控制植物病虫害的组合物及方法

专利名称：控制植物病虫害的组合物及方法
技术领域：
本发明属于生物杀虫剂领域。更具体地讲，本发明涉及能够抑制广谱真菌和细菌性植物疾病并具有抗昆虫活性的枯草芽孢杆菌新菌株AQ713的发现。本发明也涉及仅包含此新枯草芽孢杆菌菌株和由此菌株产生的抗生素及代谢物、或还包含其它化学和生物杀虫剂的杀真菌、杀细菌和杀虫的组合物。
每年有价值2.5亿-3亿美元的化学杀虫剂用于控制黄瓜十一星叶甲的侵袭。许多这些化学杀虫剂对人类、野生生物和其它非靶标物种是有毒的。并且一些已在地下水中发现。开发新的化学杀虫剂需花费1亿美元。
生物控制为合成化学杀真菌剂提供了一种具有吸引力的替代方法。生物杀虫剂(活的生物和由这些生物天然产生的化合物)更为安全、更容易生物降解并且开发成本更低。
从微生物发展而来的生物杀虫剂对农业、公众健康及城镇环境的害虫综合治理来说是非常理想的。一种常用的生物杀虫剂是革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。已知杀虫的苏云金芽孢杆菌菌株在孢子形成过程中产生对某些目和种的昆虫和线虫有特异毒性的晶体蛋白(见例如，美国专利4,999,192和美国专利5,208,017)。由苏云金芽孢杆菌产生的蛋白内毒素也可作为针对黄瓜十一星叶甲和其它甲虫类的杀虫剂(见例如，美国专利5,187,091；Johnson，T.J.等(1993)，经济昆虫学杂志(J.Economic Entomology)86330-333)。已证明苏云金芽孢杆菌内毒素作为纯化的晶体、洗涤的细胞沉淀和表达的蛋白是有效的。Warren等(WO96/10083)公开了在蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽孢杆菌的营养阶段产生的非内毒素蛋白。这些称为Vip1和Vip2的营养蛋白对黄瓜十一星叶甲(northern和western)有很强的活性。Estruch等(1997)，自然生物技术(Nature Biotechnology)15137-141和Mullins等(1997)，Appl.Environ.Microbiol.63。
已证明一种称为β外毒素的苏云金芽孢杆菌热稳定代谢物也具有杀虫特性。Burgjeron和Biache(1979)(食虫动物(Entomophaga)11279-284)报道了对马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)有活性的β外毒素。另外，已知的苏云金芽孢杆菌β外毒素表现出非特异性的杀虫活性，不仅杀死线虫，也杀死蝇、粘虫、螨和黄瓜十一星叶甲。σ外毒素与β外毒素结构相似，并对马铃薯叶甲有活性(Agrauer等(1991)，J.Entomol.Sci 26206-213)。α外毒素对家蝇(Musca Domestica)的幼虫有毒性(Cluthy(1980)FEMS Microbiol.Lett.81-7)。γ外毒素是多种蛋白水解酶、壳多糖酶和蛋白酶。γ外毒素的毒性作用只有与β外毒素或δ内毒素相联合才得以表现。Forsberg等(1976)，“苏云金芽孢杆菌其在环境质量中的作用”(Bacillus thuringiensisIts effects inEnvironmental Quality)National Research Council of Canada。Stonard等(1994)ACS Symposium Series 55125报道了在蜡状芽孢杆菌菌株上清液中对黄瓜十一星叶甲具有活性的水溶性次生代谢物。
未见具广谱杀虫活性的枯草芽孢杆菌菌株的记载。
筛选程序已经鉴定了一些表现抗真菌活性的芽孢杆菌属(Bacillusspp.)(芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、苏云金芽孢杆菌)的菌株(见例如，Stabb等(1990)，Appl.Environ.Microb.604404-4412)。已证明这些菌株产生对由苜蓿疫霉(Phytophthora medicaginis)、烟草疫霉(P.nicotianae)、瓜果疫霉(P.aphanidermatum)或小核盘菌(Sclerotinia minor)(见Stabb等，同上)引起的土传猝倒病有效的两种抗生素兼性霉素A和/或Kanosamine(Milner等(1996)，Appl.Environ.Microb.623061-3066)。兼性霉素A是一种水溶性的、酸稳定的线性氨基多元醇分子(见He等(1994)，Tetra.Lett.35(16)2499-2502)。
