可能会对微生物活动产生影响，本系统外接即热型热水器(中国，广东；亨利康rj2-8.5kw)，使系统水温稳定在25℃，误差浮动在±0.1℃。

表1试验期间水质测试结果

注:tp代表总磷；tn代表总氮。

表2培养生物膜的灌水器流道特征参数

(2)生物膜中关键菌提取

在生物膜培养系统运行到784h时，灌水器堵塞程度达到50％，对两种处理工艺再生水处理组灌水器分别进行生物膜的提取。

用灭菌后的小刀小心剥开灌水器置于50ml离心管中，加适量去离子水，放在功率为600kw的超声波清洗仪中振荡清洗5min，反复操作8～10次，控制水温为4℃，收集水样作为生物膜样品。

将水样14000r/min离心15min(4℃)，收集沉淀用于dna提取。根据soil试剂盒(omegabio-tek,norcross,ga,u.s.)说明书进行总dna抽提，dna浓度和纯度利用nanodrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量。用338f(5’-actcctacgggaggcagcag-3’)和806r(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)引物对16srrna的v3-v4可变区进行pcr扩增，扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min(pcr仪：abi9700型)。扩增体系为20ul，4ul5*fastpfu缓冲液，2ul2.5mmdntps，0.8ul引物(5um)，0.4ulfastpfu聚合酶；10ngdna模板。

扩增结束后，使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，利用axyprepdnagelextractionkit(axygenbiosciences,unioncity,ca,usa)进行纯化，tris-hcl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用quantifluor^tm-st(promega,usa)进行检测定量。使用2％琼脂糖凝胶电泳，检查扩增效果。

将pcr扩增，纯化后的产物(每个处理包含7个重复)送至上海美吉生物科技有限公司进行生物膜高通量测序分析。利用dna的测序结果，构建系统发育分子生态网络，并进行分析。通过基于随机矩阵理论的分子生态学界面方法构建，利用mena(http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi)进行网络分析，可视化网络图采用cytoscape3.3.0实现，如图2所示。

具体步骤包括如下：

首先根据测序结果，得到out丰度矩阵的原始数据，每一行对应一个out(运算的分类单位operationaltaxonomicunit，此处为一个细菌菌种),每一列对应otu在不同样品中的丰度，对原始数据进行lg标准化处理；

利用mena分析网站，计算任意两个otu的皮尔森相关性(pearsoncorrelation)后构建相关性矩阵；将相关性矩阵转换为相似性矩阵；根据随机矩阵原理自动设定一个阈值(similaritythreshold)，然后将相似性矩阵转换成邻接矩阵，从而计算otu节点之间的连接强度。以默认阈值为准，利用mena网络分析(analyzethenetworks)计算网络性质参数。

利用cytoscape3.4.0软件对网络进行可视化处理；得到网络结构图(如图2所示)及相关信息：包括节点数即群落中的物种(otu)；节点之间的连线即物种之间相互作用关系(正相关，co-occurrence；负相关，competition)；连通度(connectivity)即一个节点与其它所连接的节点之间的连通强度；路径长度(geodesicdistance)即2个节点之间的最短距离；聚集系数(clusteringcoefficient)即一个节点与其它节点之间连通度的好坏；以及模块性(modularity)即表征分子生态网络中模块特性，一个网络被分割成多个模块，单个模块被考虑为生态系统中一个功能单元。

最后，利用maslov-sneppen方法，在不改变原有网络节点和连线数的基础上，重新连接原网络中不同位置的节点并构建了100次随机网络，然后比较分子生态网络和随机网络之间的差别，验证所构建网络的非随机性。

分子生态网络分析完成后，关键菌判别原则：生物膜细菌群落的分子生态网络可反映群体之间的相互作用，其中out与其他out之间链接数高的，即为影响生物膜生长的关键菌，控制关键菌即可抑制生物膜的生长，起到清除滴灌灌水器生物膜的作用。

