专利名称：大豆的突变雄性不育基因的制作方法
背景技术：
本发明涉及含有突变的雄性不育基因的大豆(Glycine max)种子，大豆植物，大豆品种和大豆杂种。本发明进一步涉及生产杂种大豆种子和植物的方法。
雄性不育是植物的一种状态，其中雄性配子体的功能被阻止了，但保留了雌性繁殖的潜力。根据遗传方式，有两种雄性不育的一般类型1)基因的或核雄性不育(gms)和2)细胞质雄性不育(cms)。雄性不育突变提供了植物育种，遗传学，繁殖生物学和分子生物学中研究的源物质。
雄性不育已经用于大豆育种研究(Brim，C.A.等人，在大豆中应用遗传雄性不育再现选择方案，作物科学13528-530，1973；Lewers，K.S.，等人，杂种大豆种子生产三个方法的比较，作物科学(出版中)，1996)，但至今，雄性不育还没有用于杂种种子的商业生产，因为目前还不能生产大量的杂种种子。在过去二十年间，在大豆中已经报道了6个基因性雄性不育突变(ms1，ms2，ms3，ms4，ms5和ms6)(Palmer，R.G.等人，在大豆和玉米中的雄性不育发育比较，细胞核(Calcutta)351-18，1992)。所有这些均是以单基因隐性性状遗传的核突变。在大豆中还没有证实细胞质雄性不育。
已经有人在许多作物种类育种程序中推荐了基因性雄性不育突变体(Horner，H.T.，等人，基因性雄性不育的机制，作物科学，351527-1535，1995)。杂种种子的控制生产是育种程序和遗传研究所必需的。最可行的方法应该利用雄性不育基因座和幼苗标记基因座之间的紧密的基因连锁。在大豆中，已知利用在雄性不育基因座和幼苗标记基因座(W1)之间的紧密的遗传连锁(Skorupska，H.，等人，ms6雄性不育大豆的遗传学和细胞学，J Hered.80403-410，1989)作为生产F1种子的共分离方法(Lewers，K.S.等人，出处同上)。与幼苗标记基因座连锁的其它大豆基因性雄性不育的鉴定将减少单个基因性雄性不育的大豆生产的遗传脆弱性。
Marrewijk，G.A.M.V.，矮牵牛中的细胞质雄性不育I.参照特定的环境影响恢复可育性，Euphytica 181-20，1969，报道了将部分雄性不育系统的表型效果进行环境修饰。温度比任何其它环境因子具有更大的影响但是，水应力，光期，营养供应，激素应用也影响了雄性不育表型(Heslop-Harrison，J.，在开花植物中性表达的实验修饰，生物综述，3238-90，1957；Edwardson，J.R.，细胞质雄性不育，BotRev36341-420，1970)。在大豆中，温度影响了msp突变体(Stelly，D.M.，等人，大豆Glycine max(L.)Merr的部分雄性不育突变系msp表型变化的鉴定，Euphytica 29539-546，1980；和Carlson，D.R.，等人，温度对部分雄性不育大豆中雄性不育的表达的影响，作物科学，25646-648，1985)。
雄性不育大豆突变体ms2和ms3导致四分体的退化，因为阻止了从包裹小孢子的愈创葡聚糖壁释放小孢子，这也是在其它非豆科物种中叙述的现象。例如，在cms矮牵牛花药中愈创葡聚糖没有在适当时间开裂导致了不育(Frankel，R.等人，在矮牵牛中愈创葡聚糖酶活性和细胞质雄性不育的时间性，生物化学遗传学3451-455，1969)。愈创葡聚糖的滞留似乎是阻止了发育代谢过程(愈创葡聚糖壁强加的物理压力)和在雄性细胞和花药室液体之间以及雄性细胞和周围组织之间的细胞间交流。