授予Handelsman等的美国专利5,049,379描述了兼性霉素A如何在苜蓿和大豆中对猝倒病起作用。当用蜡状芽孢杆菌ATCC 53522包被种子时，根腐真菌的致病活性受到抑制。同样，将某些蜡状芽孢杆菌菌株的孢子制剂施用于大豆种子或种子周围的土壤在一些田间可提高大豆产量。(见Osburne等(1995)，Am.Phytopathol.Soc.79(6)551-556)。施用生物杀虫剂的方法在本领域众所周知，包括如可湿性粉剂、dryflowable、有效制剂的微囊化及来自合适培养物的抗生素组分的液体或固体制剂。(见例如，授予Rossall的美国专利5,061,495或授予Handelsman的美国专利5,049,379)。
Smith等(1993)(植物疾病(Plant Disease)77(2)139-142)报道了用产生兼性霉素的蜡状芽孢杆菌菌株UW85可抑制引起CottonyCucumber Leak的土传真菌瓜果疫霉的活性。Leifert等(1995)(应用细菌学杂志(J.Appl.Bacteriol.)7897-108)报道了用两个芽孢杆菌菌株，枯草芽孢杆菌CL27和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CL45制备抗葡萄孢(Botrytis)和抗链格孢(Alternaria)的抗生素。全肉汤培养物和无细胞滤液在体外测试中对葡萄孢和链格孢有活性，在Astilbe上的体内小植物测试中对葡萄孢有活性。Leifert等(1997)的美国专利5,597,565公开了枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)在抑制引起收获后疾病的真菌方面特别有效。他们还公开了无细胞培养物滤液中产生的抗生素的存在及它们在不同pH值时的活性，但他们未鉴定这些化合物。
Rossall(1994)的美国专利5,344,647公开了具有广泛抗真菌活性的枯草芽孢杆菌菌株。Sholberg等(1995)Can.J.Microbiol.41247-252、Swinburne等(1975)Trans.Brit.Mycol.Soc.65211-217、Singh和Deverall(1984)Trans.Br.Mycol.Soc.83487-490、Ferreira等(1991)植物病理学(Phytopathology)81283-287及Baker等(1983)(植物病理学731148-1152)公开了芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌作为真菌植物病原体的生物防治剂的用途。Baker等(1983)植物病理学731148-1152也报道了将抗真菌的枯草芽孢杆菌用于植物病原体。Pusey等(1998)(植物疾病(Plant Dis.)72622-626)，Pusey和Robins(美国专利5,047,239)以及McKeen等(1986)植物病理学76136-139公开了用枯草芽孢杆菌控制收获后果腐病。McKeen等，同上，也表明与低分子量的伊枯草菌素环肽相似的抗生素参与了枯草芽孢杆菌的杀真菌活性。
Liu等(1995)的美国专利5,403,583公开了巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)ATCC 55000和控制真菌植物病原体立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的方法。Islam和Nandi(1985)(植物疾病和保护杂志(J.PlantDiseases and Protection)92(3)241-246)公开了对稻胡麻斑病的致病因子Drechslera oryzae有拮抗作用的巨大芽孢杆菌。相同作者Islam和Nandi(1985)(植物疾病和保护杂志92(3)233-240)也公开了巨大芽孢杆菌对Drechslera oryzae、链格孢和粉红镰孢的体外拮抗作用。他们讨论了培养物滤液中的三种成分。活性最强的抗生素在水和甲醇中高度可溶，在255nm处有紫外吸收峰，260nm处有肩，证明它是多氧菌素样脂肽。Cook((1987)Proceedings Beltwide Cotton Production-机械化研究会议，Cotton Council，Memphis，第43-45页)公开了用巨大芽孢杆菌的悬浮液降低由棉根腐病的致病因子多主瘤梗孢(Phymatotrichumomnivorum)杀死的棉株数量。
Berdy记录了巨大芽孢杆菌的抗生素制备(CRC抗生素化合物手册，第I-XIV卷，(CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL 1980-87))，他报道了低哺乳动物毒性肽抗生素如安丝菌素-PDM-O、巨大杆菌素、巨杆菌素、五肽及同型肽(homopeptide)的制备。