两种处理分别获得了总共350，179个节点，其连接数分别为1286和331。cass和sbwl处理工艺菌群中链接数最多的分别为otu_346:leptolyngbya,otu_585:bosea，分别为对应处理下生物膜微生物互作网络中的关键菌。

(3)拮抗菌的筛选

对于生物防治功能和根际促生功能的菌株，选择了具有生防和根际促生功能的假单胞菌、内生芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌作为备选菌，进行生物膜拮抗试验。将上一步分析出来的关键菌和筛选出来的备选菌进行菌株的提取纯化，在新的平板培养基上培养24小时。然后在平板上以中间生物膜菌株为圆心，在平板边缘涂菌剂菌株。只有枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌平板上备选菌和关键菌生长都很差，即为拮抗菌菌株(见图3)。

(4)拮抗菌剂的制备

沼液的养分含量较高，且产生量巨大，是良好的有机滴灌肥源，通过将提取出的拮抗菌置于以沼液为主体的基础培养基中进行发酵，进而培养出能够在沼液环境下生存和防治的优势拮抗菌。

包括步骤如下：

①选取正常产气的沼气池的新鲜沼液，在真空状态下置入反应釜中进行浓缩，浓缩压力为1×10⁵pa，浓缩至沼液含水率约为60％，浓缩时间约为1h。

②将筛选出的拮抗菌、亚硒酸钠、红糖加入沼液中，可促进无机硒(亚硒酸钠)转化成有机硒，形成富有机硒液体菌肥。

③将混合液在25-28℃温度条件下均匀搅拌并且发酵7天，得到具有稳定性能的含有拮抗菌种的多功能沼液液体菌肥。

④向多功能液体菌肥中施加微纳米气泡半小时，曝气过程有利于沼液中有机物氧化分解，降低沼液的生物毒性，提升速效养分。

⑤鉴于步骤④微纳米气泡曝气，拮抗菌应筛选能够在强氧化条件下具有优势地位的拮抗菌种，确保拮抗菌剂的有效性。同时利用溶解氧与微生物、有机物的接触，淘汰培养拮抗菌种中厌氧劣势菌。

该制作方法可制备出具有堵塞控制、生物防治、根际促生作用的富硒液体—拮抗菌剂。

在本实施例中的具体步骤为：

选取正常产气的沼气池的新鲜沼液，在真空状态下置入反应釜中进行浓缩，浓缩压力为1×10⁵pa，浓缩至沼液含水率约为60％，浓缩时间约为1h。然后按重量份数，将沼液85份，枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌8份，亚硒酸钠0.3份，红糖6.7份混合，在25℃温度条件下均匀搅拌并且发酵7天，然后通过微纳米气泡0.5h。获得含有枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的拮抗菌剂。

(5)拮抗菌剂的应用

非常规水源滴灌系统工作压力为1.0mpa，综合考虑系统要求和土壤状况选择滴灌灌水器流量为1.0～3.0l/h左右的片式滴灌带。在灌水器相对平均流量下降25％时或系统累积运行100h后，将制作的多功能菌剂与滴灌水源按照1:1000比例混合，输入滴灌系统。通常情况下，进行周期性施加，施加频率为1次/1～2周，每次施加2～3h，避免拮抗菌剂清除生物膜后在滴灌系统内形成新的优势菌，从而增加灌水器堵塞。在此模式下可有效控制滴灌灌水器中堵塞物质，保证系统安全运行。

(5)多功能液体菌肥应用

我们选取第一阶段再生水滴灌系统灌水器附生生物膜培养保存的相对平均流量下降10％、25％和50％三个程度的生物膜灌水器样品进行生物膜控制试验，按照菌液与水源的混合配比为1:1000，加入滴灌系统运行，总计运行300h。每50h施加一次，每次施加2h。通过定期的流量测试结果发现，灌水器相对平均流量下降10％和25％两个水平下施加抗菌剂均可对灌水器堵塞起到很好的控制效果(见图4)。鉴于滴灌作物实际应用中对抗菌剂的需要，可在滴灌灌水器相对平均流量下降25％时进行抗菌剂的施用。