一种被修饰多肽的制作方法

专利名称：一种被修饰多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种呼吸性变应原性有所降低的被修饰多肽，包含呼吸性变应原性有所降低的被修饰多肽的工业组合物，皮肤护理产品，被修饰多肽用于降低工业组合物和产品变应原性的用途，以及降低多肽变应原性的方法。
背景技术：
在医疗和工业应用中，多肽、包括酶的用途是本领域众所周知的。由于多肽有可能会导致不需要的免疫应答-通常是IgG和/或IgE应答，这取决于刺激的方式-因此最近三十年已开发了减小免疫应答的技术。
一种技术是“PEG化”技术，即将数个聚合分子偶联到目的多肽上。使用该技术时，免疫系统难于识别多肽表面上负责抗体形成的表位，因此降低了免疫应答。
对于直接导入人体循环系统以达到一种特定生理效果的多肽(即药物)而言，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答；而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)有可能会引起IgE应答(即变应原性应答)。
对这种免疫应答降低作出解释的一种理论是聚合分子会遮蔽多肽表面上负责免疫应答引起抗体形成的表位。另一种理论认为或者至少部分因素是偶联物越大，获得的免疫应答就会越低。
美国专利第4179337号涉及无免疫原性多肽，例如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶联的酶和肽激素。至少保留了多肽生理活性的15％。该专利以分子量约750Da-6000Da的PEG为例进行了描述，这些多肽并不用于工业应用中。
WO96/17929(Novo Nordisk A/S)描述了与聚合分子如PEG偶联的被修饰多肽偶联物。该被修饰的酶可用于多种工业应用中。实施例中与多肽偶联的聚合分子的分子量分别是5000、15000和35000Da。
发明简述本发明涉及变应原性有所降低的被修饰多肽和含有被修饰多肽、可用于工业应用的组合物和产品。
人们通常相信，聚合分子的分子量和长度不应太短/轻，因为短/轻聚合分子不能有效地遮蔽多肽表面。
本发明人已证实，对于用于工业应用中、不会进入循环系统的多肽(例如酶)来说，这种说法是错误的。
本发明人发现，当所研究的多肽用于工业应用中(其中潜在危险是该多肽被吸入后造成的变应原性应答)时，可以将亲本多肽与分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、尤其是100-1000Da的聚合分子偶联，而不会丧失使呼吸性变应原性应答显著降低的能力。
第一方面，本发明涉及偶联了分子量为100-低于750Da、尤其是100-500Da、比如300Da左右的聚合分子的多肽。
第二方面，本发明涉及含有偶联了分子量为100-5000Da的聚合分子的被修饰多肽、用于工业产品中的组合物。工业多肽工业应用中所用的多肽常常有酶活性和/或抗微生物活性。与药用多肽相反，工业多肽并不打算导入机体循环系统。
因此，工业多肽，如工业组合物和/或产品(如下述，例如去污剂，包括衣物和碗碟洗涤剂；食品或饲料添加剂，包括面包制备用的添加剂；处理纺织品的组合物；以及个人护理产品，包括化妆品)中用作活性成分的酶不太可能与人或动物机体循环系统直接接触，因为这样的多肽(或包含这类多肽的产品)不会注射到(或通过其它途径进入)血管中。
因此，就工业多肽而言，潜在的危险是通过呼吸道吸入多肽引起的呼吸性变态反应(即IgE应答)。
在本发明上、下文中，“工业多肽”定义为不打算导入人和/或动物体循环系统的多肽，包括肽、蛋白质和/或酶。
这类“工业多肽”的例子包括如下述具有酶活性的多肽。
本发明也涉及变应原性有所降低的皮肤护理产品。
此外，本发明还涉及分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、特别是100-1000Da的被修饰多肽在降低工业产品变应原性方面的用途。
本发明最后涉及通过将多肽偶联分子量为100-5000Da的聚合分子而降低多肽变应原性的方法。发明详述本发明的目的是提供变应原性有所降低的被修饰多肽，以及含有变应原性有所降低的被修饰多肽、可用于工业用途的组合物和产品。
术语“变应原性有所降低”在本发明上、下文中是指与相应的亲本多肽相比，当吸入本发明的被修饰多肽时，产生的会导致变态反应的IgE(在人中为IgE，在特定动物中为具有类似作用的分子)的量有所降低。可用术语“呼吸性变应原性”代替。
本发明人发现，当多肽是用于工业应用中(其中主要的潜在危险是因吸入多肽导致的变态反应)时，亲本多肽可以与分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、特别是100-1000Da的聚合分子偶联，而不会丧失使变态反应显著降低的能力。
在本发明的一个实施方案中，与多肽(特别是酶)偶联的聚合分子的分子量为100-750Da，如100-500Da，例如约300Da。
令人惊奇的是，与多肽偶联的聚合分子可以如此之小，并证实了一个现有假说是错误的，即与多肽偶联的聚合分子的分子量和长度不应太短/小，因为短/小的聚合分子不能充分遮蔽多肽表面。
本发明第一方面涉及有分子量为100-750Da、特别是100-500Da、如300Da左右的聚合分子共价偶联到分子量为5-100kDa(如15-60kDa)的亲本多肽上的被修饰多肽。
因为短/小的聚合分子抑制多肽功能活性的可能性更小，故将短/小的聚合分子偶联到目的多肽上更有优势。例如，与偶联了更大/重的聚合分子的相应酶相比，偶联了具有如本发明上述分子量大小的聚合分子的酶其活性位点对底物来说更易于接近，因为聚合分子引起的空间阻碍更不突出。此外，与偶联了更大/重的聚合分子的相应偶联物相比，具有更小/轻的聚合分子的多肽-聚合物偶联物其稳定性更有改善，因为将多肽结构不同方向拉扯的重量更小，使多肽结构的变形达到最小。
使用小聚合分子的另一优点是它们的价格更便宜，因为聚合物是论千克出售的。这样可降低制备本发明偶联物时的成本。
变应原性评价可以通过吸入检验，并比较气管内施用亲本多肽的效果与施用本发明相应的被修饰多肽的效果来评价变应原性。
现有几种用于多肽变应原性评价的体内动物模型。某些这样的模型为人类中的危险评价提供了合适的依据。适合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。这些模型设法将呼吸性变应原表示为在以前致敏的动物中所诱导的刺激反应的函数。按照这些模拟，将所宣称的变应原通过气管内引入动物。
豚鼠的一个适合品系(Dunkin Hartley品系)不会因变应性应答而产生IgE抗体，这一点与人类不同。然而，它们产生另一种类型的抗体IgG1A与IgG1B(参见，例如，Prentφ，ATLA，19，P.8-14，1991)，这些抗体造成了对所吸入的多肽(包括酶)产生变应原性应答。因此，当使用Dunkin Hartley动物模型时，IgG1A和IgG1B的相对量可以表示变应原性水平。
适合于气管内接触多肽(例如酶)的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠产生IgE作为变应性应答。在举例说明本发明的实施例4和5的实验中使用了Brown Norway大鼠。
在豚鼠和小鼠中评价呼吸性变应原的更多细节由Kimber等(1996)，基础与应用毒理学，33，P.1-10描述。
其它动物(如兔子)也可以用于类似研究中。
聚合分子偶联到多肽上的聚合分子可以是具有本发明所限定分子量的任何适合的聚合分子，包括天然和合成的均聚物[如聚醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)以及聚羧酸(即poly-COOH)]以及杂聚物，即包含一种或多种不同偶联基团(如羟基与胺基)的聚合物。
适合的聚合分子的例子包括选自含有下述各类分子的组中的聚合分子聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(FAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-氨基酸、乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素以及羟丙基纤维素，聚氨基葡糖的水解产物、淀粉(如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、支链淀粉、菊粉、黄原酸胶(xanthangum)、角叉菜胶(carrageenan)、果胶、藻酸水解产物和生物聚合物。
优选的聚合分子是无毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇(mPEG)，还要求这些分子共价偶联到酶表面连接基团上的化学方法相对比较简单。