已知芽孢杆菌可产生抗真菌和抗细菌的次生代谢物。Wisconsin大学和Cornell大学的研究者已鉴定了由芽孢杆菌种产生的新杀真菌化合物兼性霉素A(He等(1994)，Tetra.Lett.35(16)2499-2502)。由同种菌株产生的第二种杀真菌代谢物最近被鉴定为已知的氨基糖Kanosamine(Milner等(1996)，Appl. Environ.Microb.623061-3065)。
另一类以前描述过的芽孢杆菌代谢物是伊枯草菌素类的环状脂肽，其中一些是有效的杀真菌剂。这些制剂是由具有7个α氨基酸和一个具脂肪族侧链的β氨基酸的环形八肽组成。有几类氨基酸序列顺序和组成不同的伊枯草菌素。它们列于下文表l中。总的来说，产生了一套脂肪族氨基酸残基的长度和分支不同的相关分子。当针对酿酒酵母进行实验时，发现抗霉枯草菌素是活性最强的制剂(LC50＝10μg/ml)，其次是伊枯草菌素A和芽孢霉素L(LC50均为30μm/ml)(Beeson等(1979)，抗生素杂志(J.Antibiotics)32(8)828-833)。据报道这些环状脂肽的作用方式是由于与真菌膜相互作用而产生允许必需离子释放的跨膜通道(Latoud等(1986)，Biochem.Biophys.Acta 856526-535)。伊枯草菌素C对包括产黄青霉(Penicillium chrysogenum)在内的真菌无活性(Peypoux等(1978)，Tetrahedron Lett. 341147-1152)。
表1 伊枯草菌素家族抗生素的结构
一个USDA的研究小组通过合成许多氨基酸链长度不同的类似物研究了伊枯草菌素的结构与活性关系。研究者报道了伊枯草菌素活性随着脂肪酸侧链长度和异＞正常＞反异顺序的末端分支而升高(Bland等(1995)Proc.Plant Growth Regulation Soc.Am.第22期105-107)。根据对多种产生伊枯草菌素的芽孢杆菌菌株的研究，他们也认为“从天然产物获得的伊枯草菌素的量不足以有商业可行性”。
从蜡状芽孢杆菌中分离出的另一类环状脂肽是制磷脂菌素。这些化合物属于酰化的十肽家族，其结构示于


图1(Nishikiori等(1986)，抗生素杂志39(6)755-761)。这些化合物最初是作为猪胰磷脂酶A2的抑制剂被分离的(Umezawa等(1986)抗生素杂志39(6)737-744)，但后来发现它可抑制包括葡萄孢(Botrytis)、瘟病菌(Pyricularia)和链格孢(Alternaria)在内的一些植物致病真菌(Yamada等(1990)Nippon NoyakuGakkaishi 15(1)95-96)。Yamada也报道了由相同枯草芽孢杆菌菌株产生的伊枯草菌素A和制磷脂菌素之间的协同作用。
已进行了发酵改进方面的工作以提高在液态(Phae和Shoda(1991)，发酵生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)71118-121；Ohno等(1993)，发酵生物工程杂志75463-465)和固态发酵(Ohno等(1992)，生物技术快报(Biotech.Lett.)14(9)817-822；Ohno等(1995)，发酵生物工程杂志5517-519)中伊枯草菌素的产量。也有紧密关联而本身无活性的枯草菌表面活性剂与由相同枯草芽孢杆菌菌株产生的伊枯草菌素之间的协同作用的报道(Hiraoka等(1992)，普通应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)38635-640)。共同调节伊枯草菌素A和枯草菌表面活性剂生物合成的基因的核苷酸序列已经发表(Huang等(1993)，发酵生物工程杂志76(6)445-450)。对产生伊枯草菌素的菌株的田间工作集中于土壤处理以控制丝核菌(Rhizoctonia)(Asaka和Shoda(1996)，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microb.)624081-4085)；未见伊枯草菌素田间叶面施用的报道。
由枯草芽孢杆菌产生的另一个具有独特的表面活性剂活性的环状脂肽化合物是枯草菌表面活性剂(Kaninuma等(1969)，Agric.Biol.Chem.33973-976)。枯草菌表面活性剂含有通过内酯环与具有LLDLLDL(SEQ IDNO1)序列的七肽部分连接的C14或C15β-羟基脂肪酸(Arima等(1968)，Biochem.Biophys.Res.Commun 31488-494)。Sandrin等(1990)Biotechnol.Appl.Biochem 12370-375发现既产生枯草菌表面活性剂又产生伊枯草菌素A、芽孢菌霉素F和L以及抗霉枯草菌素的枯草芽孢杆菌菌株。
由本发明人发现的新微生物AQ713原来认为是巨大芽孢杆菌的菌株，现在被鉴定为枯草芽孢杆菌的一个菌株，其产生A伊枯草菌素、制磷脂菌素和枯草菌表面活性剂。以前未曾报道有微生物产生此种脂肽组合。另外，本发明人还发现AQ713也产生近来描述的称为“agrastatin”的化合物。所有上述三种已知化合物与新化合物agrastatin的组合也是新型的。