已经在几个雄性不育系统中观察到愈创葡聚糖酶(callase)的不正常行为。前面的研究表明在绒毡层中合成了愈创葡聚糖酶，然后分泌进入花药室，并且降解围绕小孢子四分体的愈创葡聚糖壁。所以，绒毡层生产和释放愈创葡聚糖酶的时间似乎是正常花粉发育的关键(Eschrich，W.，Untersuchungen uber den Ab-und Aufbau der Callose，Z Bot 49153-218，1961；Frankel，R.，等人，Supra；Mepham，R.H.，等人，在Tradescantia bracteata中绒毡层周缘质团的形成和发育，原生质68446-452，1969；Izhar，S.，等人，在矮牵牛中的雄性不育的机制pH、花药中愈创葡聚糖酶的活性和小孢子发生的停止之间的关系，理论应用遗传学44104-108，1971；Stieglitz，H.，等人，在发育的百合花药中β-1，3-葡聚糖酶活性的调节，发育生物学34169-173，1973；Worrall，D.等人，小孢子母细胞愈创葡聚糖壁的熟前分解引起转基因烟草的雄性不育，植物细胞，4759-771，1992；和Tsuchiya，T，等人，内-1，3-葡聚糖酶基因的特异于绒毡层的表达引起转基因烟草中的雄性不育，植物细胞生理学36487-494，1995)。在雄性不育高粱(Warmke，H.E.等人，高粱中的细胞质雄性不育I.在可育和不育花药中的愈创葡聚糖行为，J.Hered 63103-108，1972)和在cms矮牵牛(Izhar，S.等人，出处同上)中观察到愈创葡聚糖的熟前分裂。Worrall，D.等人，出处同上和Tsuchiya，T.等人，出处同上，报道了愈创葡聚糖的熟前分裂引起转基因烟草中的雄性不育。在ms2(Graybosch，R.A.，等人，大豆(Glycerine max)中的雄性不育I.ms2突变体的表型表达，Am J Bot 721751-1764，1985)和ms3大豆(Buntman，D.J.等人，正常和雄性不育(ms3)突变大豆(Glycine max)的小孢子发生，扫描电子显微镜学1983913-922，1983)，在cms胡椒(Homer，H.T.Jr.等人，在amel-不育胡椒(Capsicum annuum L.)中小孢子发生的光学和电子显微镜研究的比较，Can J Bot 52435-441，1974)，在cms向日葵(Horner，H.T.Jr.，在雄性不育和细胞质雄性不育向日葵(Helianthusannuus L.)，中小孢子发生的光学和电子显微镜研究的比较，Am JBot64745-759，1977)报道了愈创葡聚糖的不降解或延迟降解。这些研究表明愈创葡聚糖酶活性的时间性是小孢子正常发育的关键。
F1杂种大豆种子生产的主要障碍是大量的授粉需要大量的手工劳动。
如果可以，在大豆中利用可靠的雄性不育基因可以增加雌性植物上的结种数，并且将导致费用效率的增加，和杂种大豆种子的产率。
发明概述本发明涉及大豆种子，大豆植物，大豆品种以及产生大豆植物的方法。
更具体地说，本发明涉及具有本发明的突变雄性不育基因的大豆植物。
本发明进一步涉及通过将本发明的雄性不育植物与另一个大豆植物杂交生产杂种大豆种子和植物的方法。本发明也涉及将遗传雄性不育基因转移到其它遗传背景中。本发明的详细说明为了对用于说明书和权利要求书的一些术语进行理解，提供了下面的定义结种数一该术语指在植物成熟时在一株植物上种子的总数。
利用本发明的新雄性不育雌性可育大豆突变体进行遗传和细胞学研究。这一突变体是完全的雄性不育，并且作为命名为msMOS的单个隐性基因遗传的。在F1或F2代互交授粉之间观察到在该隐性等位基因中雌性或雄性配子的转移没有差别。对于任何先前鉴定的大豆基因性雄性不育突变体ms1，ms2，ms3，ms4，ms5，或ms6，这一突变体是非等位基因的。在不育和花色(W1)基因座之间，或在不育和柔毛色(T1基因座)之间没有检测到连锁。对可育和不育花药中的小孢子发生进行了光学显微镜和细胞学观察。雄性不育植物中小孢子母细胞(MMC)的结构与雄性可育植物中的MMC相同。酶提取分析显示在雄性不育花药中没有愈创葡聚糖酶活性，这表明正常在后四分体时期在四分体周围降解的愈创葡聚糖壁的滞留引起了不育。来自雄性不育花药的绒毡层也在四分体时期和后期显示了不正常性，表现为不正常地形成小室，以及积累致密染色物质。在成熟时，来自不育植物的花药没有花粉粒。
