一种外周血单个核细胞改良冻存液的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从外周血提取单个核细胞进行冻存时所应用的改良冻存液配方及冻存方法。

背景技术：

外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)，是指外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(t\b\nk)，单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其它少量细胞类型。现有技术可将分离的pbmc在不同刺激因子的作用下培养成具有不同生物学功能的效应细胞(例如dc、cik、nk、cd3ak、γδt等细胞)，不仅在治疗癌症方面有较好的前景，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或其他症状时，将存储的免疫细胞进行回输，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。此外，冷冻保存pbmc还可以解决现阶段免疫细胞诱导应用时需要多次采血且采集价格昂贵等问题。

因为在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此目前主要应用液氮冷冻保存法来长期保存采集的细胞。正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，需要优化改良冻存液的配方及配制比例，并使冻存操作过程简单方便。

而现有细胞冻存液多采用10％的dmso与90％的胎牛血清，但由于此浓度dmso仍具有相当的毒性，细胞复苏后如dmso去除不净会对病人身体不利。而且此种冻存液冻存的细胞存活率以及细胞活性较低。且这种即用型冻存液，需要现配现用，保持期短，批次差异大，保存效果不稳定。

在冻存方法上，主要采取缓慢冷冻的方法，即4℃10min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放入液氮中，此操作过程中有时会出现某步骤遗忘(例如放置4℃或-20℃时间过长)从而导致冻存失败。虽然还可以应用程序降温仪冻存，但其使用操作繁琐、成本高，也不易在临床大规模使用。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的就在于提供一种简单有效、安全可靠、细胞复苏活力高的外周血单个核细胞改良冻存液及冻存方法。其特征在于：发明的pbmc改良冻存液包括以下组分：胎牛血清、右旋糖苷、dmso、海藻糖、聚乙二醇(peg)、重组人白介素-2。本发明的另一目的在于提供一种简便的冻存方法，即使用本发明提供的冻存液冻存细胞可直接-80℃冻存，不需要采取步骤降温或程序降温，简单方便且效果可靠。

优选的，本发明所述pbmc改良冻存液包括：胎牛血清20～60体积％；右旋糖苷0.2～0.5g/ml；dmso0.2～0.7ml/ml、海藻糖0.1～0.4mg/ml、聚乙二醇(peg)0.1～0.4g/ml、重组人白介素-2200～1000iu/ml。

在本发明的实施例中，右旋糖酐为低分子量(40kd)右旋糖苷。

在本发明的实施例中，聚乙二醇(peg)的分子量为6000。

在本发明的实施例中，基础培养基为rpmi-1640。

作为优选，每10ml细胞冻存液中包括胎牛血清5ml(50体积％)、低分子右旋糖苷0.25g、dmso1ml、海藻糖10mg、聚乙二醇10mg、重组人白介素-22000iu，余量为基础培养基。

作为优选，每10ml细胞冻存液中包括胎牛血清4ml(40体积％)、低分子右旋糖苷0.3g、dmso0.5ml、海藻糖20mg、聚乙二醇20mg、重组人白介素-24000iu，余量为基础培养基。

作为优选，每10ml细胞冻存液中包括胎牛血清2.5ml(25体积％)、低分子右旋糖苷0.4g、dmso0.5ml、海藻糖30mg、聚乙二醇30mg、重组人白介素-28000iu，余量为基础培养基。

胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，能够提供蛋白酶抑制剂，可在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。多数研究者只关注异源动物血清的有害性，从而在冻存过程中将其用其它产品取代，却忽视了其包含的多种因子所发挥的不可替代的作用。本发明在不去除胎牛血清的情况下，添加了右旋糖酐，既应用了胎牛血清不可或缺的有益作用，又减少了血清的使用量，从安全性和经济性上都得到了提升。其中，添加的右旋糖酐亦是一种很好的保护剂，能够很好的维持渗透压，即使在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免因温度下降、渗透压改变而出现的细胞死亡现象。

二甲基亚砜(dmso)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。dmso在细胞冻存的应用历史中发挥了举足轻重的作用，同样是不可取代的。本发明为了规避高浓度dmso的有害性，添加了聚乙二醇和海藻糖，从而减少了dmso的使用量。聚乙二醇是一种非渗透性保护剂，可以在冰晶形成之前，优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。海藻糖可以与细胞膜形成玻璃态基质，具有稳定生物膜(细胞膜)和蛋白质结构及抗干燥的作用。三者联合可有效降低冻存液对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏成活率及延长冻存时间。

本发明还在冻存液中添加了重组人白介素-2(il-2)，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性和稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。

本发明提供的改良冻存液制备方法为：将右旋糖酐、海藻糖、聚乙二醇和重组人白介素-2依次加入胎牛血清后，加入dmso，制得细胞冻存液。

本发明提供的冻存液在冻存人外周血单个核细胞时应用。

本发明提供的细胞冻存液能够很好的维持人外周血单个核细胞在冻存期间的细胞活性，降低冻存和复苏过程对细胞造成的损伤。实验表明，采用该冻存液冻存人外周血单个核细胞一个月后，细胞复苏后活力可达94.62％，且增殖活力良好。显著优于现有技术。

