一种检测降温程序对人脐带间充质干细胞冻存效果影响的方法与流程

本发明涉及干细胞
技术领域：
，具体的更涉及一种检测降温程序对人脐带间充质干细胞冻存效果影响的方法。
背景技术：
：人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。人脐带间充质干细胞的种子库在临床上已经广泛应用，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞的冻存过程中无外源性污染是脐带间充质干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人脐带间充质干细胞无血清冻存液。人脐带间充质干细胞种子库细胞的长期活性与降温程序有密切关系，降温程序对人脐带间充质干细胞有着重要影响，当降温程序出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化，优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。技术实现要素：除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。本发明人为了解决上述问题经过认真研究后提供了检测降温程序对人脐带间充质干细胞冻存效果影响的方法，通过在一定的冻存液的存在下采用不同的程序降温步骤后，优选出最佳的降温程序条件使细胞冻存前后细胞存活率并未明显降低、存活率在97％以上，除此之外细胞数量仍然保持较高的浓度。本发明的检测降温程序对人脐带间充质干细胞冻存效果影响的方法，步骤包括，提供一种冻存液，取经p2代细胞复苏后的p3代人脐带间充质干细胞以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取1～5ml细胞悬液至程序降温仪中进行程序降温冻存。细胞冻存是最大限度的保存细胞活力的重要手段。目前常用二甲基亚砜作保护剂，利用其与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶损伤。其中，对于p2代细胞的来源本发明对此不作任何限定，例如可来源于uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02。在研究开始前需要复苏p2代细胞，将其培养至p3代收获后进行冻存；这里的复苏方法一般是本领域常规操作步骤，在此不作详述。冻存液中常用的二甲基亚砜对细胞存在一定毒性，研究表明其能与蛋白质结合导致蛋白质变性从而产生危害；因此本发明在此基础上进行研究后得出一种新的冻存液，能大大降低二甲基亚砜的含量。具体的说，本发明优选的冻存液中至少包括bi无血清培养基、人血白蛋白、二甲基亚砜。其中，优选的人血白蛋白可代替血清进一步保护细胞降低二甲基亚砜对细胞的毒害，此外还能够提供一定的营养，使细胞在快融后仍然维持较好的活性。除此之外，避免了因血清的加入带来的病毒感染的风险，最优选人血白蛋白为20％人血白蛋白。通过研究冻存液的组分比例对冻存效果有较大影响，优选冻存液按体积百分比计至少包括30％～55％bi无血清培养基、40％～65％的人血白蛋白、5％的二甲基亚砜。本发明的冻存方法中基本核心是以较低的二甲基亚砜的含量来尝试不同的组分用以非渗透性保护剂来部分替代二甲基亚砜的用量比例。研究以5％的二甲基亚砜作为保护剂，通过使用不同的组分提高细胞冻存效果，研究结果显示在以上述的优选组分以上述合适的范围内复配后得到的冻存液具有较好的冻存效果，而针对该冻存液，优选出适宜的降温程序进一步使存活率达到97％以上。对于冻存液中的bi无血清培养基具体名称为间充质干细胞无血清基础培养基mscxfbasalmedium，其品牌为bi，货号05-200-1a。对于冻存液中的人血白蛋白可以是购买的到，或是通过健康人血浆低温分离提取得到，本发明对此不作任何限定；二甲基亚砜优选分子生化级(br)的二甲基亚砜，例如wak-chemie的二甲基亚砜。对冻存液的研究发现冻存液的组成不同，相变点不同，在降温程序中通过调节温度为梯度缓慢降温可保证在降温的过程中最大限度的保护细胞的活性。通常而言，降温过程是循序渐进的梯度式降温，而梯度式的降温过程实质在冻存中会因为保护剂二甲基亚砜的用量少，所以仍然会有少量的冰晶在细胞内造成细胞损伤。进一步研究中，本发明通过改变降温的梯度，降温过程并不再试单一的梯度式降温法，而是在降温到某一温度点时采取适当升温的过程使冻存中的细胞受损伤的程度大大减少，优选程序降温包括一次降温-二次降温-升温-三次降温-四次降温五个步骤。这五个步骤中，每一步骤顺序开始，中间无保温停留操作。可以理解的是比如一次降温到某一温度下即从该温度开始二次降温。具体的说，对每一步骤中温度的控制使冻存液的相变点出现在不同温度曲线位置处，而针对其位置的不同，优选出最佳的相变点与降温程序中降温至最低点到升温的这一阶段中相匹配时发现能使细胞存活率达到最佳。作为一次降温过程，优选一次降温过程为从20℃以1℃/min降温至-6℃～-20℃；更优选从20℃以1℃/min降温至-10℃～-20℃；最优选从20℃以1℃/min降温至-16℃。作为二次降温过程，优选二次降温过程为以1℃/min降温至-40℃～-60℃；更优选以1℃/min降温至-50℃～-60℃；最优选以1℃/min降温至-60℃。作为升温过程，优选升温过程为以10℃/min升温至-10℃～-30℃；更优选以10℃/min升温至-14℃～-20℃；最优选以10℃/min升温至-18℃。作为三次降温过程，优选三次降温过程为以1℃/min降温至-45℃～-60℃；最优选以1℃/min降温至-60℃。作为四次降温过程，优选四次降温过程为以10℃/min降温至-80℃～-90℃；最优选以10℃/min降温至-90℃。更进一步的，具体的说，作为上述的降温程序最优选的如下的降温程序为：冻存液的配方的不同，在程序降温时，冻存液相变点则不同，使优选的冻存液的相变点出现在降温至最低点到升温的这一阶段时，冻存液潜热吸收越多，此时冻存效果是最好的，最终存货率也会达97％以上。有益效果：本发明采用新的冻存液配合程序降温步骤后，使细胞冻存前后细胞存活率并未明显降低、存活率在97％以上，除此之外细胞数量仍然保持较高的浓度。附图说明图1为实施例1的程序降温曲线；图2为实施例2的程序降温曲线；图3为实施例3的程序降温曲线；图4为实施例4的程序降温曲线；图5为对比例1的程序降温曲线。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，以下实施例只能用于本发明做进一步说明，并不能理解为本发明保护的限制，该领域的专业技术人员根据上述发明的内容作出的非本质的改正和调整，仍属于本发明的保护的范围。实施例11.1冻存液的配制：配方：dmso5ml，bi无血清培养基20ml，20％人血白蛋白25ml，共制成50ml。制法：准备一个50ml离心管，先加入5mldmso溶液，再加入20mlbi无血清培养基，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。1.2人脐带间充质干细胞的冻存：复苏p2代细胞(uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02)，培养至p3代收获，收集p3代细胞于50ml离心管中，按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液分开进行冻存，各冻存3管，分别标记为a1、a2、a3，另准备1管标记为a0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将3个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图1为实施例1的程序降温曲线)1.3细胞复苏：于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：a1、a2、a3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。1.4检测：1.4.1冻存前取样：细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。1.4.2冻存后取样：①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。