已经概括了对大多数大豆突变体的遗传和发育再生生物学的观察结果(Graybosch，R.A.等人，大豆中的雄性不育的总结，Am J Bot75144-156 1988；Palmer，R.G.，等人，出处同上)。在大豆突变体ms2和ms3中，雄性不育是由于在四分体时期愈创葡聚糖分解的失败引起了小孢子的败育。在本发明中观察到了导致如Jin，W.等人，新基因性雄性不育大豆(Glycine max(L.)Merr.)的遗传学和细胞学，有性植物再生1013-21；1997(引入本文作为参考)中所述的潜在的新雄性不育系中小孢子不育的相同现象。
至今，在大豆中还不知道在雌性亲本上产生高结种数的雄性不育基因。本发明的突变等位基因允许在雌性亲本上的高结种数。这一高结种率是经济地生产杂种大豆种子的关键。
遗传数据表明本发明的雄性不育大豆(“ms”)是基因性雄性不育(gms)和单个隐性等位基因单基因控制的。根据温室育种实验的结果，这是完全雄性不育系。引起雄性不育的突变发生在区别于已经鉴定的ms1，ms2，ms3，ms4，ms5和ms6大豆系的基因座上。在利用ms3和ms4的杂交组中观察到了偏斜比例。这是测试的小量F2家族的结果，因为F3数据证实了F2数据，而不是ms和ms3和ms4之间的配子相互作用。
已经利用紧密连锁的标记基因座(W1)和雄性不育基因座(ms6)的共分离生产大量的F1杂种大豆种子(Lewers，K.S.等人，出处同上)。发现在本发明的突变系中W1和T1基因座是独立于ms基因座的，这排除了在利用本发明的ms系的任何大豆育种程序中利用这些标记。
夏季温室环境不影响本发明的大豆品系的雄性不育基因的表达。与已知的雄性不育大豆突变体比较，这一新的gms突变体在表型上相似于ms2和ms3，但遗传学上是非常不同的，因为它们由不同的基因控制。所有三个突变体均导致四分体的退化，因为从包裹小孢子的愈创葡聚糖壁释放小孢子被阻止，这也是在其它非豆科种类中描述的现象。与在ms2和ms3中以及在非豆科如cms胡椒和cms向日葵中看到的相似，在本发明的ms突变系中观察到愈创葡聚糖不降解或延迟降解。
在许多被子植物的雄性不育突变中，不正常的绒毡层活性或熟前的退化与小孢子的败育相关(Laser，K.D.等人，在细胞质雄性不育被子植物中小孢子发生的解剖学和细胞学，Bot Rev 38425-454，1972；Gottschalk，W.等人，在高等植物中小孢子母细胞的遗传控制，核(Calcutta)17133-166，1974；和Koltunow，A.M.等人，在花药发育过程中发生的不同时间和空间的基因表达方式，植物细胞21201-1224，1990)。本发明的大豆雄性不育突变系中最明显的绒毡层细胞的畸形是细胞增大，积累未鉴定的致密染色物质和熟前退化。根据染色，怀疑这一累积的物质是孢粉素或它的前体。据认为绒毡层是孢粉素前体合成的位点(Echlin，P.，被子植物的小孢子发生过程中绒毡层的作用，Heslop-Harrison J编辑的《花粉发育和生理学》，Butterworths，伦敦，41-61，1971；Horner，H.T.，Jr等人，在Helianthusannuus(Cornpositae Heliantheae)中花粉壁和孔的发育，Am J Bot 65293-309，1978；和Nakashima，H.等人，来自正常和ms3突变大豆(Glycine max(L.)Merr.)的花药的组织学特征，作物科学24735-739，1984)。
不希望受理论的束缚，在这一新的基因性雄性不育系中不育的原因至少有三个可能性(1)不产生愈创葡聚糖酶，或产生的水平低于消化存在的愈创葡聚糖的临界水平；(2)愈创葡聚糖酶具有分子缺陷；和(3)在花药室的液体环境(例如，由于亚适pH)中愈创葡聚糖酶没有活性。第四个理论可能性，即愈创葡聚糖是分子缺陷的已经利用粗花药酶提取物测试了，并且不归结为这一品系雄性不育的原因。利用来自雄性不育花药的粗提取物可以消化突变体ms系的花药的四分体愈创葡聚糖壁。