一般看来，聚亚烷基氧化物(PAO)(如聚氧乙烯，如PEG，特别是mPEG)是优选的聚合分子，因为这些聚合分子与多糖(如葡聚糖、支链淀粉等)相比，它们所具有的能交联的活性基团(并不合乎需要)很少。
按照本发明，尽管可以使用所有上述的聚合分子，但优选地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)和双羟基聚乙二醇。
聚合物的活化如果将与目的多肽偶联的聚合分子没有活性，就必须使用适合方法使其活化。根据本发明，聚合分子也可通过连接子与多肽偶联。适合的连接子对熟练技术人员是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于偶联多肽的方法和化学原理在文献中有详细描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能团溴化氰、高碘酸、戊二醛、双环氧化合物(biepoxides)、环氧氯丙烷、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等(参见R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质固定，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质偶联和交联的化学”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的亲和性配体技术”，学院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也适用于可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等)的活化。在选择活化与偶联化学方法中必须考虑聚合物上的官能团氨基、羟基、巯基、羧基、醛或硫氢基以及蛋白质上选定的连接基团，活化与偶联化学方法通常包括i)聚合物的活化，ii)偶联，iii)剩余活性基团的封闭。
下面简要描述许多适合的聚合物活化方法。然而，应该理解也可以使用其它方法。
将聚合分子偶联到多肽的游离酸基团上可以借助于二酰亚胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白质偶联和交联化学”，CRC出版社)进行。
将聚合分子偶联到羟基上通常是非常困难的，因为这必须在水中进行。而通常水解反应比与羟基的反应更占优势。
将聚合分子偶联到游离硫氢基上可以用特定基团(如马来酰亚胺或邻吡啶基二硫化物)达到。乙烯基砜(美国专利no.5,414,135，(1995)，Snow等)优先偶联于硫氢基上，但是不象提到的其它化合物那样有选择性。
可以通过包含两个邻近羰基的基团靶向多肽链中的可及精氨酸残基。
涉及将亲电子性地活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也可能有用。醇的许多常规离去基团形成胺键。例如，可以使用烷基磺酸盐，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶学方法，104卷，Jacoby W.B.编，学院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸盐(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸盐(如甲苯磺酸盐)以及对硝基苯磺酸盐。
有机磺酰氯(例如Tresyl氯化物)可有效地将许多聚合物(例如PEG)中的羟基转化成良好的离去基团(磺酸盐)，当与多肽中的亲核基团(如氨基)进行反应时，该离去基团使得可以在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了要有高的偶联产率之外，反应条件通常还要求比较温和(中性或微碱性pH值，以避免变性和活性极少或没有破坏)，并且满足多肽需要的非破坏性条件。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐反应性更强，而且更不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物偶联物化学，6，150-165)。环氧化合物也可以用于产生胺键，但是活性比上述基团弱得多。
用碳酰氯将PEG转化成氯甲酸酯将产生与赖氨酸的氨基甲酸酯键。这一转变可以多种变化形式进行，如用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技术应用和生物化学，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物偶联物化学，6，62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp309-319)、用对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等替代氯。通常通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应来制备衍生物。所有这些基团均产生与肽的氨基甲酸酯键。
此外，可以分别使用异氰酸盐和异硫氰酸盐来产生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的离去基团和环状亚胺thrones，可以从PEG酸(美国专利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)获得酰胺。这些化合物的反应活性十分高，但是可能会使水解太快。
也可以使用从与琥珀酸酐反应制备的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使偶联物对水解更加敏感得多(美国专利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。这一基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外，可以引入一个特殊的连接子。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化学杂志，252，3578-3581；美国专利no.4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
将PEG偶联到芳香族胺上，随后重氮化，将产生非常活跃的重氮盐，其在原位可与肽反应。通过使PEG的吖内酯衍生物(美国专利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反应，也可以形成酰胺键，因此引入又一个酰胺键。
由于一些肽不包含许多赖氨酸，因此，将多于一个PEG连接到相同的赖氨酸上有可能是有利的。这可以通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇进行。
也可以将PEG通过氨基甲酸酯键连接到酶的氨基上(WO95/11924，Greenwald等)。赖氨酸残基也可以用作主链。
偶联的聚合分子的位置实际上，所有离子化基团(如赖氨酸残基的氨基)均位于多肽分子的表面(参见例如Thomas E.Creighton，(1993)，“蛋白质”，W.H.Freeman和Company，纽约)。因此，在多肽的表面上容易达到的连接基团(即氨基)数目等于多肽一级结构中的赖氨酸残基加N-末端氨基的数目。
根据本发明，可以有1-100个聚合分子、优选4-50个聚合分子、5-35个聚合分子偶联到亲本多肽上。
亲本多肽可以在亲本多肽、通常是分子量为5-100kDa、优选15-60kDa的亲本多肽基础上，利用本领域已知的任何合适技术制备本发明的被修饰多肽。
术语“亲本”多肽是指任何未偶联的多肽(即要修饰的多肽)。该多肽优选地可以是微生物来源的，如细菌、丝状真菌或酵母来源的。
亲本多肽可以是天然存在的(或野生型)多肽或其变体。
优选多肽是具有抗微生物活性的酶和多肽。在一个优选实施方案中，所述酶是适用于皮肤护理组合物和产品的酶，它在皮肤护理产品中所用的pH范围内具有显著的酶促活性。
选择亲本多肽时，最好使用具有多个连接基团的多肽。
另外，在本发明优选的实施方案中，聚合分子广泛分布于多肽的表面上。对于酶，优选在活性位点附近的区域不偶联聚合分子。
在本发明的上下文中，“广泛分布于”是指其所处的位置能使得偶联到多肽连接基团的聚合分子能遮蔽多肽表面的不同部分(优选地是整个表面或接近于整个表面)，以确保可识别的有关表位受到遮蔽，由此不被免疫系统的抗体识别。人们相信多肽和抗体之间相互作用的表面积大约为5002(26×19)(参见Sheriff等，(1987)，美国国家科学院学报，84卷，p.8075)。
优选地，多肽上的两个或多个连接基团应不相互靠近，因为连接基团相互邻近很可能会导致仅能偶联一个聚合分子。
