一种双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂及制备方法和应用与流程

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂及制备方法和应用。

背景技术：

消灭和控制有害细菌的生长和繁殖，在当今仍是科技领域的重要课题。目前，抗菌剂的种类主要包括无机抗菌剂，有机抗菌剂和天然抗菌剂。而复合抗菌剂由于可解决单一抗菌剂的抗菌性能缺陷，并结合其它抗菌剂抗菌性能的优点成为了新的研究热点。

枸杞是我国的传统名贵中药材，系落叶灌木，果实枸杞子味甘、性平，有滋肾补髓、养肝明目和祛风的作用。研究表明，枸杞含有多种营养成分和微量元素，主要包括糖类、氨基酸、微量元素、蛋白质、维生素、脂肪、脂肪酸、甾醇类等。因此，枸杞具有多重生理和药理功能。枸杞多糖是枸杞中的主要有效成分。国内对枸杞多糖的提取分离、理化作用及临床应用等进行了大量研究。王建华(2002)报道了枸杞多糖可直接清除羟自由基，且由其引发的脂质过氧化。高春燕等(2006)报道了枸杞多糖对常见几种细菌、霉菌均具有一定抑制效果。

双组氨酸(dihistidine,his-his,hh)结构中包括两个苯环，其两端分别是-nh2和-cooh，故其在等电点时以兼性离子形式存在。它是一种新型的生物自组装材料之一,也是制备生物功能性纳米材料的重要基元。

本发明将枸杞多糖和双组氨酸复配得到了一种新型抗菌剂，一方面可提高抗菌效果，另一方面可克服单独使用双组氨酸时高成本的缺点和单独使用枸杞多糖时抗菌种类有限、抑菌效果一般的缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂及制备方法和其在食品安全领域的应用。

本发明的制备方法是先提取枸杞多糖，然后将枸杞多糖溶液和双组氨酸溶液按比例混合，搅拌得到复合抗菌剂。

所述枸杞多糖的提取方法是先对枸杞进行预处理，即将枸杞在70℃恒温干燥24h，剪碎后乙醇回流脱脂两次，每次3h，所得残渣风干后既为枸杞样品；然后将其在蒸馏水中浸泡4h之后，水浴(80℃)提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3次，弃去残渣，合并滤液，旋转蒸发浓缩(70℃)，然后离心(3000r/min，30min)弃去残渣，上清液为多糖溶液。将多糖溶液真空冷冻干燥(-80℃)24h，得到枸杞多糖。

所述枸杞多糖溶液是将枸杞多糖溶于无菌蒸馏水中，使枸杞多糖浓度为35-45mg/ml。

所述双组氨酸溶液的制备是先将双组氨酸溶解于乙醚中，然后置于磁力搅拌器以200rpm的转速搅拌1min，最后加入无菌蒸馏水，使双组氨酸溶液浓度为25-35mg/ml。

所述复合抗菌剂的制备是将枸杞多糖溶液和双组氨酸溶液复配，按质量分数计算，双组氨酸溶液0.5％-2.0％，枸杞多糖溶液1.0％-3.0％，余量为无菌蒸馏水，混合后以200rpm的转速磁力搅拌10min制得复合抗菌剂。

通过两者的协同作用得到更优的抗菌活性，解决单独使用双组氨酸抗菌剂成本高及单独使用枸杞多糖抗菌活性低的缺点。

附图说明

图1本发明的复合抗菌剂在pbs中对大肠杆菌和金黄色葡萄的抗菌效果。

图2本发明的复合抗菌剂在猪肉中对大肠杆菌和金黄色葡萄球的抗菌结果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1枸杞多糖的制备

1实验材料与设备

2.试验方法

冷枸杞多糖的提取步骤如下：

所述枸杞多糖的提取方法是先对枸杞进行预处理，即将枸杞在70℃恒温干燥24h，剪碎后乙醇回流脱脂两次，每次3h，所得残渣风干后既为枸杞样品。然后将其浸泡4h之后水浴(80℃)提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，然后离心(3000r/min，30min)弃去残渣，上清液为多糖溶液。将多糖溶液真空冷冻干燥，得到枸杞多糖。