本发明的新的基因性雄性不育系由于高水平的结种数对于部分的育种程序是有价值的。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，可以再生大豆植物的组织培养的植物细胞，植物愈伤组织，植物团块，和在植物或植物的部分中是一个整体的植物细胞，如花粉，花，种子，荚，叶子，茎和诸如此类。
实施例提供了下面的实施例进一步说明本发明，并且不打算在附加的权利要求中阐述的限制下再限制本发明。实施例1 在ms突变体大豆系中证实雄性不育从Midwest Oilseeds，Adel，Iowa获得了雄性不育系msMOS的种子。这一品系在田间具有不寻常的高结种数。为了测试雄性不育的完整性，在1995年夏天，在缺乏昆虫授粉者时，在Iowa州大学，Ames的温室培养已知杂合子的子代300个植物。在花开期，根据存在或缺乏花粉将植物分类成可育和不育。将可育植物去杂。保存雄性不育植物，并且在植物完全开花后一个月检测结种数。
在不存在昆虫授粉者的温室实验中，在雄性不育植物中没有形成荚，表明这是完全的雄性不育系，并且夏季温室环境(1995年6月到8月)没有影响雄性不育基因的表达。实施例2 ms突变体大豆系的遗传分析为了确定是否突变是细胞质雄性不育突变体，进行了遗传研究。为了确定是在新基因座产生新突变，还是在表1显示的先前叙述的基因座(ms1，ms2，ms3，ms4，ms5或ms6)的一个出现了独立的突变，进行了等位性测试。利用已知的退化的不育纯合体作为雌性亲本和来自Midwest Oilseeds的F1杂种(杂合体)作为雄性亲本进行杂交。在Iowa州立大学，Ames，或在Puerto大学Rico大豆育种繁育场(IsabelaSubstation，Isabela，Puerto Rico)的温室种植F1种子。在靠近Ames，Iowa的Bruner农场将F1植物单一植物脱粒并种植F2种子。对于一些杂交组合，在Puerto Rico将可育的F2植物单一植物脱粒并种植F3种子。在成熟时就雄性不育/可育划分所有的F1，F2和F3植物。表1在大中基因性雄性不育雌性可育突变体的表型表达。还没有细胞学地研究突变体ms5 ms5；ms ms ms ms是本发明的突变体。突变体 性母细胞 四分体 小孢子 花粉ms1 ms1 --- 不能胞质分裂，绒毡层退化 --- ---ms2 ms2 --- 愈创葡聚糖滞留，不形成小孢子壁， --- ---绒毡层退化ms3 ms3 --- 愈创葡聚糖滞留，小孢子壁开始形成，--- ---绒毡层退化ms4 ms4--- 不能胞质分裂，绒毡层退化 --- ---ms6 ms6--- 绒毡层退化--- ---msp msp在前成熟分裂细胞和花粉时期之间发生了不一致，败育msmsmsms --- 愈创葡聚糖滞留，小孢子壁开始形成 --- ---
从等基因测试进行了F2家族的分类。如果msMOS是在不同于所测试的基因座上的突变体，F1群体将只含有雄性可育植物，在F2，50％的F1起源的家族将以3个雄性可育植物比1个雄性不育植物的比例分离，50％将产生9个雄性可育植物比7个雄性不育植物的群体。在任何F1子代中没有观察到雄性不育植物。这表明在本发明的基因性雄性不育突变体中雄性不育的等位基因是在不同于6个已知的大豆基因雄性不育基因座的基因座上。在F2子代中，存在具有差不多同等频率的两个家族种类，除了ms3和ms4。这些家族以3∶1或9∶7的比例分离。这些数据表明单个隐性等位基因单基因控制了ms雄性不育，并且所以不同于6个已知的大豆雄性不育基因座。关于ms3和ms4，在F2子代中存在两种分离的方式。对于ms3，11个家族以3∶1的比例分离，2个家族以9∶7的比例分离。从ms3杂交结合的可育的F2(9∶7)家族遗传的F3植物的分类证实了F2(9∶7)的比例。对于ms4，1个家族以3∶1比例分离，7个家族以9∶7的比例分离。同样，从ms4杂交结合的单个F2(3∶1)家族遗传的F3植物的分类证实了F2(3∶1)的比例。