对于酶，为了确保酶促活性的损失最小，优选地不将聚合分子偶联到活性位点的近距离范围内。通常看来以距离活性位点5、优选地10的范围内没有聚合分子偶联为佳。
而且，按照本发明，在免疫系统可识别的已知表位或接近于所说的表位偶联了聚合分子的多肽也被视为很有好处。如果表位的位置是未知的，则将许多聚合分子偶联到多肽表面可及的连接基团上是颇为有利的。优选的是所说的连接基团以离活性位点适合的距离广泛分布于多肽的表面。
按照本发明，优选的是符合上述有关偶联聚合分子在多肽表面分布要求的被修饰多肽。
对于酶，尤其优选没有或只有极少数聚合分子(即0-2个)偶联到距离活性位点0-5范围内、优选地0-10范围内的酶。
酶活性亲本酶可以具有已知用于皮肤护理的任何活性。所涉及的酶包括氧化还原酶(E.C.1，“酶命名法，(1992)，学院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶，以及脂类分解酶；转移酶，(E.C.2)，如转谷氨酰胺酶(TG酶)；异构酶(E.C.5)，如蛋白质二硫键异构酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括选自下列组、具有上述性质(即连接基团的数目，连接基团的位置等)的蛋白酶酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶，或金属蛋白酶。
具有适合数目偶联基团的合适亲本蛋白酶的特定例子示于表1中
表
外，诸赖氨酸残基在该酶的表面上广泛分布(即远离活性位点)。
枯草杆菌蛋白酶DY具有27 kDa的分子量，在其表面上有12个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ ID NO.3)。
亲本蛋白酶Lion Y具有46 kDa的分子量，在其表面上有14个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ ID NO.4)。
中性金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶具有34 kDa的分子量，并在其表面上有11个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ IDNO.5)。
脂类分解酶所涉及的脂类分解酶包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一种)，Humicolainsolens、Rhizomucor miehei脂肪酶(如EP 238 023所述)，犁头酶脂类分解酶(WO 96/13578)，假丝酵母属脂肪酶(如C.antarctica脂肪酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂肪酶A或B)，假单胞菌属脂肪酶(例如产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌脂肪酶，如EP 218 272中所述；洋葱假单孢菌脂肪酶，如EP 331 376中所述；WO95/14783中所公开的假单孢菌脂肪酶)，芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysicaacta，1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422))。其它类型的脂类分解酶包括角质酶，例如源自柔毛腐质霉或门多萨假单胞菌的角质酶(WO88/09367)，或源自Fusarium solanipisi的角质酶(WO 90/09446)。
氧化还原酶漆酶所涉及的漆酶包括在Novo Nordisk的WO 96/00290与WO95/33836中所公开的漆酶。
其它氧化还原酶包括过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和脂肪氧化酶。
转移酶转谷氨酰胺酶适合的转移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公开的任何转谷氨酰胺酶。
异构酶蛋白质二硫键异构酶适合的蛋白质二硫键异构酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但并不限于此。工业组合物本发明又一方面涉及含有变应原性有所降低的被修饰多肽的“工业组合物”。
在本发明上下文中，“工业多肽”指不打算导入循环系统的组合物。换句话说，指的是不打算经皮内、静脉内或皮下施用的组合物。
如上所述，对于工业应用中的多肽(例如酶)来说，主要问题是可能会因呼吸系统吸入，即气管内或鼻内接触而导致呼吸性变态反应。
“工业多肽”的例子是组合物或产品如洗涤剂中所用的多肽，特别是酶，所述洗涤剂包括衣物和碗碟洗涤剂，家用清洁产品，农用化学品，个人护理产品如皮肤护理产品，包括美容和沐浴产品，口服和经皮药物，处理/加工纺织品所用的组合物，硬表面清洁组合物，食品和饲料生产中所用的组合物，包括食品或饲料添加剂，如制备面包等的添加剂，等等。特别包括在本发明中的是皮肤护理产品和洗涤剂。
皮肤护理产品本发明中，“皮肤护理产品”涵盖机体皮肤清洁、护理和/或美容所用的所有个人护理产品，还包括其它产品，如头发护理产品，它们在使用中可能会接触皮肤或呼吸系统。用于动物的相应产品也包括在本发明范围之内。
所涉及的本发明皮肤护理产品的具体例子有肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、皂膏、化妆基料、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素、润手香脂、香粉、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、搽脸粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂(scalp treatment)、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油(sun oil)、防晒品、剃须泡沫与凝胶、剃须膏、婴儿油、防治粉刺制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。适于皮肤护理的酶活性本发明的皮肤护理组合物包含变应原性有所降低的被修饰酶和已知用于皮肤护理组合物的诸成分。
已知许多酶活性可用于皮肤护理组合物。
蛋白酶蛋白酶是洁肤产品中的有效成分。蛋白酶能除去皮肤死亡角质细胞的上层，由此使皮肤看上去更有光泽、更为柔嫩。而且，蛋白酶也能提高皮肤的光滑性。
蛋白酶可用于盥洗用品、盆浴和淋浴产品，包括香波、调理剂、洗剂、乳膏、肥皂块、香皂以及液态肥皂。
脂肪酶脂肪酶可作为洁肤产品和抗痤疮产品中的有效成分用于化妆品用途中，以除去过多的皮肤脂类，也可作为皮肤护理有效成分用于盆浴和淋浴产品(如乳膏和洗剂)中。
脂肪酶也可以用于头发清洁产品(例如香波)中，以有效地从头发表面除去皮脂和其它脂肪物质。
氧化还原酶用于个人护理用途的最常用的氧化还原酶是与底物(如葡萄糖)一起能确保产生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然后H2O2可起始过氧化物酶(通常是乳过氧化物酶)对例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物试剂(SCNO-或I2)。已知这一酶促复合物天然存在于例如乳汁和唾液中。
商业上，过氧化物酶在口腔护理产品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物体系，在这些产品中，它也可以与淀粉葡糖苷酶结合使用，以产生葡萄糖。已知这些体系也用于化妆品中，以利于保存。
氧化还原酶另一个应用是使用氧化酶、过氧化物酶和漆酶进行氧化性染发(参见例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮肤(和头发)表面形成的自由基与皮肤的老化过程(头发的损坏)相关。
自由基会激活能导致脂膜、胶原以及细胞受到破坏的链式反应。
自由基清除剂(如超氧化物歧化酶)在化妆品中的应用是众所周知的(R.L.Goldemberg，DCI，Nov.93，P.48-52)。
蛋白质二硫键异构酶(PDI)也是一种氧化还原酶。它可以用于烫发(使头发中的二硫键还原和再氧化)和修复受损头发(其中损伤主要是原有二硫键发生了还原)。
转谷氨酰胺酶用于皮肤、头发或指甲的皮肤护理组合物包含(a)氨基有功能的活性成分，(b)催化活性成分与皮肤、头发或指甲交联的转谷氨酰胺酶，以及(c)在美国专利NO.5,490,980中已知的载体。