本发明的公开本发明提供原先鉴定为巨大芽孢杆菌的新的产抗生素和产代谢物的枯草芽孢杆菌菌株，此菌株表现广泛的杀真菌和杀细菌活性，并且也表现抗虫活性。本发明还提供来自此新枯草芽孢杆菌的对叶及地下昆虫具有活性的新代谢物。本发明还提供治疗或保护植物免受真菌、细菌及昆虫侵染的方法，包括施用有效量的产抗生素枯草芽孢杆菌的步骤。产抗生素枯草芽孢杆菌可作为全肉汤培养物中的悬浮液或作为从产抗生素芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物得到的含抗生素的上清液提供。本发明还提供治疗或保护植物根免受地下侵袭(如黄瓜十一星叶甲)的方法，包括施用有效量的这种新产代谢物枯草芽孢杆菌、其全肉汤培养物或培养物上清液的步骤。此新产代谢物枯草芽孢杆菌可作为全肉汤培养物中的悬浮液或作为从该微生物的全肉汤培养物得到的含代谢物的上清液或纯化的代谢物提供。本发明还提供了由新菌株AQ713产生的新化合物agrastatin及含伊枯草菌素A、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的组合物。
本发明还包括用AQ713的细菌悬浮液或含代谢物的AQ713培养物上清液或来自AQ713菌株的纯化代谢物处理植物根或土壤以控制昆虫侵袭的方法。
本发明还包括用此细菌菌株或从此细菌菌株获得的含抗生素的上清液或纯抗生素预防和治疗植物真菌、细菌和昆虫疾病的方法。本发明还包括用AQ713的细菌悬浮液或含代谢物的AQ713培养物上清液或来自AQ713菌株的纯化代谢物处理植物叶、根或植物周围的土壤以控制昆虫及昆虫幼虫的方法。本发明还包括溶剂可提取的、对昆虫有活性的、分子量小于10,000道尔顿的代谢物。本发明进一步包括由此新微生物产生的新化合物agrastatin。本发明也包括含A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新组合物。定义如本文所用的，“生物防治”定义为用第二种生物控制病原体或昆虫。已知的生物防治机制包括通过与真菌竞争根表面空间以控制根腐病的肠细菌。细菌毒素如抗生素已用于控制病原体。可分离毒素并将其直接用于植物，或施用细菌物种使其原位产生毒素。
术语“细菌”包括不具有明显核的任何原核生物。
术语“真菌(单数)”或“真菌(复数)”包括多种无叶绿素的具核产孢子生物。真菌的例子包括酵母、霉菌、霉、锈菌和蘑菇。
“杀真菌的”指物质提高真菌死亡率或抑制真菌生长速率的能力。
“突变体”指携带在生物表型上表达的突变基因的生物体。
“抗生素”包括任何能够杀死或抑制微生物的物质。可由微生物或通过合成方法或半合成方法产生抗生素。因此，该术语包括抑制或杀死真菌的物质，例如兼性霉素A或Kanosamine。
“抗真菌剂”包括任何能够杀死或抑制真菌生长的物质。
术语“培养”指生物在各种培养基上或各种培养基中的繁殖。“全肉汤培养物”指包括细胞和培养基的液体培养物。“上清液”指当细胞通过离心、过滤、沉降或其它本领域熟知的方法被去除后剩余的液体肉汤培养液。
“有效量”是足以获得有益或期望结果的量。有效量可以以一次或多次施用。就治疗和保护而言，“有效量”指足以减轻、稳定、逆转、减缓或延迟真菌或细菌疾病状态的量。
此处所用的术语“昆虫”包括“昆虫纲”中的所有生物。“成年前的”昆虫指成年阶段前的生物的任何形式，包括例如卵、幼虫和若虫。“杀昆虫的”指物质提高昆虫死亡率或抑制其生长速率的能力。“杀线虫”指物质提高线虫死亡率或抑制其生长速率的能力。“杀虫”指物质提高昆虫、线虫和螨死亡率或抑制其生长速率的能力。
“阳性对照”指已知具有杀虫活性的化合物。“阳性对照”包括但不限于商业上可得到的化学杀虫剂。术语“阴性对照”指已知无杀虫活性的化合物。阴性对照的例子是水或乙酸乙酯。
术语“溶剂”包括在溶液中保留另一种物质的任何液体。“溶剂可提取的”指在溶剂中溶解的，然后可从溶剂中分离的任何化合物。溶剂的例子包括但不限于诸如乙酸乙酯的有机溶剂。
术语“代谢物”指任何具有杀虫活性的微生物发酵的化合物、物质或副产品。上文定义的抗生素是对微生物有特异性活性的代谢物。
术语“agrastatin”指具有下列结构的一组新化合物(SEQ ID NO3) 其中R1是支链或直链脂肪族侧链C8-C20；X为Ala或Val；R2为乙酸或酯衍生物；Glx为Gln或Glu。这些化合物具有广谱抗细菌、抗虫及抗真菌活性。
我们描述了原先鉴定为巨大芽孢杆菌的具有广泛抗真菌和抗细菌活性并且也杀死或抑制昆虫及其幼虫的产生代谢物和抗生素的新枯草芽孢杆菌菌株。另一方面，本发明提供治疗或保护植物免受真菌、昆虫和细菌侵染的方法，包括施用有效量的从本发明枯草芽孢杆菌AQ713的全肉汤培养物获得的上清液。该上清液可通过本领域熟知的方法包括离心、过滤、沉降等获得。