利用来自Midwest Oilseeds的F1杂种作为雄性亲本进行雄性配子转移测试。利用5个植物导入(P1)系(P191167，P1261474，P1427099，P1297544，P1227333)和栽培品种A.K.Harrow作为雌性亲本进行杂交授粉。
在表2和3中显示了在雄性配子转移测试中从杂交授粉获得的F2植物的分类。表2显示了非分离和分离家族的比例是1∶1，表明两个雄性配子等同转移。在分离的F2家族中观察到了3个可育植物比1个不育植物的比例(表3)，表明利用单个隐性基因导致了雄性不育性。所以，命名本发明的基因性雄性不育突变体为msms，它的可育杂合体为msms msms。表2雄性配子体转移测试F2数据杂交组合 家族数X2(1∶1) P(df＝1)不分离 分离PI 91167xM2 9 17 2.46 0.12PI 261474xM2 10 8 0.22 0.64PI 427099xM2 7 6 0.08 0.78PI 297544xM2 12 6 2.00 0.16PI 227333xM2 8 9 0.06 0.81A.K.HarrowxM26 5 0.09 0.76总数 52 51 0.01 0.92表3在分离的F2家族中可育/不育的分离杂交组合 植株数 X2(3∶1) P(df＝1)可育不育PI 91167xM2 978 306 0.93 0.33PI 261474xM2 505 161 0.24 0.62PI 427099xM2 379 136 0.55 0.46PI 297544xM2 479 159 0.00 1.00PI 227333xM2 747 249 0.00 1.00A.K.HarrowxM2 449 129 2.21 0.14总数 353711400.97 0.32在本发明的雄性不育突变体和花色基因座(W1)之间，和雄性不育突变体和柔毛色(T1)基因座之间进行连锁测试。对于列出为Xx和Yy的基因对，利用一般的关系a＝XY，b＝Xy，c＝xY和d＝xy(Skorupska，H.，等人，出处同上)表示连锁测定。在开花时将植物分类成具有紫色或白色的花，在成熟时，将植物分类成具有黄灰色或灰色的柔毛。
在ms和W1(花色)基因座之间测试连锁，利用P＝0.45计算X2＝2.65，并且对于在msms和T1(柔毛色)基因座之间的独立分类，X2＝0.30和P＝0.96。在两个测试中，观察到的值符合预期的比例9∶3∶3∶1。在ms和W1基因座或在ms和T1基因座之间没有连锁。实施例3 在雄性不育大豆中花药发育的细胞学分析从雄性可育和雄性不育植物收集各种大小的再生芽获得花药和花粉发育细胞学观察。在I2K1的水溶液中压扁后期的花药鉴定雄性可育和雄性不育植物(Jensen，W.A.，植物组织化学，Freeman，旧金山，203页，1962)；来自雄性可育植物的花药展示了密度染色花粉粒，而来自雄性不育植物的花药差不多是空的，只有少数染色的个体。分解来自两个系的芽，在4℃，在0.1摩尔/升磷酸缓冲液，pH7.24，3％戊二醛中固定个别花药14-16小时。在三次缓冲液洗涤后，在相同的缓冲液中，在室温在1％锇酸中后固定花药1小时，利用缓冲液再次洗涤，在分级的丙酮系列中脱氢，在Spurr树脂(硬受体)中包埋，并且在70℃多聚化24小时。
在Reichert Ultracut S切片机中切片样品块。对于光学显微镜观察，利用亚甲天蓝II和碱性品红染色1微米厚的切片(Humphrey，C.D.，等人，对于环氧包埋组织切片的简单的亚甲天蓝II碱性品红染色，染色技术，499-13，1974)。在Leitz orthoplan显微镜上观察样品和照片。
对于荧光显微镜，在3∶1的乙醇冰乙酸混合物中固定芽。移取花药并且在0.15摩尔/升磷酸缓冲液pH8.2中的0.005％苯胺蓝的溶液中压扁以便检测愈创葡聚糖的存在或缺乏(Jensen，W.A.，出处同上)。