适合用于哺乳动物皮肤、头发或指甲的化妆品组合物包含(a)量足以在所说的皮肤、头发或指甲上形成保护层的至少一种角质细胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角质细胞包膜蛋白和所说皮肤、头发或指甲角质层中暴露于外部的角质细胞蛋白质之间形成共价键的转谷氨酰胺酶；(c)量足以激活转谷氨酰胺酶的钙离子；以及(d)化妆上可接受的载体，其中所说的组合物包含具有两相的乳化剂，其中所说的角质细胞包膜蛋白质包含在该两相中的一相内，而转谷氨酰胺酶包含在另一相内(参见美国专利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一种皮肤化妆品材料，其中含有用水溶性物质修饰过的转谷氨酰胺酶。该修饰物质是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纤维素、淀粉以及羟丙基纤维素中的一种或多种。这种修饰是通过例如导入活性基团并与酶键合完成的。这样提供了一种对皮肤比较温和、随时间褪色和变味的程度较小、并具有良好的医治粗糙皮肤、保温性以及美化调理皮肤效果的物质。
本发明的皮肤护理产品本发明的第三个方面涉及包含本发明皮肤护理组合物的皮肤护理产品。术语“皮肤护理产品”如上定义。
本发明的皮肤护理产品可以包含有效量的本发明的被修饰酶。本领域熟练人员所知的这种有效量常占最终皮肤护理产品的0以上-5％。
所涉及的本发明皮肤护理产品包括但不限于下列产品肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、皂膏、化妆基料、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素、润手香脂、香粉、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、搽脸粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油、防晒品、剃须泡沫、剃须膏、婴儿油、防治粉刺制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。
常规皮肤护理产品配方术语“用于皮肤护理产品的成分”是指包括已知用于皮肤护理产品配方中的所有有效成分。这种成分的例子可参见“化妆品和盥洗用品”(由Wilfried Umbach编辑，由Ellis Horwood有限公司出版，英国，(1991))以及“消费品中的表面活性剂”(由J.Falbe编辑，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非穷尽性地列出了一些指导性配方，概述了本发明所涉及的重要皮肤护理产品配方。
香皂成分 例子 ％表面活性剂肥皂(钠盐) 83-87螯合剂乙二胺四乙酸盐 0.1-0.3稠度调节剂氯化钠 大约0.5染料 ＜0.1光学增白剂 ＜0.1抗氧化剂 2，6-双(1，1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白剂二氧化钛 0.1-0.3香料 1.0-2.0酶蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差额合成洗涤剂成分 例子 ％表面活性剂月桂基硫酸盐 30-50月桂基磺基琥珀酸盐 1-12加脂剂 脂肪醇 10-20成形剂 单/二硬脂酰甘油酯 0-10填料 淀粉 0-10活性剂 水杨酸 0-1染料 ＜0.2香料 0-2酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差额泡沫浴和淋浴成分 例子 ％泡沫浴 ％淋浴表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 10-2010-12椰油酰胺丙基二甲基甜菜碱 2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2-加脂剂 脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-50-4酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5成分 例子 ％泡沫浴 ％淋浴泡沫稳定剂 脂肪酸链烷醇酰胺 0.2-20-4调理剂 季铵化羟丙基纤维素 -0-0.5增稠剂 氯化钠 0-3 0-3珠光剂 乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性剂 蔬菜提取物 0-1 0-1防腐剂 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1香料 0.3-30.3-2酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5水分 差额 差额护肤膏(油包水型和水包油型)成分例子 ％油包水型/水包油型乳化剂 脱水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -硬脂酸铝 1-2 -三乙醇胺硬脂酸 -1-2十六烷醇/十八烷醇聚二醇醚-1-3脂肪衍生棕榈酸异丙酯 1-5 0-3物十六烷醇/十八烷醇-0-22-辛基十二烷醇 2-10 3-7硬脂酸/棕榈酸-0-3辛酸/癸酸甘油三酯5-10 -甘油硬脂酸酯 -0-5湿润剂 甘油 1-5 1-5山梨糖醇 1-5 1-5聚(羟基羧酸) 0.5-2-丙二醇 -0-3稳定剂 硫酸镁 0-0.8-防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5水分 差额 差额用于湿润皮肤的爽身水(水包油型)和爽肤水成分例子 ％爽身水 ％爽肤水乳化剂 十六烷醇/十八烷醇聚二醇醚1-3-脱水山梨醇单月桂酸酯 0.5-1 -硬脂酸钠 - 1-2月桂基醚硫酸钠 - 0.5-2脂肪衍生 2-辛基十二烷醇1-3 0-5物石蜡油(paraflin oils) - 20-25蜂蜡 0.5-1 -硬脂酸异辛酯 3-7 -棕榈酸异丙酯 - 2-5湿润剂 甘油 3-5 5-10山梨糖醇 - 0-5增稠剂 聚丙烯酸酯0-0.3 0-1甲基羟丙基纤维素 0-0.3 0-0.5防腐剂 对羟基苯甲酸酯0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5水分 差额差额润面露成分 例子 ％表面活性剂 月桂基醚硫酸镁 0.2-0.5加脂剂 己二酸二正丁基酯 1-2增溶剂 蓖麻油聚二醇醚 0.1-1清洁和清爽组分 乙醇 0-15湿润剂 甘油 0-5山梨醇 0-5防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4收敛剂 蔬菜提取物 1-5抗刺激剂 泛酰醇 0-1尿囊素 0-0.2蔬菜提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5水分差额洗发香波成分 例子 ％表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 12-16椰油脂肪酸酰氨丙基二甲 2-5基甜菜碱脂肪酸聚二醇酯 0-2增泡剂 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5调理剂 季铵化羟乙基纤维素 0.4-1蛋白质水解产物 0.2-1加脂剂 乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加剂 去头屑剂 0-1防腐剂 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1-0.3珠光剂 乙二醇硬脂酸酯 0-2染料＜0.1pH调节剂 酸/碱0.1-1香料0.3-0.5酶 蛋白酶/脂肪酶0-5水分差额护发素和头发调理剂成分 例子 ％护发素％头发调理剂表面活性剂 脂肪醇聚二醇醚 0.1-0.21.5-2.5十六烷基三甲基铵氯化物 0.5-1 -二甲基苄基硬脂基铵氯化物 - 0.5-1加脂剂 甘油的单/二鲸蜡酸/硬脂 0.5-1.51.5-2.5酸酯稠度调节剂 脂肪醇 1-2.5 2.5-3.5增稠剂 甲基羟丙基纤维素 0.3-0.60.4-0.8调理剂 季铵化羟乙基纤维素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料＜0.1＜0.1pH调节剂 酸/碱 0.1-10.1-1香料0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5水分差额 差额染发剂成分 例子％组分1 碱性染发膏表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 1-4乙氧基化的蓖麻油1-2稠度调节剂 脂肪醇 8-10还原剂 亚硫酸钠0.8-1.2缓冲液 氯化铵 0.5-1螯合剂 1-羟基乙烷-1，1-二膦酸 