另一方面，本发明提供治疗或保护植物免受真菌、昆虫和细菌侵染的方法，包括施用有效量的此新枯草芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物。
另一方面，本发明含治疗或保护植物免受真菌、昆虫和细菌疾病侵染的方法，包括施用有效量的由此新枯草芽孢杆菌菌株产生的抗生素。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物和植物根免受昆虫和幼虫侵袭的方法，包括施用有效量的从本发明枯草芽孢杆菌AQ713的全肉汤培养物获得的上清液。该上清液可通过本领域熟知的方法包括离心、过滤、沉降等获得。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物和植物根免受昆虫和幼虫侵袭的方法，包括施用有效量的此新枯草芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物。
另一方面，本发明含治疗或保护植物根免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的由该新枯草芽孢杆菌菌株产生的代谢物。
为达到本发明组合物的良好分散和粘附，用有助于分散和粘附的成分配制所述全肉汤培养物、上清液和/或代谢物/抗生素是有利的。合适的配方为本领域技术人员所熟知。
本发明的组合物可配制成可湿性粉剂、颗粒等，或在合适的介质中胶囊化等。其它制剂的例子包括但不限于可溶性粉末、可湿性颗粒、dryflowables、aqueous flowable、可湿性可分散颗粒、可乳化的浓缩液和水悬浮液。其它适当制剂为本领域技术人员熟知。
在本发明的另一方面中，本发明提供了一组命名为“agrastatin”的新化合物。这些化合物表现出抗细菌和抗真菌活性以及抗昆虫活性。
在本发明的另一方面中，本发明提供了含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合。
在本发明的另一方面中，本发明提供了治疗或保护植物免受昆虫、真菌和细菌疾病侵害的方法，包括施用有效量的含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型化合物组合。
本文进一步提供了从AQ713菌株分离的具有杀虫活性的脂肽提取物及从AQ713菌株分离的具杀昆虫活性的枯草菌表面活性剂脂肽。因此，本发明也提供了通过对叶、根、或植物或根周围的土壤施用有效量的分离的lipofectin或分离的枯草菌表面活性剂来治疗或保护植物和/或果实免受昆虫侵袭的方法。这些分离的成分可和其它已知的杀虫剂(pesticide或insecticide)联合，并可按以上对AQ713的描述配制，以可湿性粉剂、颗粒、flowables或微囊化的形式施用。
在此引用的所有专利和公开文献作为整体以参考文献形式并入本文。提供下面的实施例详细说明本发明。这些实施例不构成限制。
实施例实施例1 AQ713菌株的特征分析根据Bochner(1989)(自然(Nature)338157-158)描述的以利用Biolog微量培养板系列(Biolog，Inc，Hayward，CA)为基础鉴定分离物。Biolog微量培养板由革兰氏阳性和革兰氏阴性菌可利用的95种不同碳底物板的预先填充和干燥的系列孔组成。分离物于28℃在液体培养基中生长，24小时后将洗涤的细胞悬浮液(0.85％盐溶液)接种在GP Microplate(Biolog，Inc.)的每个系列孔中。在28℃经过24小时后，评估碳利用反应。将底物利用模式与Biolog革兰氏阳性数据库(release 3.50)比较并根据最近似物种分离。Biolog结果得出其与巨大芽孢杆菌的相似性指数为0.883。
美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801 University Blvd.，Manassas.VA，20220-2209)对AQ713进行了更为广泛的鉴定。送交的分离物为未知；菌株AQ713分离物鉴定为根据可得到的生理和生化数据，此菌株与枯草芽孢杆菌最近似。细胞形态发现游动细胞为单个，具有在中间或近端区形成的一个内在孢子。细胞为革兰氏阳性均匀染色。菌落形态菌落不透明和不规则，有凸形隆起、粗糙暗淡表面和锯齿形边缘。
菌株AQ713的特征数据
意见根据可得到的生理和生物化学数据，此菌株与枯草芽孢杆菌最近似。
主要特征结果
参考文献Gordon，R.E.，W.C.Haynes和C.H.IV.Pang，1973，芽孢杆菌属，美国农业部427号手册，Washington D.C.。实施例2 AQ713针对黄瓜十一星叶甲的活性在芽孢杆菌培养基中培养芽孢杆菌样品。培养基2含5％蛋白胨、5％葡萄糖、3％酵母提取物、3％麦芽提取物、1.5％proflo棉籽提取物(59％蛋白、4.26％脂肪、6.73％灰分、3.19％纤维和痕量的棉酚；用水平衡)、10％大豆粉和0.5％ MgSO4x7H2O。培养基3除另含20％蛋白胨和3.4％KH2PO4和4.3％K2HPO4外其它成分相同。将生长一天的划线培养物接种于250ml带挡板的摇瓶中。于29℃以200rpm振荡摇瓶5天。为测定杀昆虫活性，以5,200rpm离心35ml肉汤培养物20分钟，上清用于下文所述的微量测定。
