来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用。
背景技术：
：蛋白类激发子是源于细菌、真菌分泌的一些蛋白，主要包括过敏蛋白(harpin)、隐地蛋白(cryptogein)、激活蛋白(activator)等。可通过诱导植物防御相关基因的表达和激活植物体内防御信号途径如水杨酸等来激发植物获得抗性，增强植物自身免疫能力来抵抗病原微生物的侵染。截止目前为止发现了许多新的蛋白类的激发子，但目前未发现帚枝霉属真菌中可诱导植物产生抗病性的激发子蛋白及其编码基因的有关报道。技术实现要素：本实验室从臂形草叶片中分离得到的高效生防菌株，帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5。在对hnd5菌株进行了全基因组测序，通过生物信息学分析时，从其基因组中发现并鉴定得到了一个编码外泌激发子的基因，将其编码的激发子蛋白命名为sbes。基于此，本发明的目的是提供一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在木薯生防上的应用，具体是激发子蛋白及其编码基因在诱导木薯产生抗病性或者提高木薯的抗病性中的应用，或者在诱导橡胶、木薯、香蕉、黄瓜对病虫害产生防御反应中的应用。所述激发子蛋白，来源于帚枝霉属内生真菌(sarocladiumbrachiariae)菌株hnd5，名称为sbes，是如下1)或2)或3)的蛋白质：1)由序列表中的seqid№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)由序列表中seqid№.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列表中的seqid№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由seqid№：1衍生的蛋白质。序列表中的seqid№.1由387个氨基酸残基组成。为了便于seqid№.1编码的sbes纯化，可在由序列表中seqid№.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述sbes可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述sbes的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第1-1164位碱基所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5激发子蛋白(sbes)的编码基因的序列如下所述所述帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5激发子蛋白的cdna为如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码所述帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5激发子蛋白的dna分子；3)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。序列表中序列2全长为1164个核苷酸，编码一个长度为387个氨基酸(序列表中序列1)、分子量约为39kd的蛋白，即为帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5激发子蛋白(sbes)，1-45个碱基为sbes蛋白信号肽编码序列，46-315个碱基是前肽编码序列，316-1164个碱基是外泌成熟多肽编码序列。所述帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5激发子蛋白(sbes)的基因组基因的核苷酸序列如下1)、2)、或3)所示：1)序列表中seqid№：3的核苷酸序列；2)在严格条件下可与1)所述的dna序列杂交的核苷酸序列；3)与序列表中seqid№：3的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。序列表中序列3全长为1375个核苷酸，自序列3的5’端第1-276位核苷酸是第一个外显子，第277-341位核苷酸是第一个内含子，第342-527位核苷酸是第二个外显子，第528-595位核苷酸是第二个内含子，第596-1102位核苷酸是第三个外显子，第1103-1179位核苷酸是第三个内含子，第1180-1375位核苷酸是第四个外显子，编码序列表中序列1所示的蛋白质。上述严格条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。所述编码基因还可以是密码子优化的核苷酸，如所述编码基因可以为序列表中序列4，该序列可在毕赤酵母中表达上述激发子蛋白，并且，通过密码子优化使表达量增加并且表达活性也很高。所述应用中，所述诱导产生防御反应为引起的micro-hr反应、诱导叶片过氧化氢的积累、诱导叶片胼胝质的积累和/或激发植物抗病基因的表达。上述蛋白质或其编码基因在制备预防木薯病虫害的药物中的应用也属于本发明的保护范围。所述应用中，所述病虫害为病害，所述病害优选为多地毯草黄单胞(xanthomonasaxonopodis)引起的病害。所述的激发子蛋白及其编码基因作为激发子蛋白激发植物防卫反应、过敏反应和/或激发植物抗病基因表达中的应用、和/或在作为蛋白农药来防御病虫害的侵害中的应用，均属于本发明的保护范围，所述植物为橡胶、木薯、香蕉、黄瓜。本发明还保护一种提高植物抗病性的方法，是是使用下述激发子蛋白防治植物病害：所述激发子蛋白是如下1)或2)或3)所示的蛋白质：1)由序列表中的seqid№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)由序列表中的seqid№.