0.1-0.2碱性剂 氨 1.2-2氧化染料 显色剂(Developing agent)1偶联剂 1酶 漆酶0-5水分 差额组分II 过氧化氢分散物表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 0.5-1氧化剂 过氧化氢6-9稳定剂 1-羟基乙烷-1，1-二膦酸 1-1.5增稠剂 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶0-5水分 差额剃须膏成分 例子 ％肥皂 棕榈酸/硬脂酸30-40氢氧化钾 5-7氢氧化钠 1-2脂肪组分 椰子油 5-10聚乙二醇 0-2稳定剂四硼酸钠 0-0.5硅酸钠 0-0.5山梨醇 0-3酶蛋白酶 0-5水分 差额剃须液成分 例子 ％消毒剂乙醇 40-80加脂剂己二酸二正丁基酯 1-2增溶剂乙氧基化的蓖麻油 0.5-1收敛剂蔬菜提取物 1-10抗刺激剂 泛酰醇 0-0.5蔬菜提取物 0-2稳定剂甘油 0-5山梨醇 0-5丙二醇 0-3酶蛋白酶 0-5水 差额发油成分例子 ％稠度调节剂 脂肪醇4-5乙氧基化的羊毛脂醇3-6矿物脂 凡士林45-52支链石蜡 10-18抗氧化剂2，6-双(1，1-二甲基乙基)- 0.5-14-甲基苯酚(BHT)香料 0.2-0.4染料 0.1酶 脂肪酶0-5润肤剂 甘油 差额定型水成分例子 ％溶剂异丙醇12-20成膜组分乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯 2-3.5酯共聚物软化剂 乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨 0.2-1基乙基异丁烯酸酯调理剂 蛋白质水解产物0.2-0.5抗静电剂十六烷基三甲基铵氯化物0.1-0.5乳化剂 乙氧基化的蓖麻油 0.1-0.5香料 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂肪酶0-5水分 差额本发明的又一方面涉及本发明的被修饰多肽在降低上述工业组合物和产品变应原性方面的用途。
本发明最后涉及降低多肽呼吸性变应原性的方法，该方法包括偶联这一步骤。
洗涤剂公开内容本发明的洗涤组合物例如可以制成手洗和机洗组合物，包括洗涤添加剂组合物和适于脏织物预处理的组合物，漂洗添加的织物柔顺剂组合物，适于普通家用硬表面清洗操作和碗碟洗涤操作的组合物。
本发明的洗涤剂组合物包含本发明的偶联物和表面活性剂。此外还可任选地包含助洗剂，其它酶，泡沫抑制剂，柔顺剂，染料转移抑制剂，以及洗涤剂中习惯上使用的其它成分，如污垢悬浮剂、污垢除去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或包覆或未包覆的香料。
本发明的洗涤剂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。pH(在使用浓度的水溶液中测得的)通常是中性或者碱性，如pH7-11范围内。本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶偶联物或掺入洗涤剂组合物中的其它任选酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
表面活性剂体系表面活性剂体系可包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂体系优选由阴离子表面活性剂或者阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的混合物组成，如阴离子表面活性剂占50-100％，非离子表面活性剂占0-50％。衣物洗涤组合物中还可含有阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂和半极性表面活性剂，以及本文并未述及的非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂。表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。下面介绍表面活性剂的一些例子。
非离子表面活性剂表面活性剂可包含烷基酚的聚环氧烷(如聚氧乙烯)缩合物。这些烷基可包含约6-14个碳原子，可以是直链或支链构型。环氧乙烷存在的量可相当于每摩尔烷基酚约2-25摩尔。
表面活性剂也可包含伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链，并且通常含有约8-22个碳原子。
此外，非离子表面活性剂可包括烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧基化物和其混合物。
阴离子表面活性剂合适的阴离子表面活性剂包括式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸这样的烷基烷氧基化硫酸或其盐，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羟基烷基，优选C12-C20烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子，该阳离子可以是例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁离子等)、铵或取代铵阳离子。本文中预计使用烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代铵阳离子的具体例子包括甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。
其它合适的阴离子表面活性剂包括式ROSO3M的水溶性酸或盐这样的烷基硫酸或其盐表面活性剂，其中R优选为C10-C24烃基，优选有C10-C20烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选是C12-C18烷基或羟基烷基，M是H或阳离子，如碱金属阳离子(如钠、钾、锂离子)或者铵或取代铵离子。
其它阴离子表面活性剂包括皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷烃磺酸盐、C8-C24烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧酸。烷基苯磺酸盐比较合适，特别是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。
衣物洗涤组合物中通常含有约1-40％、优选约3-20％的这类非离子表面活性剂。
助洗剂体系本发明的组合物还可包含助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸盐(EDTA)的材料、金属离子螯合剂例如氨基多膦酸盐。本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。
合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂的助洗剂的优选量是5-30％。
其它洗涤酶活性除了含有具特异活性的本发明偶联物之外，本发明洗涤组合物还可含有提供清洗性能和/或织物护理益处的其它酶活性(例如也是本发明上述酶偶联物的形式)，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
所涉及的酶的具体例子列于上文“酶活性”部分。
漂白剂洗涤剂组合物(特别是粒状洗涤剂的情况下)中也可含有漂白剂，如氧型漂白剂或卤素型漂白剂。氧型漂白剂可以是过氧化氢释放剂，例如过硼酸盐(如PB1或PB4)或过碳酸盐，或者可以是例如过羧酸，其粒径可以是400-800微米。当存在氧型漂白化合物时，其存在的量一般是约1-25％。
可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰基羟苯磺酸盐(NOBS)、3，5-三甲基己酰基羟苯磺酸盐(ISONOBS)或五乙酰基葡萄糖(PAG)。
卤素型漂白剂可以是例如次卤酸盐漂白剂，如三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯代和N-溴代烷烃磺酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10％、优选1-5％的量加入。纺织品应用蛋白酶蛋白酶用于对丝绸进行脱胶和砂洗处理。脂肪酶在纺织品的整理过程中，脂肪酶被用来除去含疏水性酯(如甘油三酯)的脂类物质(参见例如Novo Nordisk A/S的WO93/13256)。氧化还原酶在纺织品的漂白剂吸收中，过氧化氢酶可以用来除去多余的过氧化氢。糖酶(cabbohydrase)在粗斜纹棉布服装的整理中，纤维素分解酶被广泛使用，以使织物色度局部改变(酶促进“石洗”)。