在96孔微量培养板上进行测定。每个孔中含固体琼脂基质、检测生物和阳性对照或阴性对照或按照实施例1所述从新芽孢杆菌菌株获得的上清液。
为了测定杀昆虫活性，根据Marrone等(1985)(J.Econ.Entomol.78290-293)制备用于微量培养板孔的琼脂基质。为分析杀线虫活性，在孔中以普通琼脂(1.5％)替代。
用1ppm的Avid(除虫菌素)溶液作为阳性对照。用去离子水作为阴性对照。每个分析中使用相同的两份测试样品或对照。将在培养基1、2或3中培养的40μl上清液样品或全培养物分装在每个样品孔中。将平板放在通风厨中干燥约2-3小时直到琼脂溶液干燥。
测试生物是成年前的黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata)、成年前的德国小蠊(Blatella germanica)、成年前的贪夜蛾(Spodoptera exigua)、成年前的黑尾果蝇(Drosophilamelanogaster)或线虫Caenorhabditis elegans的N2株。将检测生物于0.1％琼脂中稀释至浓度为每25μl分装在每孔中的琼脂含5个生物。用不透气物质如Mylar密封微量培养板并且用针式压力器对每个孔通气。平板于27℃培养最多7天。
培养后，通过观察线虫死亡率或幼虫发育程度记录孔情况。对含全部死亡或生长障碍幼虫的样品孔给出分值1，对含一些死亡和其它严重生长障碍幼虫的样品孔给出分值2，对含存活但生长障碍幼虫的孔给出分值3，对不含死幼虫的样品孔给出分值4，每个样品内计算重复实验的平均值。结果总结于表2和表3。
表2AQ713抗昆虫害虫的分值等级(全肉汤培养物实验)
NT＝未检测表3AAQ713抗昆虫害虫的分值等级(上清液实验1)
这些实验表明AQ713作为全肉汤培养物在两种培养基中都有活性，在培养基2中活性最高。AQ713只有在培养基2中生长时，上清液才有活性。二号检验在摇瓶或10升发酵罐中以第三种培养基即培养基4对AQ713再次进行针对贪夜蛾及黄瓜十一星叶甲的实验。培养基4包含培养基3中除proflo棉籽提取物外的相同成分。其它所有程序均与以上一样。实验重复了2-3次。
表3BAQ713抗昆虫害虫的分值等级(上清液实验)
在培养基4中AQ713上清液及全肉汤具有抗黄瓜十一星叶甲及贪夜蛾的高活性。实施例3 AQ713抗桃蚜的活性在培养基4中使用在两个不同的10升发酵罐内两次和在一个400升发酵罐内两次生长48小时的分批次AQ713进行检验。除对黄瓜十一星叶甲及贪夜蛾进行测试外，还对桃蚜(Myzus persicae)进行了测试。对400升的其中一批次既进行全肉汤培养物(WB)测试又进行上清液(S)测试。在96孔平板8个孔每一个的底部小滤纸圆片上滴加40μl的AQ713样品以测试桃蚜。然后将平板置于通风橱中干燥1-2小时。轻轻拍落甘蓝叶片上的蚜虫使其加入到每个孔中。孔底部为蚜虫覆盖。孔柱填充后，用盖片将平板盖住以将蚜虫固定。测试板在20-22℃下孵育。48小时后利用显微镜对死、活的蚜虫记数以对测试进行等级鉴定。象对其它昆虫一样，然后为这些孔给出l至4级尺度上的分值(4为无死亡昆虫，1为100％被杀死)。
表4AQ713抗桃蚜的分值等级--上清液(S)及全肉汤培养物(WB)实验桃蚜阳性对照 阴性对照10升(1) S 2.0 1.0 4.010升(2) S 2.0 1.0 4.0400升(1)S 1.0 1.0 4.0400升(2)WS 1.0 1.0 4.0400升(2)S 1.0 1.0 4.0针对AQ713小量及大规模发酵的测试显示全肉汤培养物与上清液均对杀灭桃蚜高度有效。实施例4 AQ713抗桃蚜的植物检验在温室内的6个容器中栽植有6英寸高的胡椒植物(Yolo Wonder)。允许胡椒植物被寄居在温室内的桃蚜虫口自然侵染。以手提式喷雾器喷洒胡椒植物至溢出。被检验的AQ713样品为全肉汤培养物和生长于400升发酵罐内培养基4中的全肉汤培养物喷雾干燥粉剂。3天后，经AQ713处理的胡椒植物上75％的蚜虫被杀死。在未处理或以水处理的胡椒植物上无死亡蚜虫。实施例5具有抗黄瓜十一星叶甲活性的AQ713代谢物的化学特性在培养基2中培养50ml AQ713。向每一培养物添加50ml乙酸乙酯，混合物在分液漏斗中摇动2分钟。移去水层，将有机层收集在含有硫酸镁的瓶中。然后将有机滤液过滤到圆底烧瓶中，将溶剂移到rotovap上。
为了进行生物测定，将干燥的有机提取物重新溶解在2.5ml丙酮中。取出40μl等分试样，以70％丙酮/水稀释至800μl。这是有机提取物的10x浓缩液。进行系列稀释以获得作用于新生黄瓜十一星叶甲的样品，7天后记录新生幼虫(根据上文制备的微量培养板中每孔1个)死亡百分率。结果记录在表5中。