本发明还提供人外周血单个核细胞的冻存方法，以本发明提供的冻存液冻存人外周血单个核细胞。

在本发明的实施例中，细胞冻存液于4℃预冷。

在本发明的实施例中，冻存方法为直接-80℃冻存。

在本发明的对比例中，应用程序性降温的降温梯度为：

a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；

b.以5℃/min降至0℃，保持5min；

c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；

d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；

e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；

f.结束。

在本发明的实施例中，人外周血单个核细胞在本发明提供的冻存液中的密度为5×10⁷个/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明通过添加右旋糖酐，使细胞在温度下降的过程中，维持良好的渗透压环境，减少动物血清的使用，提升安全性，并具有一定的经济效益；

2.本发明通过添加适量的海藻糖、聚乙二醇可以减少二甲基亚砜的使用量，通过渗透性保护剂及非渗透性保护剂的双重作用，保证细胞在接近冰点时胞内的水分不会结晶，能有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性；

3.本发明通过添加重组人白介素-2能够有效维持细胞的活性，保证细胞复苏后正常的生物学功能。

4.本发明所述的改良冻存液可直接-80℃冻存，操作简便，摆脱了程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法，也无需购置昂贵的程序性降温仪，大大节约了操作成本，更适合临床应用。

本发明的人外周血单个核细胞改良冻存液安全性高，对细胞的损伤小，能够保证冻存后的细胞在复苏后具有较高的活率和较强的细胞活性。

本发明所述的冻存液，在医疗安全柜中按配方比例进行制备，省时省力，且稳定性好、质量可控、具有较长的货架期等显著优点。

附图说明

图1示实施例4与对比例2～3的单个核细胞复苏回收率图；

图2示实施例4与对比例2～3的单个核细胞复苏活率图；

图3示实施例4和对比例2的细胞复苏后增殖情况对比图；

图4示实施例4和对比例2的细胞诱导为cik细胞的细胞表型对比情况。

具体实施方式

本发明提供了一种改良细胞冻存液及其应用于人外周血单核细胞的冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得，其中低分子右旋糖苷40、重组人白介素-2为临床广为应用的注射液，海藻糖、聚乙二醇为医药应用级别。

人外周血单核细胞的分离方法为：1.外周血的预处理：将加入抗凝剂的外周血移入离心管中，750g，10min离心，弃去上层血浆，下层细胞加入等体积的pbs溶液，混匀获得细胞悬液；2.将ficoll分离液加入到离心管中；3.将所述细胞悬液平铺到分离液上，在8～25℃600～800g，20～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得人外周血单个核细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

配置母液

低分子右旋糖酐母液：购自西安万隆制药股份有限公司，质量分数为10％，即每1ml含右旋糖酐40100mg。

海藻糖母液：把10mg海藻糖粉末充分溶解于0.5ml基础培养基中，使其充分溶解。

聚乙二醇母液：把10mg聚乙二醇6000粉末充分溶解于0.5ml基础培养基中，使其充分溶解。

重组人白介素-2：购自北京远策药业有限责任公司，规格为100万iu/支。取1支il-2加入250ml基础培养基中，制备重组人白介素-2稀释液。

把2.5ml低分子右旋糖酐母液、0.5ml海藻糖母液、0.5ml聚乙二醇母液、0.5ml重组人白介素-2稀释液依次添加至5mlfbs中，最后把1mldmso缓慢滴加至fbs中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例2

配置母液

低分子右旋糖酐母液：购自西安万隆制药股份有限公司，质量分数为10％，即每1ml含右旋糖酐40100mg。

海藻糖母液：把20mg海藻糖粉末充分溶解于0.5ml基础培养基中，使其充分溶解。

重组人白介素-2：购自北京远策药业有限责任公司，规格为100万iu/支。取1支il-2加入250ml基础培养基中，制备重组人白介素-2稀释液。

把3ml低分子右旋糖酐母液、0.5ml海藻糖母液、1ml聚乙二醇母液、1ml重组人白介素-2依次添加至4mlfbs中，最后把0.5mldmso缓慢滴加至fbs中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例3

配置母液

低分子右旋糖酐母液：购自西安万隆制药股份有限公司，质量分数为10％，即每1ml含右旋糖酐40100mg。

海藻糖母液：把30mg海藻糖粉末充分溶解于1ml基础培养基中，使其充分溶解。

聚乙二醇母液：把30mg聚乙二醇6000粉末充分溶解于1ml基础培养基中，使其充分溶解。

重组人白介素-2：购自北京远策药业有限责任公司，规格为100万iu/支。取2支il-2加入250ml基础培养基中，制备重组人白介素-2稀释液。

把4ml低分子右旋糖酐母液、1ml海藻糖母液、1ml聚乙二醇母液、1ml重组人白介素-2依次添加至2.5mlfbs中，最后把0.5mldmso缓慢滴加至fbs中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