纤维素分解酶也可用于生物抛光加工中。生物抛光是对纱线表面所进行的一项特殊处理，可改善织物手感和外观方面的性质，但不会使织物可湿性受到损失。可应用WO93/20278所述的方法进行生物抛光。
在纺织品的纺织过程中，丝线通常会受到不小的机械力。为避免断裂，常常用凝胶类物质(浆料)对它们上浆。最普遍使用的上浆剂是天然或修饰形式的淀粉。只有在除去了织物上的浆料(即所谓的脱浆)后，才完成了均匀持久的整理。用含有淀粉或被修饰淀粉的浆料上浆过的织物的脱浆过程优选利用淀粉分解酶来促进。食品和饲料应用在食品和饲料生产中使用本发明的偶联酶或多肽可能比较有利。蛋白酶面粉中的面筋是面粉能用于烘烤食品的必需成分。有时需要蛋白分解酶来改变生面团的面筋形态，例如使用蛋白酶可以软化硬面粉。
Neutrase是一种市售中性金属蛋白酶，可用来确保获得均匀面团和面包结构以及改善风味。面筋或者被适度降解或者被进一步降解为肽，因此有必要严格控制以避免面团过度软化。
还可利用蛋白酶来改变牛奶蛋白质。
为了在生产乳酪时使牛奶中的酪蛋白凝集，可以使用诸如粗制凝乳酶或凝乳酶之类蛋白酶。
在酿造业中常采用蛋白酶来用未发芽谷物酿酒以及控制氮含量。
在动物饲料产品中，据说可利用蛋白酶来扩张动物的消化系统。脂肪酶在烘烤业中使用脂肪酶比较新。添加脂肪酶能改善生面团性质，提高面包加工质量(使体积更大)，改善面包屑结构并使面包更白。观察到的这些效果可用以下机制解释即脂肪酶能改变生面团混合过程中面筋与一些脂类片段之间的相互作用，从而改善面筋网络结构。
Blue roan乳酪(如Danablue)、某些意大利乳酪和含有黄油的其它乳品的香味产生有赖于乳类脂肪降解为游离脂肪酸。可使用脂肪酶使这些产品具有香味。
在油类和脂肪类制备业中，脂肪酶被用来尽量减少不需要的副产品，通过酯交换使脂肪改性以及合成酯。氧化还原酶此外，在食品和饲料加工过程中使用本发明变应原性有所降低的氧化还原酶可能也比较有利。
有几种氧化还原酶可用于烘烤面包，例如葡萄糖氧化酶，脂类氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及其混合物。传统上面包烘烤师是通过添加抗坏血酸和溴酸钾来强化面筋的。可利用一些氧化还原酶代替生面团体系中的溴酸盐，通过氧化谷蛋白中的游离巯基单元起作用，由此形成二硫键，得到更强力、更有弹性并具更大耐力的面团。
Gluzyme(Novo Nordisk A/S)是具有过氧化氢酶活性的一种葡萄糖氧化酶制剂，可用来代替溴酸盐，生面团的强化测定为对机械震动耐受力更强、面包烘烤膨胀更好和面包体积更大。糖酶面粉有不同含量的淀粉酶，使得烘烤性质有所不同。为使面粉标准化，加入淀粉酶可能是必要的。淀粉酶和戊聚糖酶通常可为酵母发酵提供糖类，改善面包体积，延缓老化，降低变陈速率和因戊聚糖胶所致的粘着性。下面给出糖酶的一些例子。
某些麦芽糖源淀粉酶可用来延长面包的保存期两天或更多天，并不使面包变得更粘稠。通过从淀粉分子、低分子量糖类和糊精的非还原末端裂解，可以选择性修饰凝胶化淀粉。对淀粉进行修饰，使其更不可能发生老化，所产生的低分子量糖类可改善烘烤产品的水保持能力，而不会产生中间长度的糊精，使终产品更加粘稠。酶在面包烘烤过程中被灭活，因此可将其视为加工助剂，不需要在标签上明确标出。几乎可以排除Novamyl过量使用这种可能性。
用真菌α-淀粉酶可以改善面包体积，为面包屑更进一步提供均匀良好的结构。所述α-淀粉酶是能产生麦芽糖、糊精和葡萄糖的内切酶。谷物和一些细菌α-淀粉酶只在高于淀粉凝胶化温度的温度下被灭活，因此将其添加到小麦面团中时，会使面包体积小，面包内部比较粘。Fungamyl具有不耐热的优点，在低于凝胶化的温度下即被灭活。
有一些戊聚糖酶和半纤维素酶活性的酶制剂可以改善面团的手感和稳定性，并改善面包的新鲜度、体积和面包屑结构。
对面粉中的戊聚糖水解后，会使其结合水的能力丧失大部分，因此淀粉和面筋可得到水。面筋变得易于揉和、延伸性好，淀粉则更易于凝胶化。可以结合乳化剂或作为其替代物使用戊聚糖酶。
此外，在从淀粉生产糖浆的方法中可使用糖酶，该酶被广泛用于软饮料、糖果、肉制品、乳制品、面包制品、冰激淋、婴儿食品、果酱中。
淀粉的转化通常经由三个步骤完成。
首先是使用α-淀粉酶液化淀粉，得到主要由寡糖和糊精组成的麦芽糖糊精。
然后用淀粉葡萄糖苷酶处理该混合物，以便将寡糖和糊精水解为葡萄糖。这样即获得了甜味剂产品。如果需要得到高麦芽糖含量的糖浆，可以单独或者与支链淀粉酶(脱支酶)结合使用β-淀粉酶。
通过将葡萄糖混合物异构化为果糖，可以使其变得更甜。为此，可以使用固定化的葡萄糖异构酶。
在制糖业中，常常会促进苷蔗汁中淀粉的降解，由此降低粗制糖中的淀粉含量，便于精炼厂内进行过滤。
此外，还使用葡聚糖酶降解粗制糖汁和糖浆中的葡聚糖。
在醇工业中，使用α-淀粉酶使麦芽汁中的淀粉变稀薄一些比较有利。
在酿酒业中，α-淀粉酶被用来辅助液化。
在乳品业中，为了生产低乳糖牛奶供乳糖吸收障碍之人享用，常使用β-半乳糖苷酶(乳糖酶)。
由经乳糖酶处理的牛奶中生产风味乳饮料时，可降低糖的添加量而不影响产品的甜度。
生产浓缩牛奶时，经乳糖酶处理可以避免乳糖结晶，因而使乳糖晶体内酪蛋白凝集造成的粘稠问题得到缓解。
由经乳糖酶处理的牛奶(或乳清)生产冰激淋时，不会形成乳糖晶体，因而可以避免沙质感这一缺点。
此外，已知木聚糖酶可用于诸如WO 94/21785(Novo NordiskA/S)所述的多种食品/饲料工业应用中。
可在动物工业中使用α-淀粉酶，将其添加到含谷物的饲料中可以改善淀粉的消化力。抗微生物多肽在肉类加工业中可以使用某些细菌分解酶以便例如清洗畜体(参见Novo Industri A/S的美国专利第5354681号)。转移酶在食品和饲料加工中使用本发明变应原性有所降低的转谷氨酰胺酶可能比较有利。
转谷氨酰胺酶能够交联蛋白质。
这一性质可以用来使含有蛋白质的水相凝胶化，当生产膏类时可以利用该性质(Novo Nordisk A/S的WO 96/08156)。
现正使用转谷氨酰胺酶，通过修饰待用于制备蛋糕的小麦面粉而提高面粉的烘烤性质，得到性质有所改善的蛋糕，例如滋味、坍陷、口感有所改善并且体积更大(参见JP1-110147)。
转谷氨酰胺酶还可用于生产膏型食品材料，在例如冰激淋、顶端配料、冷冻甜点、蛋黄酱和低脂膏等食品中用作脂肪替代品。
转谷氨酰胺酶还可用于由牛奶和牛奶样产品制备凝胶以用于酸乳酪、奶油炼、乳酪、布丁、桔汁中，用于结合碎肉产品，改善食物蛋白质的味道和稠度(参见Novo Nordisk A/S的WO 94/21120和WO 94/21129)。肌醇六磷酸酶本发明的肌醇六磷酸酶用于加工食品(如早餐谷类食品、蛋糕、糖果、饮料、面包或汤等)和动物饲料可能比较有利。
可以利用肌醇六磷酸酶来充分开发利用存在于植物蛋白来源中的肌醇六磷酸盐/肌醇六磷酸上结合的磷，或者开发利用结合于肌醇六磷酸复合物上的重要营养矿物质。
可以将微生物的肌醇六磷酸酶添加到单胃动物的饲料中，以避免向饲料中添加无机磷(参见美国专利第3297548号)。
此外，肌醇六磷酸酶还可用于大豆加工中。大豆粉可能含有高水平的抗营养因子肌醇六磷酸盐，这使得该蛋白质源不适合用于婴儿食品和鱼类、小牛及其它非反刍类动物的饲料中，因为肌醇六磷酸盐会螯合其中的必需矿物质(参见EP0 420 358)。
肌醇六磷酸酶还可用于烘烤目的。对含有小麦粉等及肌醇六磷酸酶的生面团的小块进行烘烤可以制成性质更优良的面包(参见JP-0-3076529-A)。
已知具有高肌醇六磷酸酶活性的曲霉可以用来生产精炼清酒(参见JP-0-60707049-A)。材料和方法材料酶PD498WO 93/24623中所示的枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中显示。
枯草杆菌蛋白酶DY分离自芽孢杆菌变种、示于SEQ ID NO3的枯草杆菌蛋白酶类型蛋白酶(Betzel等(1993)，生物物理学档案，302卷，2，P.499-502)。
ELISA试剂辣根过氧化物酶标记的猪抗兔Ig(Dako，DK，P217，稀释度1∶1000)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀释度1∶100)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀释度1∶200)。
生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed03-9140；稀释度1∶1000)生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体(Serotec MCA336B；稀释度1∶2000)链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Kirkegard和Perry 14-30-00；稀释度1∶1000).