表5AQ713乙酸乙酯提取物对黄瓜十一星叶甲的活性样品死亡百分率AQ713 有机提取物10X89有机提取物5X 93有机提取物1X 65全肉汤培养物 10070％丙酮/水 27水 59这些结果表明AQ713产生杀死黄瓜十一星叶甲的溶剂可提取的代谢物。
为了测定活性代谢物的分子量，将50ml AQ713培养物在培养基2中生长。取1ml放在微量离心管中，并以12,000rpm离心15分钟。回收上清液。将500微升上清液放在10,000道尔顿分子量Centricon滤器上面。根据厂商说明(12,000rpm，35分钟)离心。收集滤液，通过离心和洗涤滤器回收存留物。测定样品上清液、滤液和存留物对新生黄瓜十一星叶甲幼虫(含昆虫食物的96孔板，Marrone等，见上文；每孔40μl样品，每个样品8个孔，1只幼虫/孔)的活性。实验结果示于表6。
表6AQ713的分子量截流死亡百分数针对黄瓜十一星叶甲AQ713上清液 43滤液 63存留物 17这些结果表明上清液和滤液有活性，因此代谢物的分子量小于10,000道尔顿。实施例6 对植物病原体有活性的AQ713代谢物的化学特性在培养基2中培养50ml AQ713。向每一培养物添加50ml乙酸乙酯，混合物在分液漏斗中摇动2分钟。移去水层，将有机层收集在含有硫酸镁的瓶中。然后将有机滤液过滤到圆底烧瓶中，将溶剂移到rotovap上。
为了进行生物测定，将干燥的有机提取物重新溶解在2.5ml丙酮中。取出40μ1等分试样，以70％丙酮/水稀释至800μl。这是有机提取物的10X浓缩液。用终极腐霉(Pythium ultimum)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)进行96孔板植物病原体分析(下述)以测定有机提取物的活性。全肉汤培养物为100％控制(分值1)，但10X有机提取物对此两种植物病原体无控制(分值4)。这表明活性抗生素，与AQ713产生的对黄瓜十一星叶甲有活性的代谢物不同，在诸如乙酸乙酯的有机溶剂中是不可提取的。
为提取活性抗生素组分和分离新化合物agrastatin A，通过首先用等体积的乙酸乙酯抽提肉汤培养物两次并分层来制备发酵肉汤培养物的丁醇提取物。然后用等体积的丁醇抽提水相组分两次。合并丁醇提取物，用旋转蒸发器去除溶剂。冷冻干燥所得到的提取物获得粉末。
将粉末溶解在80％乙腈/水溶液中并进行超声处理。将此溶液上样到用甲醇活化并用80％乙腈/水溶液平衡过的C-18固相提取(SPE)柱上。用80％ACN/水洗脱SPE柱，收集洗脱液并去除溶剂。用HPLC进一步纯化洗脱液。采用具有如下乙腈+0.05％TFA/水+0.05％TFA溶剂梯度的C-18 HPLC柱(1cm×25cm)(210nm处紫外检测)0-20分钟，33％ACN；20-30分钟，40％ACN；30-45分钟，45-55％ACN；以及45-63分钟，55％ACN。
AQ713的HPLC层析谱表明了伊枯草菌素、伊枯草菌素样化合物(制磷脂菌素和agrastatin)及枯草菌表面活性剂的存在，见
图1。结合NMR数据和LC质谱学数据并与文献中的数值比较，鉴定伊枯草菌素A2、A3、A4、A7和A6。通过用HPLC和LC质谱学与购买的枯草菌表面活性剂标准品比较鉴定枯草菌表面活性剂。
经氨基酸分析和LC质谱学结合鉴定伊枯草菌素样化合物是制磷脂菌素和新agrastatin的混合物。也收集了命名为agrastatin A的新化合物之一(HPLC峰20)的广泛NMR数据。发现agrastatin A含下列氨基酸Thr；3个Glu；Ala；Val；2个Tyr和Orn。Val的存在和Ile的缺失使它的组成与制磷脂菌素不同。测定agrastatin A的分子量为1448，与如下结构一致(SEQ ID NO4) 通过1H NMR证实了脂肪酸部分的直链性质。通过TOCSY和ROESY数据详细分析确定环肽中氨基酸的位置。
Agrastatin B(HPLC峰26)的质谱学和氨基酸分析表明其结构与制磷脂菌素B2相似，但Val替换了Ala残基。结构如下所示(SEQ ID NO5) 实施例7 体外培养物(96孔板)中AQ713针对植物病原体的活性为测定AQ713是否对真菌致病疫霉、终极腐霉、灰葡萄孢、立枯丝核菌、马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)有效，进行下列实验。用琼脂培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，Difco))填充96孔板(平底，每孔400微升，Nunc brand)。在液体YPG-1培养基(0.4g酵母、0.1％KH2PO4、0.5％MgSO4×7H2O、1.5％葡萄糖)中培养致病疫霉培养物3天。对于其它真菌来说，从培养皿表面刮下孢子，将0.1-0.2ml去离于水和病原体孢子悬浮液(浓度约为2×106孢子/ml)的等分试样涂在琼脂上。