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；3)将1)或2)中所述的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由seqid№：1衍生的蛋白质；所述植物病害为优选为地毯草黄单胞(xanthomonasaxonopodis)引起的木薯病害；使用所述激发子蛋白提高植物抗病性的方式是将所述蛋白质喷施于橡胶、木薯、香蕉或黄瓜上或者注射在植物组织上。所述激发子蛋白可以体外合成获得，具体方法为利用可以表达所述激发子蛋白的重组表达载体，转入酵母中获得获得表达激发子蛋白的转基因重组菌；所述酵母优选为毕赤酵母x-33菌株。所述表达所述激发子蛋白的重组表达载体将序列表中序列4所述的核苷酸片段插入到出发载体获得的表达激发子蛋白的重组载体，所述出发载体优选为pricza。上述激发子蛋白具有诱导诱导木薯产生对地毯草黄单胞(xanthomonasaxonopodis)引起的细菌性萎蔫病抗性的活性，可以降低木薯细菌性萎蔫病发病率及病情指数，为一种具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白。它能够引起植物防卫反应，通过与植物细胞表面或亚细胞表面的受体结合激活植物体内的级联信号系统以及诱导防卫基因的表达等防御机制在抗病信号途径中发挥作用，具有化学农药所不具备的优势和特点，可作为一种新型微生物蛋白农药来防御病虫害的侵害。附图说明图1为实施例2中his-sbes融合蛋白的sds-page蛋白胶图。图2为实施例3中sbes蛋白对地毯草黄单胞(xanthomonasaxonopodis)引起的木薯病害。其中，a为空白对照喷雾处理后接种病原菌发病图，b为sbes蛋白处理雾处理后接种病原菌发病图，c为阿泰灵处理喷雾处理后接种病原菌发病图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、激发子蛋白sbes的编码基因及其cdna的克隆本实验室从臂形草叶片中分离得到的一株高效生防菌株，经鉴定为帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariae，命名为帚枝霉属内生真菌sarocladiumbrachiariaehnd5(liux,guoz,huangg:sarocladiumbrachiariaesp.nov.,anendophyticfungusisolatedfrombrachiariabrizantha.mycosphere2017,8:827-834.)。本发明的发明人，将该菌株进行全基因组测序数据的基础上，通过与亲缘属真菌已报道激发子序列进行比对分析，发现并鉴定得到的可能提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白基因。本发明的激发子蛋白基因全长编码dna和全长cdna片段的获得方法如下所述：以sarocladiumbrachiariaehnd5菌株提取的总dna为模板，设计特异引物sbes-f和sbes-r，利用pcr技术扩增获得sbes基因的全长编码dna片段；已sarocladiumbrachiariaehnd5菌株提取的总rna为模板，设计特异引物sbes-f和sbes-r，利用rt-pcr技术扩增获得sbes基因的全长cdna片段。引物序列如下：sbes-f：5′-atgcgtttctcactcgtcct-3′；sbes-r：5′-ttaaccagaggggttgccgt-3′。在pda培养基上生长3天的sarocladiumbrachiariaehnd5菌株，收集菌丝后提取基因组dna。以基因组dna为模板，用sbes-f和sbes-r组成的引物对进行pcr扩增(靶序列约1375bp)。pcr扩增体系为：2.5μl的10×pcrbuffer(mg2+free)，1.8μlmgcl2(25mm),0.5μl的dntps(10mm)，0.2μltaq酶(5u/μl)，1.0μl模板基因组dna，正向引物和反向引物(10mm)各加0.5μl，加ddh2o补足25μl。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃50s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将pcr扩增产物回收连接pmd18-t载体(takara)，转化大肠杆菌dh5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列3所示，转录生成序列表的序列2所示的cdna扩增片段(序列2和序列3均可以通过人工合成获得)。在pda培养基上生长7天的sarocladiumbrachiariaehnd5菌株，收集菌丝后提取总rna并反转录得到cdna。以cdna为模板，用sbes-f和sbes-r组成的引物对进行pcr扩增(靶序列约1164bp)。pcr扩增体系为：2.5μl的10×pcrbuffer(mg2+free)，1.8μlmgcl2(25mm),0.5μl的dntps(10mm)，0.2μltaq酶(5u/μl)，1.0μl模板cdna，正向引物和反向引物(10mm)各加0.5μl，加ddh2o补足25μl。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃30s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将pcr扩增产物回收连接pmd18-t载体(takara)，转化大肠杆菌dh5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将经测序表明外源插入片段为序列2的重组质粒命名为pmd18-t/sbes。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为sbes蛋白。将编码sbes蛋白的基因命名为sbes基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。序列表中序列3全长为1375个核苷酸，自序列3的5’端第1-276位核苷酸是第一个外显子，第277-341位核苷酸是第一个内含子，第342-527位核苷酸是第二个外显子，第528-595位核苷酸是第二个内含子，第596-1102位核苷酸是第三个外显子，第1103-1179位核苷酸是第三个内含子，第1180-1375位核苷酸是第四个外显子，编码序列表中序列1所示的蛋白质。