缓冲液和溶液-PBS(pH7.2(1升))NaCl8.00gKCl 0.20gK2HPO41.04gKH2PO40.32g-洗涤缓冲液 PBS，0.05％(v/v)Tween20-封闭缓冲液 PBS，2％(wt/v)脱脂奶粉-稀释缓冲液 PBS，0.05％(v/v)Tween20，0.5％(wt/v)脱脂奶粉-柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH5.0-5.2(1升))柠檬酸钠20.60g柠檬酸 6.30g-终止溶液(DMG缓冲液)-硼酸钠，硼砂(Sigma)-3，3-二甲基戊二酸(Sigma)-CaCl2(Sigma)-Tween20聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(Merck目录号822184)
-N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)-碳酰氯(Fluka art.79380)-乳糖(Merck 7656)-PMSF(苯基甲基磺酰氟)Sigma-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰基对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩尔。
-mPEG(Fluka)着色底物OPD邻苯二胺，(Kementec目录号4260)试验动物Brown Norway大鼠(得自Charles River，DE)设备XCEL II(Novex)ELISA读数仪(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S(购自Pharmacia，SW.)SLT购自SLT LabInstruments的Fotometer。
大小排阻层析仪(Spherogel TSK-G2000 SW)。
大小排阻层析仪(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon小槽方法Brown Norway大鼠的气管内(IT)刺激使用具有21/2英寸长度金属探头的一次性注射器进行气管内施用分子。将这一探头插入进大鼠的气管中大约在会厌下1cm，放置0.1ml的分子溶液。
试验动物是每组10只的Brown Norway大鼠(BN)。在实验开始时重量大于200克，实验结束时重量大约450克。
确定Brown Norway大鼠中IgE抗体相对浓度的ELISA方法使用三层夹心ELISA(three layer sandwish ELISA)确定特异性IgE血清抗体的相对浓度。
1)用10mg小鼠抗大鼠IgE缓冲液1包被ELISA板。50μl/孔。在4℃下温育过夜。
2)倒空板并以封闭缓冲液在室温下封闭至少1/2小时。200μl/孔。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
3)与大鼠血清一起温育，从未稀释的血清开始，并以2倍稀释度连续稀释。留一些孔仅用缓冲液4处理(空白)。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
4)在稀释缓冲液中将酶稀释成适当的蛋白质浓度。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
5)用稀释缓冲液稀释特异性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用于检测结合抗体。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
6)用稀释缓冲液稀释辣根过氧化物酶偶联的抗pIg抗体。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
7)于底物缓冲液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制备好该溶液后立即使用。温育10分钟。50μl/孔。
8)终止反应加入终止溶液，50μl/孔。
9)在492nm对平板读数，以620nm的读数作为参照。数据用Lotus软件计算并显示。
测定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)，通过标准方法进行蛋白质的电泳分离。蛋白质通过银染检测。相对于Novex的Mark-12宽范围分子量标准的迁移率测量分子量。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和对硝基苯胺之间的键，产生在405nm吸收的可见黄色。
缓冲液例如Britton和Robinson缓冲液pH8.3底物将100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亚砜(DMSO)中。将100μl的这种溶液用Britton和Robinson缓冲液稀释成10ml。
分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下监测作为时间和ABS405nm/min的函数的吸光度。应该控制温度(在20-50℃之间，取决于蛋白酶)。这测量的是样品中的蛋白酶活性。
实施例实施例1用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 350将mPEG 350溶解在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常压力下蒸馏除去约20％以共沸干燥反应物。当溶液冷却到20℃时，加入甲苯中的碳酰氯(1.93M 1.5摩尔/摩尔mPEG)，混合物在室温下搅动过夜。混合物减压蒸发，所得的中间产物氯甲酸酯为油状。
在蒸发之后，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，4ml/g干燥mPEG)以重新溶解该无色油。以固体形式加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.5摩尔/摩尔mPEG)，然后加入0℃的三乙胺(1.1摩尔/摩尔mPEG)，可观察到三乙胺盐酸盐(Et3N·HCl)立即沉淀下来。将混合物室温下搅动过夜。用多孔玻璃滤器(G5)过滤混合物以除去Et3N.HCl。将滤过液减压蒸发至干燥，得到98％(mol/mol)的油。核磁共振表明有85-95％被活化和小于10o/o(mol/mol)HNEt3Cl。mPEG 350琥珀酰亚胺碳酸酯(CDCl3)的1H-NMR为d 1.42 t(I＝1.4 CH3，于HNEt3Cl)，2.68s(I＝3.4未反应的NHS)，2.84s(I＝6.2琥珀酰亚胺)，3.10dq(I＝1.0 CH2i HNEt3Cl)，3.38s(I＝5.8 CH3i OMe)，3.64bs(I＝50主峰)，4.47t(I＝3.0，PEG中的CH2)。
实施例2PD498蛋白酶与活化的mPEG 350的偶联在6ml的终体积内，于50mM硼酸钠(pH9.7)中，将62mg PD498与20mg(约200μl)用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG350(按照实施例1制备)一起温育。通过磁性搅拌，在室温下进行反应。反应时间是2小时。通过添加0.5M琥珀酸至终pH为6.0来终止反应。所得衍生物的分子量大约是33kDa，相当于每摩尔PD498偶联了大约11摩尔mPEG。
与亲本酶比较，修饰多肽对肽底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe酰基对硝基苯胺)的剩余活性接近100％。
实施例3枯草杆菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 350使用与实施例2中所述相同的方法，将枯草杆菌蛋白酶DY蛋白酶与经N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG350进行偶联。
对本领域技术人员来说显而易见的是，参照前述公开内容，在本发明的实施中可以作很多修改和变化而不偏离其精神和范围，因此，本发明的范围应理解为是下述权利要求所定义的内容。
实施例4小mPEG聚合物的PD498偶联物的Brown Norway大鼠气管内(IT)实验将已知蛋白质浓度(由衍生物的光密度和氨基酸序列分析测定)的PD498样品稀释至0.75μg蛋白质/ml。
将稀释样品等分成1.5ml组分以用于各个免疫接种。将这些组分储存于-20的稳定条件下备用。在研究开始和结束时进行分析。每次免疫和分析均取用一个新组分。
如上述实施例所述将酶偶联物偶联上N-琥珀酰亚胺活化的mPEG350、550、750。用相应的亲本酶作对照。
检测以下样品组1PD498(未偶联的亲本酶-对照)组2PD498-SPEG 750组3PD498-SPEG 550组4PD498-SPEG 350用0.9％(wt/vol)NaCl溶液100μl(对照组)或者上述PD498蛋白质稀释液100μl免疫大鼠，每周一次，共15次。
每组有10只Brown Norway大鼠。每隔一次免疫之后一周、但在下次免疫之前从眼部取血样(2ml)，通过凝血和离心得到血清。
用上述特异于大鼠IgE的ELISA试验检测特异IgE水平，从血清未稀释液开始测定各1/2稀释度的滴度，测定492/620nm的光密度。
IT实验的结果示于下述表中，显示研究结束时在用相应PD498衍生物处理的Brown Norway大鼠中观察到的每100μl血清的总光密度值。
从表1可以看出，与气管内暴露于未修饰亲本酶的大鼠相比，气管内暴露于偶联了小聚合物的PD498偶联物的大鼠其特异性IgE应答水平降低，因此变应原性有所降低。
实施例5枯草杆菌蛋白酶DY偶联物的Brown Norway大鼠气管内(IT)实验重复实施例4所述的Brown Norway大鼠IT研究，对枯草杆菌蛋白酶DY-SPEG750偶联物和相应的亲本枯草杆菌蛋白酶DY(见SEQID NO3)作一比较
鲸蜡醇 5gTween80 7g水相一丙二醇(MPG) 10g0.4％柠檬酸缓冲液*pH5.842.9g对羟基苯甲酸甲酯0.1gPD498-SPEG550**10mg(以酶蛋白计)分开混合油相和水相，并加热至80℃。一边搅拌一边将油相缓慢倒入水相中，将混合物冷却到约35℃，加入PD498-SPEG550偶联物，使护肤蜜快速冷却。*0.4％柠檬酸一水合物，pH调至5.9**通常以添加有MPG的制剂提供。应根据酶制剂中MPG的量调节水相中的MPG。护肤胶(制成100g)MPG 20g*H2O 约100g柠檬酸0.4g**Carbapol 940 1gPD498-SPEG350 10mg(以酶蛋白计)按以上顺序混合各成分，在加入carbapol之前调节pH至5.6。加入carbapol之后再调节pH。*根据酶制剂中的量进行调节。**pH5.6
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsveard(E)国家丹麦(F)邮区代码(ZIP)DK-2880(G)电话45 4444 8888(H)传真45 4449 3256(ii)发明名称一种被修饰多肽(iii)序列数5(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度840个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(B)菌株芽孢杆菌PD498，NCIMB No.40484(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT 144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT 192Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT GTT GCC GGT ACT GTT 240Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80GCT GCT GAT ACG AAC AAT GGA ATT GGC GTA GCC GGT ATG GCA CCA GAT 288Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95ACG AAG ATC CTT GCC GTA CGG GTC CTT GAT GCC AAT GGA AGT GGC TCA 336Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110CTT GAC AGC ATT GCC TCA GGT ATC CGC TAT GCT GCT GAT CAA GGG GCA 384Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125AAG GTA CTC AAC CTC TCC CTT GGT TGC GAA TGC AAC TCC ACA ACT CTT 432Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140AAG AGT GCC