来自本发明的雄性不育植物的花药是白色的，而不是可育植物花药的典型的黄色。同样，在成熟时，雄性不育植物的花药比可育植物的花药稍微更小。当在I2KI溶液中压扁成熟的花药时，雄性不育花药大多数含有退化的小孢子，而在可育花药中观察到了密度染色花粉粒。苯胺蓝染色表明在雄性不育花药中退化的小孢子周围保留了愈创葡聚糖。
在小孢子发生的最早期的过程中，在本发明的雄性不育植物中花药的发育似乎是正常的。四个幼小的子房室都含有表皮，内皮和多达两个体壁层围绕的产孢子大块细胞(SMCs)。最内层绒毡层将体壁层与SMCs分离开。从SMCs分化出小孢子母细胞(性母细胞)。
在分裂前期I，小细胞质液泡出现在雄性不育和雄性可育花药的绒毡层细胞中。正如进行的减数分裂，在雄性不育和雄性可育花药中性母细胞分裂成小孢子的二分体然后四分体。四分体内小孢子由愈创葡聚糖分隔开。在雄性不育花药中绒毡层细胞增大，并且变得染色致密。雄性可育花药的绒毡层细胞仍然是细胞质致密。保留了围绕来自雄性不育花药的四分体的愈创葡聚糖的鞘，并且每个小孢子细胞质变得高度具液泡的。在雄性可育花药中，愈创葡聚糖降解，释放了个别小孢子。在雄性不育花药中绒毡层的行为是可变化的。在一些子房室中，雄性细胞退化，而绒毡层保留了它的细胞质，并且似乎是有功能的，或者，绒毡层细胞变得高度具液泡或扩大。在开裂以前，在密度染色物质中一些绒毡层细胞积累。在发育的后期，绒毡层开裂成黑色物质的团块。
在四分体时期，本发明的雄性不育花药中的小孢子母细胞的发生没有进行。当仍然包裹在愈创葡聚糖中时，许多四分体萎缩和开裂。雄性不育和雄性可育花药的绒毡层壁细胞仍然完整，但在雄性不育绒毡层细胞中存在小量的细胞质。当花药成熟时，在雄性不育花药的子房室内只存在退化的细胞，而在雄性可育花药的子房室中吞噬了大量的花粉粒。甚至在或靠近开花期，来自雄性不育植物的小孢子仍然包裹在愈创葡聚糖中。实施例4 在雄性不育花药中的愈创葡聚糖酶的活性关于体外愈创葡聚糖酶活性，选择了来自可育和不育植物的已知发育时期的花。根据加以修改的Frankel，R.，等人，出处同上，从四分体时期的雄性可育和雄性不育花药提取粗愈创葡聚糖酶。从花芽除去花药，并且放置于在干冰上冷冻的1.5毫升微管中。研磨花药，利用含有0.08摩尔/升的乙酸和0.08摩尔/升的NaCl，pH4.8的提取缓冲液处理，然后允许在室温停留30分钟，然后在4℃离心15分钟。上清液含有粗酶提取物。将来自可育和不育花药的分离的四分体放置于分开的玻璃片上，加上酶提取物，用盖玻片盖上制剂。四种组合是(1)可育花药提取物加可育四分体，(2)可育花药提取物加不育四分体，(3)不育花药提取物加可育四分体，和(4)不育花药提取物加不育四分体。在37℃，在潮湿的室中，温育获得的反应混合物约18小时。在温育后，加入间苯二酚蓝(在纯乙醇中的0.1％间苯二酚蓝)终止反应，并且染色未消化的愈创葡聚糖(Frankel，R.，等人，出处同上)。确定颜色强度和四分体愈创葡聚糖壁的存在，在Leitz orthoplan显微镜上照相记录。
在雄性可育和雄性不育花药中测试愈创葡聚糖酶的活性的结果显示在利用可育花药酶提取物处理后，而不是在利用不育花药酶提取物处理后，消化了围绕分离的可育和不育四分体的愈创葡聚糖。结果表明在雄性不育花药中没有愈创葡聚糖酶活性，但在雄性可育花药中愈创葡聚糖酶是活化的。实施例5用于鉴定与本发明的雄性不育基因连锁的分子标记的方法植物材料利用219个图谱定位的重组克隆和51个SSRs筛选四个栽培品种[Williams82，Harosoy，Noir I(P1290136)和Minsoy(P127890)]和雄性不育突变体(msMOS)用于观察msMOS和其它栽培品种之间DNA的多形性。这一方法证明了突变体msMOS和Minsoy具有相当高水平的多形性(46％)。随后在1995年夏天进行msMOS和Minsoy之间的杂交。在Puerto Rico，Isabela，Isabela Substation，Pureto Rico大学大豆育种繁殖场种植F1种子。在生长室中生长F2植物，在开始4星期光期为16小时，2星期光期为14小时，13小时光期直到成熟，白天30℃，夜晚24℃。单一植物脱粒可育的F2植物，在Puerto Rico种植F3种子用于在成熟时在成功的结种数基础上区分雄性不育/可育性。