实施例2、sbes蛋白的真核表达与纯化一、基于毕赤酵母密码子偏好性的cdna序列优化为使用毕赤酵母x-33菌株进行sbes蛋白的异源表达，根据毕赤酵母的密码子偏好性，排除掉sbes蛋白的信号肽及前肽编码基因，对序列2的316-1164位核苷酸进行密码子优化，获得序列4，编码自序列表中序列1的氨基端第106-387位氨基酸所示的蛋白质。序列4由北京华大生物技术有限公司负责合成。二、真核表达载体构建用引物sbes-pf和sbes-pr进行配对，以序列4为模板，扩增得到的片段连接到t载体上，命名为pmd18-t/sbesp；用ecorⅰ和kpnⅰ双酶切pmd18-t/sbesp，回收小片段插入到pricza相同的酶切位点间，得到的重组载体命名为pricza/sbes。菌落pcr和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pricza/sbes。该表达载体pricza/sbes表达的蛋白为由序列表中的seqid№.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质(携带his标签方便纯化)。所用引物序列如下：sbes-pf：5′-tcatggcttacactactcaatctgc-3′；sbes-pr：5′-gttgaaagccaatctgtcagcagta-3′。三、sbes蛋白的真核表达菌株构建提取pricza/sbes质粒用sacⅰ进行单酶切，使重组表达载体完全线性化，并回收线性化后的质粒片段。向80μl毕赤酵母x-33电击感受态细胞中添加10μg线性化后的pricza/sbes质粒，混匀后加入到0℃(提前放在冰上)的0.2cm的电转化杯中，冰上孵育5min后，将电转化槽置于bio-radpulser电转化仪上，进行电转化，采用电击转化仪中储存的毕赤酵母所设定转化参数进行电击。电击后，立即在电转化槽中加入1ml0℃的1msorbital，用移液器快速混合后把电转化槽中的混合物转入到灭过菌的1.5ml离心管中，并在30℃静置培养约1.5h。取200μl培养液涂布于含有100μg/mlzeocin的ypds平板上，待菌液被完全干后，将平板在28℃倒置培养4～6d，可见有菌落长出。验证正确后即得到sbes蛋白的毕赤酵母表达菌株。四、sbes蛋白的真核表达和蛋白纯化将sbes蛋白的毕赤酵母表达菌株接种于含有50mlbmgy培养基的锥形瓶中，于28℃，230r/min条件下震荡培养约20h(od600＝3.5左右)；将摇培好的菌液用50ml无菌的离心管收集，在25℃，2000g的条件下离心5min，弃上清液，将菌体转移至含有100mlbmmy培养基的锥形瓶中，并用四层无菌纱布封口，置于28℃，230r/min条件下震荡培养，进行诱导表达；每隔24h向培养物中加入100％甲醇，使其终浓度为1％，共诱导120h；收集1l发酵液的菌体，使用100mlpbsbuffer缓冲液(ph为6.5)重悬菌体，加入10μldna酶；菌体在冰水混合上采用新芝超声波细胞破碎仪进行破碎，程序为：150w，破碎5sec，暂停5sec，总用时30min，整个过程中隔10min重新混匀破碎结束后12000r/min，4℃，离心30min，所获上清为重组蛋白粗提物。利用gehealthcare的histrap亲和柱进行重组蛋白的纯化；使用10ml20mm咪唑平衡亲和柱后，按照2ml/min的流速，将重组蛋白粗提物进行过柱；依次使用40ml浓度为20mm，40mm，60mm，80mm咪唑的pbsbuffer洗脱亲和柱；用10ml浓度为200mm咪唑的pbsbuffer洗脱亲和柱，收集洗脱液，使用sds-page电泳检测蛋白质量；使用10kdamilliporeamiconultra-15超滤管，浓缩并将重组蛋白溶液置换为不含有咪唑的pbs缓冲液。结果见图1，经sds-page电泳，获得一个分子量约为32kd的his-sbes融合表达蛋白，与预测的大小一致。并且his-sbes融合蛋白富集在上清液里，纯化后的蛋白条带单一、无杂带。图1注：m为marker，泳道1为用20mm咪唑洗下的杂蛋白；泳道2为用40mm咪唑洗下的杂蛋白；泳道3为用60mm咪唑洗下的杂蛋白；泳道4为用80mm咪唑洗下的杂蛋白；泳道5为用200mm咪唑洗下的目的蛋白。实施例3、sbes蛋白对木薯细菌性萎蔫病的防治效果评价病原菌菌株：地毯草黄单胞(xanthomonasaxonopodis)菌株xamgx11(木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价[j].热带作物学报，2013，34(6)：1144-1148.)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得该菌株。木薯品种：sc10药剂：重组蛋白sbes(0.1mg/ml)、阿泰灵(3％寡糖蛋白·3％链隔孢激活蛋白wp)(中国农业科学院植物保护研究所)，对照为pbsbuffer缓冲液。药剂处理：将重组蛋白his-sbes浓度调至0.1mg/ml，喷雾处理木薯盆栽苗10株3次，间隔3d，阿泰灵处理组：阿泰灵(3％寡糖蛋白·3％链隔孢激活蛋白wp)稀释800倍喷雾处理、选用pbs缓冲液作为对照。3d后进行人工接种，保湿，5d后调查发病情况。处理3株，15张叶片。人工接种方法：接种菌液的浓度为od600值约为0.2，将7根大头针用橡皮筋捆绑成束针状用于针刺接种。采用针刺法接种木薯苗，自上而下选取生长期一致的完全成熟叶片，每株木薯选择3张复叶，每张复叶接种中间的5张小叶片中部，避开叶片主脉，每个处理接种3株木薯。病情统计和相对防效计算：分级标准：0级，无发病症状；1级，有发病症状且发病面积占接种面积的50％以下；2级，发病面积占接种面积的50％-100％；3级，发病面积占接种面积的100％-150％；4级，发病面积占接种面积的150％-200％；5级，发病面积占接种面积的200％以上。