GTC GAC TAT GCA TGG AAC AAA GGA GCT GTA GTC GTT GCT 480Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160GCT GCA GGG AAT GAC AAT GTA TCC CGT ACA TTC CAA CCA GCT TCT TAC 528Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175CCT AAT GCC ATT GCA GTA GGT GCC ATT GAC TCC AAT GAT CGA AAA GCA 576Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190TCA TTC TCC AAT TAC GGA ACG TGG GTG GAT GTC ACT GCT CCA GGT GTG 624Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205AAC ATA GCA TCA ACC GTT CCG AAT AAT GGC TAC TCC TAC ATG TCT GGT 672Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220ACG TCC ATG GCA TCC CCT CAC GTG GCC GGT TTG GCT GCT TTG TTG GCA 720Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240AGT CAA GGT AAG AAT AAC GTA CAA ATC CGC CAG GCC ATT GAG CAA ACC 768Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255GCC GAT AAG ATC TCT GGC ACT GGA ACA AAC TTC AAG TAT GGT AAA ATC 816Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270AAC TCA AAC AAA GCT GTA AGA TACAsn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr 840275 280(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度280个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度274个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(B)菌株芽孢杆菌变种(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala3540 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser130 135 140Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser145 150 155 160Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly180 185 190(Ala/Ser) Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser Thr Tyr195 200 205Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Asn Leu245 250 255Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala260 265 270Ala Gln(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度433个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(B)菌株芽孢杆菌Y种(xi)序列描述SEQ ID NO4Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Leu Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155 160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly180 185 190Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly195 200 205Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr210 215 220Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp225 230 235 240Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala245 250 255Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile260 265 270Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu275 280 285Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln290 295 300Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val305 310 315 320Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe325 330 335Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp340 345 350Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp355 360 365Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe370 375 380Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn385 390 395 400Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln405 410 415Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val420 425 430His(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度316个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(B)菌株Bacillus Thermoproteolyticus(xi)序列描述SEQ ID NO5Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp1 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165 170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 31权利要求
1.一种被修饰多肽，其特征在于，其上有分子量为100-750Da的聚合分子共价偶联到分子量为5-100kDa的亲本多肽上。
2.按照权利要求1的被修饰多肽，其特征在于该亲本多肽，尤其是酶的分子量为15-60kDa。
3.按照权利要求1或2中任何一项的被修饰多肽，其中有1-100个聚合分子、优选地4-50个聚合分子、尤其是5-35个聚合分子共价偶联到亲本酶上。
4.按照权利要求1-3中任何一项的被修饰多肽，其中所述聚合分子选自包含天然或合成均聚物和杂聚物的组。
5.按照权利要求4的被修饰多肽，其中所述聚合物分子选自包含合成聚合分子的组，所述合成聚合分子包括分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)以及聚D，L-氨基酸。
6.按照权利要求4的被修饰多肽，其中所述聚合分子选自包含天然存在的聚合分子的组，所述天然存在的聚合分子包括葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纤维素，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素；以及聚氨基葡糖的水解产物；淀粉，如羟乙基淀粉、羟丙基淀粉；糖原，琼脂糖，瓜尔胶，菊粉，支链淀粉，黄原酸胶，角叉菜胶，果胶以及藻酸。
7.按照权利要求1-10中任何一项的被修饰多肽，其中所述多肽是微生物来源的，如细菌、丝状真菌或酵母来源的。
8.按照权利要求1-7中任何一项的被修饰多肽，其中所述多肽是一种水解酶，包括蛋白酶，含丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶和金属蛋白酶，或者脂肪酶，或者氧化还原酶，如漆酶，或者超氧化物歧化酶。
9.按照权利要求8的被修饰多肽，其中所述亲本蛋白酶选自包括PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草杆菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcalase、蛋白酶T和JA16的组。
10.按照权利要求9的被修饰多肽，其中所述酶是SEQ ID NO.1所示的PD498，或SEQ ID NO.3所示的枯草杆菌蛋白酶类型的枯草杆菌蛋白酶DY，或SEQ ID NO.4所示的Lion Y。
11.按照权利要求8的被修饰多肽，其中所述金属蛋白酶是SEQID NO.5所示的嗜热菌蛋白酶。
12.一种工业组合物，其中含有偶联了分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、尤其是100-1000Da的聚合分子的被修饰多肽。
13.根据权利要求12的工业组合物，其中聚合分子的分子量为100-750Da，例如100-500Da，比如300Da左右。
14.根据权利要求12或13的工业组合物，其中包含已知用于个人护理组合物、尤其是皮肤护理组合物的诸多成分。
15.包含按照权利要求14的组合物的一种皮肤护理产品，所述护理产品选自下组肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、皂膏、化妆基料、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素、润手香脂、香粉、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、化妆底粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油、防晒品、剃须泡沫与凝胶、剃须膏、婴儿油、防治粉刺制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。
16.根据权利要求12或13的工业组合物，它是洗涤剂，例如衣物洗涤组合物、碗碟洗涤组合物或者硬表面清洁组合物。
17.根据权利要求12或13的工业组合物，它是诸如食品或饲料添加剂、特别是用于制面包等的添加剂之类的组合物。
18.根据权利要求12或13的工业组合物，它是用于处理纺织品的组合物。
19.多肽上偶联了分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、尤其是100-1000Da、如100-750Da或100-500Da或300Da左右的聚合分子的被修饰多肽用于降低权利要求12-14、16-18中任一项的工业组合物和权利要求15的产品之呼吸性变应原性的用途。
20.降低多肽变应原性的方法，包括将多肽偶联上分子量为100-5000Da、优选100-2000Da、尤其是100-1000Da、如100-750Da或100-500Da或300Da左右的聚合分子。
21.根据权利要求20的方法，其中所述多肽是权利要求8-11的具有活性的酶或者其混合物。
全文摘要
本发明涉及在分子量为5—100kDa的亲本多肽上共价偶联了分子量为100—750Da的聚合分子、呼吸性变应原性有所降低的被修饰多肽,含有呼吸性变应原性有所降低的被修饰多肽的工业组合物,皮肤护理产品,被修饰多肽用于降低工业组合物和产品的变应原性的用途,还涉及降低多肽变应原性的方法。
文档编号A23K1/16GK1265142SQ9880749
公开日2000年8月30日 申请日期1998年6月22日 优先权日1997年6月25日
发明者A·A·奥尔森, T·M·法特姆, H－J·德尤森, E·L·罗根 申请人:诺沃挪第克公司