一种双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂及制备方法及应用与流程

本发明属于食品安全领域，涉及一种协同抗菌剂，具体是利用枸杞多糖的抗菌作用和双赖氨酸对多糖的静电相互作用，制成安全无毒、稳定高效的协同抗菌剂。

背景技术：

随着人们消费水平和生活水平的提高，人们对自身健康和保健等方面的关注程度越来越大，尤其在食品生产加工方面，也越来越趋向“绿色”和“天然”方向的转变。防腐剂是食品工业中重要添加剂之一，在如今世界上的食品工业中以化学合成防腐剂最为常见，其可能导致的癌症、畸形和容易引起食物慢性中毒等问题已在社会各界引起了广泛的关注。因此，加快研发天然、安全的功能性食品防腐剂就显得越来越重要。由于人们开始关注食品添加剂的安全性，从而对天然食品添加剂寄予厚望，开发天然安全多功能的食品添加剂是食品工业的发展方向。双赖氨酸，又名赖氨酰赖氨酸(lysyllysine，l-lys-l-lys，kk)是由两个赖氨酸残基组成的二肽，属于短阳离子二肽。与长链肽相比，阳离子短肽的制备简单，产率较高，成本低，有利于批量合成，并且抗菌肽大多为阳离子肽，是理想的抗菌制剂。已知一些二肽具有生理学或细胞信号传导作用，双赖氨酸信号在功能蛋白转运过程中起到定位高尔基体或内质网的重要作用，目前国内外只聚集于双赖氨酸在生理代谢方向的研究，对于其抑菌作用的研究较少。因为其是由氨基酸组成，安全无毒，因此具有广阔的开发利用前景。

枸杞为我国“药食同源”的名贵中草药之一，具有多种保健功效，被广泛用于功能性食品的研究与开发。枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharide，lbp)是枸杞的主要功能成分，主要成分有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖等多种糖类，是一种酸性多胜肽杂多糖蛋白复合物，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳及调节免疫等生理功效。近年来人类医学研究在枸杞多糖生物活性方面已取得一定成果，研究的广度和深度也在不断深入。据报道多种植物多糖具有抑菌作用，已发现枸杞多糖对几种常见肠道致病菌和霉菌都有一定的抑制作用，并且随着浓度的增大，抑菌效果越明显。另外在含枸杞食品中，增加枸杞多糖含量可有效防止肠道致病菌的滋生。在食品行业可将枸杞多糖作为食品添加剂或制成果蔬涂抹保鲜剂，抑制食品中常见微生物的生长。我国枸杞产量大、品质好、枸杞多糖含量高，提取工艺简单，对枸杞多糖的研究开发必将提高其产品附加值，具有良好的市场价值。

食品中的大多数多糖和蛋白质在加工储藏中常常伴有丰富的构象转变和凝胶行为,多糖/蛋白质静电复合对多糖构象转变的影响与蛋白质的分子量密切相关。当蛋白质(多肽)的分子量小于1000da时,静电复合对多糖的螺旋结构起到稳定作用，该结论为调控电荷多糖的凝胶行为和凝胶性质开辟了新的技术途径。因此在结合枸杞多糖抗菌活性的基础上，引入双赖氨酸二肽，从而增强多糖结构的稳定性，制备更加稳定、高效和天然的抗菌剂。

国内有很多关于枸杞多糖的专利申请。中国专利cn108619273a公开了一种用于治疗幽门螺杆菌的植物果核口服液的制备方法；中国专利cn105797219a公开了一种生物补片及其制备方法；中国专利cn109876154a公开了一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究；中国专利cn109805147a公开了一种红枸杞多糖咀嚼片及其制备工艺,但是关于双赖氨酸的专利还没有。

将双赖氨酸与枸杞多糖相结合，制备得到具有优良抗菌效果的抗菌剂，具有较好的应用前景和市场价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双赖氨酸和枸杞多糖协同作用的抗菌剂及制备方法和其在生活安全领域中的应用。

本发明所述的协同抗菌剂制备方法：首先将枸杞多糖干粉溶解后，配成母液，稀释成不同浓度的枸杞多糖应用液后加入固体双赖氨酸干粉，经磁力搅拌1h后，在30％的超声波功率即300w下超声15min以获得分散均匀的双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂，然后经0.22μm的孔径滤膜将所得的抗菌剂溶液过滤除菌，贮于4℃或-20℃备用。

所述的枸杞多糖母液的制备方法：将枸杞多糖干粉溶解于无菌去离子水中，配成1.0mg/ml的母液，临用前稀释成不同浓度的多糖应用液。

所述获得分散均匀的双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂中所含有的固体双赖氨酸干粉的浓度为3.3-8.3mg/ml,所述的协同抗菌剂中枸杞多糖粉末的终添加浓度为0.4-1.0mg/ml。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.想法新颖，在食品保鲜领域具有广泛的开发应用前景：本发明首次提出了将双赖氨酸和枸杞多糖进行协同抗菌的实施方法，在结合枸杞多糖抗菌活性的基础上，引入双赖氨酸二肽，从而增强多糖结构的稳定性，制备更加稳定、高效和天然的抗菌剂。

2.方法简单，成本低廉，实用性强：本发明的双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂的使用材料易于获得，配制、操作方法简单，对生产工艺、设施的要求低，实用性强，可适应规模化生产的需求。

3.本发明制备的双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑菌抗菌性，尤其是对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能。