1)即将枸杞在70℃恒温干燥24h，剪碎后乙醇回流脱脂两次，每次3h,将所得残渣风干即得预处理样品。

2)称取一定量预处理枸杞，将其浸泡4h之后水浴(80℃)提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3次。

3)弃去残渣，合并滤液，将滤液放入旋转蒸发仪中，温度为70℃，将滤液浓缩至原有体积的1/4。

4)将浓缩液离心(3000r/min，30min)弃去残渣，上清液为多糖溶液。

5)多糖溶液置于冷冻干燥机中-80℃，20pa冷冻干燥24h，得到枸杞多糖粉末。

实施例2双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂的制备

1实验材料与设备

2.试验方法

双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂的制备方法如下：

1)将双组氨酸溶于乙醚后置于磁力搅拌器上室温搅拌(200rpm)1min。

2)加入蒸馏水使双组氨酸溶液浓度为30mg/ml。

3)将枸杞多糖溶于无菌蒸馏水中，使枸杞多糖浓度为40mg/ml。

4)按比例混合；两种溶液，按质量分数计算，双组氨酸溶液1.0％，枸杞多糖溶液2.0％，余量为无菌蒸馏水，混合后磁力搅拌10min(200rpm),得到复合抗菌剂。实施例3双组氨酸/枸杞多糖复合抗菌剂抗菌能力评价

1实验材料与设备

2实验方法

1)体外抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌效果评价

①e.coli和s.aureus接种于营养肉汤液体培养基中，37℃分别振荡(150rpm)培养24h和48h。

②将对数生长期的e.coli和s.aureus加入到无菌磷酸缓冲液中，梯度稀释至10⁴-10⁵cfu/ml，然后添加抗菌剂(复合抗菌剂、双组氨酸溶液和枸杞多糖溶液)，使e.coli菌悬液中抗菌剂质量分数为0.5％，s.aureus菌悬液中抗菌剂质量分数为0.25％。

③将添加了抗菌剂的细菌悬浮液在37℃条件下培养3d，然后利用平板计数法每24h测定残存菌数。不做任何处理的e.coli和s.aureus菌悬液作为空白组。

2)在猪肉中的抗菌效果评价

①称取一定量的新鲜猪肉于均质袋中，按猪肉和pbs质量比为1:9加入到均质袋，使用均质机进行均质破碎，再使用纱布进行过滤后等体积分装至试管中得猪肉肉汤，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

②向各试管分别接种e.coli和s.aureus，使试管中e.coli和s.aureus浓度为10³cfu/ml。

③添加抗菌剂(复合抗菌剂、双组氨酸溶液和枸杞多糖溶液)至试管中，使e.coli菌悬液中抗菌剂质量分数为0.65％，s.aureus菌悬液中抗菌剂质量分数为0.5％。不做任何处理的e.coli和s.aureus作为空白。

④将试管放入37℃的恒温培养箱中培养3天，每隔24h计算其残存菌数。

3.试验结果

1)体外抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌效果评价

由图1可以看出，枸杞多糖、双组氨酸和复合抗菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都起到了抑制效果，其中复合抗菌剂的抗菌效果最佳，处理3d后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率分别达到97.84％和99.49％。

2)在猪肉中的抗菌效果评价

猪肉汤中含有丰富的营养物质，可以促进大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增长繁殖。由图2可以看出，空白组菌落数在1d迅速上升后趋于稳定。且与单一抗菌剂相比复合抗菌剂在猪肉肉汤中也有较好的抗菌效果。3d后，与空白组相比，复合抗菌剂组大肠杆菌杀菌率达98.95％，复合抗菌剂组金黄色葡萄球菌杀菌率达99.96％。