对比例1

将1mldmso缓慢滴加至9mlfbs中，轻轻吹打混匀，放置4℃冰箱进行保存。

实施例4

将人外周血单个核细胞按5×10⁷个/管分装至3支标记好的15ml离心管中，400g离心6min，离心后弃上清；加入10ml生理盐水重悬清洗，300g离心5min，弃上清；重复清洗一次，弃上清。轻轻震荡管底，并把于4℃预冷的冻存液(实施例1～3)分别加入上述离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别装至3支冻存管中，每管密度为2×10⁷个细胞/ml。1ml/管，并做好相应标记。

将发明组冻存管放入-80℃过夜，次日转移至液氮中冻存。

对比例2

将人外周血单个核细胞按5×10⁷个/管分装至3支标记好的15ml离心管中，400g离心6min，离心后弃上清；加入10ml生理盐水重悬清洗，300g离心5min，弃上清；重复清洗一次，弃上清。轻轻震荡管底，并把于4℃预冷的冻存液(对比例1)分别加入上述离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别装至3支冻存管中，每管密度为2×10⁷个细胞/ml。1ml/管，并做好相应标记。

将发明组冻存管放入程序降温仪中，设置以下降温梯度：a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；b.以5℃/min降至0℃，保持5min；c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。程序结束后转移至-80℃过夜，次日转移至液氮中冻存。

对比例3

将人外周血单个核细胞按5×10⁷个/管分装至3支标记好的15ml离心管中，400g离心6min，离心后弃上清；加入10ml生理盐水重悬清洗，300g离心5min，弃上清；重复清洗一次，弃上清。轻轻震荡管底，并把于4℃预冷的冻存液(实施例1～3)分别加入上述离心管中，轻轻吹打重悬细胞，分别装至3支冻存管中，每管密度为2×10⁷个细胞/ml。1ml/管，并做好相应标记。

将发明组冻存管放入程序降温仪中，设置以下降温梯度：a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；b.以5℃/min降至0℃，保持5min；c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。程序结束后转移至-80℃过夜，次日转移至液氮中冻存。

实施例5

将实施例4和对比例2～3在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏：取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在lmin内80％溶解，将细胞吸到一定量1640培养基中，并洗涤冻存管1次，移入15ml离心管中，300g离心5min。弃上清，加入适量培养基，轻轻混匀，留取500μl用血球计数板计数。采用公式：pbmc细胞回收率＝(洗脱后细胞数/冻存时细胞数)×100％计算pbmc回收率。复苏后pbmc回收率如图1所示。

结果表明，应用本发明提供的冻存液冻存的pbmc细胞复苏后，pbmc回收率较常规dmso+血清的冻存液组显著提高；应用本发明提供的冻存液直接-80℃冻存与采用程序降温法冻存细胞，两者pbmc回收率差异并不显著。

实施例6

将实施例4和对比例2～3在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏：取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在lmin内80％溶解，将细胞吸到一定量1640培养基中，并洗涤冻存管1次，移入15ml离心管中，300g离心5min。弃上清，加入适量培养基，轻轻混匀，留取500μl做计数测细胞活性。用台盼蓝染色计数活细胞，细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合均匀(终浓度0.04％)，然后用血球计数板进行计数。镜下观察计数板中四个象限活细胞数(c)和被染成蓝色的死细胞术(n)，采用下列公式计算细胞活性：活细胞率(％)＝[100-10n/c]×100％。复苏后细胞活力如图2所示。

结果表明：应用本发明提供的冻存液冻存的pbmc细胞复苏后，细胞活率较常规dmso+血清的冻存液组大大提高，差异具有统计学意义(p<0.05)；应用本发明提供的冻存液直接-80℃冻存较采用程序降温法冻存细胞活率稍有所减低，但两者之间的差异并无统计学意义。

实施例7

将实施例4和对比例2中在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏，具体步骤不再赘述，将复苏后的细胞以相同条件培养两周，观察其增殖情况。结果如图3。

结果表明：应用本发明提供的冻存液冻存的pbmc细胞复苏后细胞增殖速度较快，由此可知本发明提供的改良冻存液可以很好地保证细胞活力及复苏后的增殖状态。

实施例8

将实施例4和对比例2中在液氮罐中保存一个月的细胞进行复苏，具体步骤不再赘述，将复苏后的细胞加入同等条件的cd3单抗、nifn-g、il-2等混合细胞因子诱导培养成cik细胞，2周后观察各组cik细胞表型情况，结果如图4。

结果表明：发明组细胞复苏后诱导的cik细胞中总t细胞cd3⁺及cd3⁺cd8⁺、cd3⁺cd56⁺双阳性细胞比例较对照组显著增加，说明应用本发明提供的包含重组人白介素-2的改良冻存液冻存pbmc细胞可大幅度提高复苏后培养杀伤性免疫细胞的活性和稳定性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。