在开花时，在I2KI的水溶液中压扁后期花药鉴定雄性可育和雄性不育植物(Jensen，1962)。来自雄性不育植物的花药展示了围绕花粉粒的密度染色，而来自雄性不育植物的花药没有围绕花粉粒的密度染色(Jin，等人，1997)。在不同的日子评估每个植物2到3个花。进行Chi平方测试以便确定F2子代的表型符合3∶1的比例和F3子代符合1∶2∶1的比例以便鉴定F2的基因型。RFLP和SSR分析根据Keim等人(1988)从亲本F1和F2植物冷冻干燥的叶组织分离大豆DNA，并且利用5个限制性内切酶(HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral和TaqI)消化。通过琼脂糖凝胶电泳(10微克/泳道，0.8％琼脂糖)分离消化的DNA，根据Sambrook等人(1989)转移到Zeta Probe尼龙膜(BioRad)。利用任意引导的32P-dCTP-标记的探针杂交印迹。根据ZetaProbe建议(Bio Rad)分别在65℃和60℃进行杂交和洗涤。亲本DNA的初级筛选鉴定了用于收集来自F2子代的RFLP数据的多形性克隆。利用Chi-平方分析测试每个基因座的等位基因的分离以便确定对预期比例的符合性。收集了102个克隆的分离数据，包括来自大豆的90个(Shoemaker和Olson，1993，Shoemaker，等人，1997)和来自一般的豆(Vallejoes，等人，1992)或绿豆(Menancio-Hautea，等人，1993)的12个。
同时评估了简单序列重复(SSR)标记(Akkaya，等人，1995)，因此标记的数目达到133。对于SSR分析，PCR反应混合物含有60纳克大豆基因组DNA，1.5毫摩尔/升Mg2+，0.3微摩尔/升有义和反义引物，200微摩尔/升每种核苷酸，和1×PCR缓冲液，总体积为20微升。循环包括94℃30秒，47℃30秒，68℃30秒，在Perkin-Elmer960热循环器上进行45个循环。在TBE(0.089摩尔/升Tris-硼酸，0.089摩尔/升硼酸，0.002摩尔/升EDTA)缓冲液中在2.5％-3.5％(根据两个带的多形性片断的大小)Metaphor(FMC)琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，凝胶中掺入了溴化乙锭。实施例6 连锁分析利用Mapmaker程序(Lander，等人，1987)构建连锁图谱。将LOD得分3用作接受两个标记之间的连锁的低限。利用Kosambi(Kosambi，1944)功能以centiMorgans(cM)将重组频率转换成图谱距离。根据两点分析，对于大多数可能的顺序，Mapmaker产生了对数状值。
利用219个图谱RFLP探针筛选四个栽培品种(Williams82，Harosoy，Noir I和Minsoy)。将限制图谱与利用5个限制性内切酶(HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral和TaqI)同样消化msMOS获得的比较。msMOS和Minsoy结合证明了最高水平的多形性(46％，数据未显示)。所以，选择Minsoy作为雄性亲本与msMOS杂交用于构建F2群体。在F2子代中ms的分离F1植物是可育的。在F2中可育与不育植物的分离的比例是3∶1。这证明了Jin等人(1997)的观察，即ms是隐性基因。在子代测试后，数据证明111个F2个体的群体显示了1∶2∶1基因型分离(X2＝0.16)。实施例7 与ms连锁的RFLP和SSR标记的鉴定通过从每个连锁组选择几个RFLP标记进行F2群体的最初筛选(Shoemaker，等人，1997)。