病情指数＝(∑各病斑病级数×相应病级数值)/(调查总病斑数×最高病害级别数)×100相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100结果如表2和图2所示，结果表明，sbes蛋白对木薯细菌性萎蔫病具有很优异的诱导抗性活性作用，其防治效果要显著优于阿泰灵。表2供试sbeb蛋白对木薯细菌性萎蔫病的防治效果序列表<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所<120>来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用<130>whoi201030<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>387<212>prt<213>帚枝霉菌(sarocladiumbrachiariae)<400>1metargleuserleuvalleualaleuleuproalaalaleuglyala151015prothrargargaspgluproalaproleuhisvalproargglyval202530aspserleuilelysaspthrtyrilevallystyrlysaspilethr354045alametseralavalaspgluglyleulysvalleuproglylyspro505560gluargvalphelysglyalaphelysglyphealaglylysileasp65707580alalysthrleugluleuleuargaspaspproservalasppheile859095gluglnaspalailevallysleualaalatyrthrthrglnserala100105110alaprotrpglyleualaargileserthrargglnargglyprothr115120125glytyrthrtyraspthrseralaglyglnglythrcyssertyrile130135140leuaspthrglyileglnalaserhispropheglyglyargalaphe145150155160glnleuilesertyrglnglyglyasnalaaspglyasnglyhisgly165170175thrhisvalalaglythrileglyserargthrtyrglyvalalalys180185190alathrthrleuleuglyvallysvalleuseraspserglysergly195200205serileserglyileileserglymetasntyrvalvalseraspser210215220argthrargsercysproargglyalaphealaasnmetserleugly225230235240glyglytyrseralaserleuasnseralaalalyssermetvalasp245250255asnglyvalpheleualavalalaalaglyasngluasnglnasnala260265270alaasnvalserproalasergluproservalcysthrvalglyala275280285thrthrserthraspalaargalaserpheserasntyrglyalaleu290295300valaspilephealaproglyglnglyileleuserthrtrpprogly305310315320serserthrasnthrileserglythrsermetalaserprohisile325330335alaglyleualaalatyrleualaglyleugluglyasnproglyala340345350seralametcysglyargileileglnleualathrthrglyvalile355360365thrglyleuproserglythralaaspargleualapheasnglyasn370375380prosergly385<210>2<211>1164<212>dna<213>帚枝霉菌(sarocladiumbrachiariae)<400>2atgcgtctctctctcgtcctcgcccttctccctgccgccctcggtgctcccacgaggcgc60gatgagcccgctccccttcatgttcctcgtggcgtcgacagcctgatcaaggacacctac120atcgtcaagtacaaggacattactgccatgtctgctgtcgatgaaggcctcaaggttctt180cccggcaagcccgagcgtgtcttcaaaggtgccttcaagggctttgctggcaagattgat240gccaagactctggagctcctccgtgatgatcccagtgtcgacttcattgagcaggatgct300atcgtgaagctcgctgcctacaccacccagtcggccgccccatggggccttgcccgtatc360tctactcgtcagcgtggtcctactggatatacgtacgacaccagcgctggtcaaggaaca420tgttcctacatcctcgacactggcattcaggccagccaccccttcggtggacgagccttc480cagctcatctcctaccaaggcggcaatgccgatggtaacggtcatggcactcacgttgcc540ggtaccattggctccagaacctacggtgttgccaaggctaccaccctgctcggtgtcaag600gtcctgagtgactcgggctctggctccatctctggcatcatctccggcatgaactatgtt660gtcagcgactctcgcacccgtagctgccctcgcggtgcattcgccaacatgtctctcggt720ggaggctactccgcctcgctcaacagcgctgccaagtccatggtagacaatggcgtcttc780cttgctg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