附图说明

图1双赖氨酸和枸杞多糖协同作用对大肠杆菌的抗菌效果。

图2双赖氨酸和枸杞多糖协同作用对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

图3双赖氨酸和枸杞多糖协同作用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂的制备方法

1一种双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂，通过如下步骤配制而成：

1)将枸杞多糖干粉溶解于去离子水中，配成1.0mg/ml的母液；

2)在步骤1)所述母液用去离子水进行稀释，配置为浓度分别为0.4-1.0mg/ml的多糖应用液；

3)将步骤2)所得多糖应用液中加入固体双赖氨酸干粉，充分混匀，经磁力搅拌1h后，在30％的超声波功率下超声15min以获得分散均匀的双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂；

4)将步骤3)所得溶液经0.22μm孔径滤膜过滤除菌，置于4℃或-20℃保存备用。

所述组分的纯度要求为：所述的协同抗菌剂中固体双赖氨酸干粉的浓度为3.3-8.3mg/ml，枸杞多糖粉末的终添加浓度为0.4-1.0mg/ml。

2双赖氨酸抗菌剂的制备方法

首先称取0.02g的固体双赖氨酸干粉溶解于2ml的无菌去离子水中，25℃旋涡震荡2min，充分溶解获得浓度为10mg/ml的母液，经过去离子水稀释获得浓度为3.3-8.3mg/ml的双赖氨酸应用液。

3枸杞多糖抗菌剂的制备方法

将枸杞多糖干粉溶解于去离子水中，配成1.0mg/ml的母液，将所得母液用去离子水进行稀释，配置为浓度分别为0.4-1.0mg/ml的多糖应用液。

实施例2双赖氨酸和枸杞多糖协同作用对大肠杆菌的抗菌性能评价

1实验菌

食源性病源菌：大肠杆菌(escherichiacoliifo3301)；金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus30179)

2实验材料

1)双赖氨酸抗菌剂

2)枸杞多糖抗菌剂

3)双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂

2实验仪器

3实验方法

在磷酸盐缓冲液中[phosphate-bufferedsaline,pbs,0.03mol/l,ph(7.2-7.4)]中加入双赖氨酸/枸杞多糖抗菌剂，其中双赖氨酸(kk)的有效浓度为3.3mg/ml，枸杞多糖(lbp)的有效浓度为0.4mg/ml，并分别接入供试菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(10⁸-10⁹cfu/ml)，振荡均匀后，在37℃全温空气摇床中振荡(120r/min)培养。以只加等体积pbs溶液的为空白对照组，只加枸杞多糖不加双赖氨酸的为lbp组,只加双赖氨酸不加枸杞多糖的为kk组，以加入双赖氨酸与枸杞多糖协同抗菌剂为lbp/kk组，用平板菌落计数法测定残存菌数。分别在0h、24h时取适量培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μl稀释液滴到固体培养基上，涂布均匀之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。48h后进行平板菌落计数，从而对抗菌剂的抗菌活性进行评价。实验重复三次，结果取平均值。

4实验结果

如图1、图2所示，在只加入3.3mg/ml双赖氨酸作用24h后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数分别从6.88logcfu/ml和7.78logcfu/ml分别下降至4.18logcfu/ml和3.38logcfu/ml，杀菌率达到99.9％和99.99％；只加入枸杞多糖处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数分别从6.88logcfu/ml和7.79logcfu/ml分别下降至3.65logcfu/ml和4.65logcfu/ml，杀菌率达到99.9％和99.9％；而经枸杞多糖/双赖氨酸协同抗菌剂作用后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数分别下降至1.10logcfu/ml和0.69logcfu/ml，杀菌率达到99.999％和99.9999％，结果表明经枸杞多糖/双赖氨酸协同抗菌剂的抗菌效果较抗菌剂单独作用时更强。

实施例3双赖氨酸和枸杞多糖协同作用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果

1实验菌

院内感染病原菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa(methicillin-resistantstaphylococcusaureust34)；

2实验材料

1)双赖氨酸抗菌剂

2)枸杞多糖抗菌剂

3)双赖氨酸/枸杞多糖协同抗菌剂

2实验方法

在磷酸盐缓冲液中[phosphate-bufferedsaline,pbs,0.03mol/l,ph(7.2-7.4)]中加入双赖氨酸/枸杞多糖抗菌剂，其中双赖氨酸的有效浓度为3.3mg/ml，枸杞多糖的有效浓度为0.4mg/ml，接入供试菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa(10⁸-10⁹cfu/ml)，加入后振荡均匀，在37℃全温空气摇床中振荡(120r/min)培养48h，以只加等体积pbs溶液的为空白对照组，只加枸杞多糖不加双赖氨酸的为lbp组,只加双赖氨酸不加枸杞多糖的为kk组，以加入双赖氨酸与枸杞多糖协同抗菌剂为lbp/kk组，用平板菌落计数法测定0h、24h的残存菌数。

3实验结果

由图3可知，在只加入枸杞多糖作用24h后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌数从8.26logcfu/ml降至5.43logcfu/ml，杀菌率达到99.9％；在只加入双赖氨酸作用24h后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌数从8.22logcfu/ml降至5.21logcfu/ml，杀菌率达到99.9％；而在双赖氨酸/枸杞多糖协同作用后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌数从8.29logcfu/ml下降至3.80logcfu/ml，杀菌率达到99.998％。结果表明，双赖氨酸/枸杞多糖抗菌剂相比单独的双赖氨酸和枸杞多糖，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)抗菌效果更好，这也证实了枸杞多糖与双赖氨酸协同后能够进一步提高抗菌性能。