1.5分析1.5.1细胞计数结果：冻存后a组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(p＞0.05)。详见表1。表1各组细胞计数结果组细胞浓度(个/ml)存活率(％)冻存前1.08×10798.4冻存后a组1.01×10792.1实施例21.1冻存液的配制：配方：dmso5ml，bi无血清培养基20ml，20％人血白蛋白25ml，共制成50ml。制法：准备一个50ml离心管，先加入5mldmso溶液，再加入20mlbi无血清培养基，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。1.2人脐带间充质干细胞的冻存：复苏p2代细胞(uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02)，培养至p3代收获，收集p3代细胞于50ml离心管中，按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液分开进行冻存，各冻存3管，分别标记为a1、a2、a3，另准备1管标记为a0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将3个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图2为实施例2的程序降温曲线)1.3细胞复苏：于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：a1、a2、a3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。1.4检测：1.4.1冻存前取样：细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。1.4.2冻存后取样：①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。1.5分析1.5.1细胞计数结果：冻存后a组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(p＞0.05)。详见表2。表2各组细胞计数结果组细胞浓度(个/ml)存活率(％)冻存前1.10×10798.8冻存后b组1.03×10793.1实施例31.1冻存液的配制：配方：dmso5ml，bi无血清培养基20ml，20％人血白蛋白25ml，共制成50ml。制法：准备一个50ml离心管，先加入5mldmso溶液，再加入20mlbi无血清培养基，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。1.2人脐带间充质干细胞的冻存：复苏p2代细胞(uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02)，培养至p3代收获，收集p3代细胞于50ml离心管中，按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液分开进行冻存，各冻存3管，分别标记为a1、a2、a3，另准备1管标记为a0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将3个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图3为实施例3的程序降温曲线)1.3细胞复苏：于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：a1、a2、a3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。1.4检测：1.4.1冻存前取样：细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。1.4.2冻存后取样：①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。1.5分析1.5.1细胞计数结果：冻存后a组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(p＞0.05)。详见表3。表3各组细胞计数结果组细胞浓度(个/ml)存活率(％)冻存前1.08×10799.1冻存后c组1.05×10797.1实施例41.1冻存液的配制：配方：dmso5ml，bi无血清培养基20ml，20％人血白蛋白25ml，共制成50ml。制法：准备一个50ml离心管，先加入5mldmso溶液，再加入20mlbi无血清培养基，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。1.2人脐带间充质干细胞的冻存：复苏p2代细胞(uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02)，培养至p3代收获，收集p3代细胞于50ml离心管中，按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液分开进行冻存，各冻存3管，分别标记为a1、a2、a3，另准备1管标记为a0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将3个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图4为实施例4的程序降温曲线)1.3细胞复苏：于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：a1、a2、a3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。1.4检测：1.4.1冻存前取样：细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。1.4.2冻存后取样：①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。1.5分析1.5.1细胞计数结果：冻存后a组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(p＞0.05)。详见表4。表4各组细胞计数结果组细胞浓度(个/ml)存活率(％)冻存前1.08×10799.2冻存后d组1.00×10792.1对比例11.1冻存液的配制：配方：dmso5ml，bi无血清培养基20ml，20％人血白蛋白25ml，共制成50ml。制法：准备一个50ml离心管，先加入5mldmso溶液，再加入20mlbi无血清培养基，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。1.2人脐带间充质干细胞的冻存：复苏p2代细胞(uc19007项目中yf-qd004脐带p2代冻存细胞，细胞批号：19007s4b02)，培养至p3代收获，收集p3代细胞于50ml离心管中，按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液分开进行冻存，各冻存3管，分别标记为a1、a2、a3，另准备1管标记为a0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将3个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图5为对比例1的程序降温曲线)1.3细胞复苏：于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：a1、a2、a3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。1.4检测：1.4.1冻存前取样：细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。1.4.2冻存后取样：①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。1.5分析1.5.1细胞计数结果：冻存后a组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(p＞0.05)。详见表5。表5各组细胞计数结果组细胞浓度(个/ml)存活率(％)冻存前1.07×10799.6冻存后e组0.98×10791.2当前第1页12