选择标记以便将每个连锁组分成小于20cM的区段。两点分析表明在连锁组D1b上ms基因与SSR标记Satt005(LOD4.7)连锁。对F2群体筛选来自连锁组的其它标记(Satt157，Satt296，Satt266，A605，A747，Bng47，Mng137，Satt141，Satt189，Satt290，B194，L161和K411)。根据从Mapmaker程序产生的LOD得分，我们发现ms基因座分别与RFLP标记B122，Bng047，和SSR标记Satt5和Satt157连锁，LOD得分分别为4.7，5，5和26。利用限制酶内切酶HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral，TaqI，AccI，AluI，HhaI，HaeIII，SspI和BamHI在基因座A605，A747，Mng137和B194没有检测到多形性，而利用SSR标记Satt296，Satt266，Satt141，Satt189和Satt290也没有观察到多形性。虽然在这一杂交中标记K411和L161是多形性的，它们独立于ms分离。RFLP和SSR标记的分离比例很好地符合了1∶2∶1比例或3∶1的比例。
虽然通过说明和为了澄清和理解的目的的实施例在一些细节上已经说明了前面的发明，正如只由附加的权利要求的范围限制的，在本发明的范围内可以进行一些变化和修改。保藏资料在1997年10月8日，以保藏登记号＿＿，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockwille，Md.20852保藏了本发明的大豆种子。
虽然通过说明和用于澄清和理解的实施例，在一些细节上已经说明了前面的发明，显然正如只由附加的权利要求的范围限制的，在本发明的范围内可以进行一些变化和修改。
权利要求
1.含有命名为msMOS的雄性不育等位基因的DNA遗传因子的大豆种子。
2.根据权利要求1所述的大豆种子，其中所述的种子含有雄性不育的隐性等位基因。
3.培养权利要求1的种子产生的大豆植物。
4.权利要求3所述的植物的花粉。
5.权利要求3所述的植物的胚珠。
6.含有权利要求3所述的植物的可再生细胞的组织培养物。
7.从权利要求3所述的植物的组织培养物再生的大豆植物。
8.生产F1杂种大豆种子的方法，包括将第一个亲本大豆植物与第二个亲本大豆植物杂交，并且收获得到的F1杂种大豆种子，其中所述的第一个或第二个亲本大豆植物是权利要求3所述的大豆植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中权利要求3所述的大豆植物是雌性植物。
10.根据权利要求8所述的方法，其中权利要求3所述的大豆植物是雄性植物。
11.培养权利要求8所述的杂种大豆种子产生的第一代(F1)杂种大豆植物。
12.于1997年10月8日以ATCC保藏号＿＿保藏的种子长出的活大豆种子和植物以及连续的子代，以及在连续的子代中雄性不育等位基因从所述的保藏种子转移到其中的大豆种子和植物。
13.将来自大豆的遗传雄性不育基因转移到另一个物种的方法，包括步骤a)分离所述的遗传雄性不育基因；b)将所述的遗传雄性不育基因与启动子结合；c)利用转化技术将遗传雄性不育基因插入另一个物种。
14.将大豆的遗传雄性不育基因转移到另一个属的方法，包括步骤a)分离所述的遗传雄性不育基因；b)将所述的遗传雄性不育基因与启动子结合；和c)利用转化技术将遗传雄性不育基因插入另一个属。
全文摘要
本发明公开了命名为msMOS的突变的雄性不育大豆系,其显示出在命名为“msMOS”的新基因座上的基因性雄性不育。雄性不育似乎是由于缺乏功能性愈创葡聚糖酶(callase)而导致的削弱的四分体退化所致。
文档编号A01H5/10GK1275048SQ98810003
公开日2000年11月29日 申请日期1998年9月10日 优先权日1997年10月9日
发明者威廉·H·戴维斯 申请人:中西油料种子公司