如实施例2所述，在培养基2或3中培养AQ713 72小时。以5,200rpm离心全肉汤培养物20分钟以获得上清液。将真菌植物病原体吸到96孔板中(8孔/病原体)。记录所有8个孔中真菌生长的有无。向每孔中加入约40μl AQ713上清液或20μl全肉汤培养物。分值“1”表示真菌生长的完全抑制。分值“4”表示没有真菌生长的抑制。结果示于表7。表7真菌生长的体外抑制(96孔板)AQ71.3上清液 培养基2 培养基3分值 分值致病疫霉 11终极腐霉 11灰葡萄孢 11立枯丝核菌 41马铃薯早疫病链格孢 11AQ713全肉汤培养物Colletotrichum cocodes 1NT甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola)1NT灰葡萄孢 1NT瓜枝孢(Cladosporium cucumerinum) 1NTMonilinia fructicola 1NT梨黑星菌(Venturia pyrina) 1NT立枯丝核菌 1NT马铃薯早疫病链格孢 1NTNT未测试结果表明AQ713具有广泛的体外杀真菌范围而且全肉汤培养物和上清液活性都很高。在培养基3中而不是在培养基2中的上清液对立枯丝核菌有活性。实施例8 体外培养物中AQ713针对植物病原体的活性(区域分析)为了测定AQ713在琼脂扩散(区域)分析中的活性，将植物病原体孢子涂布在10cm培养皿的土豆葡萄糖脂表面。从琼脂上去除7.0mm的孔并将100μl在培养基2中生长的AQ713上清液放在该孔中。通过以4200rpm离心40分钟制备上清液。然后将上清液以4200rpm再离心40分钟。典型的结果为在孔的周围无病原体生长的区域和/或病原体生长降低的区域。以毫米测量并记录区域大小。结果示于表8。
表8真菌植物病原体生长的体外抑制(区域实验)
实施例9 AQ713针对细菌植物病原体的活性如实施例6建立标准的琼脂扩散实验。将每种细菌病原体的菌苔涂布在培养皿的表面。在每个孔中放入100μl在培养基2中生长的AQ713全肉汤培养物。以毫米测量区域的大小。表9细菌植物病原体的体外抑制(区域实验)AQ713全肉汤培养物 抑制区域(mm)燕麦食酸菌西瓜亚种 18(Acidovorax avenae subsp.citrulli)丁香假单胞菌蕃茄致病变种 11(Pseudomonas syringae pv.Tomato)野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 18(Xanthomonas campestris pv.Campestris)胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种 11(Erwinia carotovora subsp.Carotovora)密执安棍状杆菌密执安亚种 22(Clavibacter michiganense subsp.Michiganense)AQ713对所有体外测试的细菌植物病原体都有活性。实施例10 植物测试中AQ713针对植物病原体的活性测试了AQ713在菜豆和天竺葵叶上针对灰霉病(灰葡萄孢)的活性，在蕃茄幼苗上针对马铃薯早疫病链格孢的活性以及针对莴苣霜霉病(Bremialactucae)的活性。
对于马铃薯早疫病链格孢，用AQ713全肉汤培养物(培养基2)喷洒种在6盆中的2-3叶阶段蕃茄幼苗至流出。喷洒后，令幼苗干燥(约1.5小时)。然后用5.0×104孢子/ml喷洒幼苗。用塑料圆顶覆盖幼苗并在Percival培养箱中于28℃放置。无AQ713、有和无病原体孢子的水作为阴性对照和阳性病原体对照。四天后读取测试结果。在马铃薯早疫病链格孢和水对照上，整个叶片上有均匀损伤，子叶脱离并受到严重侵染(5级＝完全侵染，无控制)。AQ713处理的植物在真叶上散布着几处轻微损伤。子叶连接但有一些小的损伤(1级)。阴性对照未受侵染。
用置于圆顶下的装有水并按上述方式放置的瓦罐中的脱离蕃茄幼苗(茎从地面处折断)进行第二次测试。如上所述喷洒植物，四天后记录马铃薯早疫病链格孢引起的症状。阴性对照上没有症状。在阳性对照上，幼苗上遍布均匀的损伤。对AQ713处理评为1级(很少或没有损伤)。两天后，阳性对照中的植物遭到破坏，而经AQ713处理的幼苗是基本上干净的，与阴性对照(水喷洒的植物)看上去相同。
对于针对灰葡萄孢的测试，通过用13×100培养管的口挤压每个叶片损伤菜豆的第一片真叶。每个叶片受到两次损伤/叶。用AQ713全肉汤培养物(培养基2)或仅用水或仅用病原体喷洒叶片。当干燥时，再用灰葡萄孢孢子(0.8×106孢子/ml)喷洒。将叶片放在覆盖有塑料圆顶的平板上，在Percival培养箱中于18-20℃放置。五天后，阳性对照(仅用病原体处理)在直径约25mm的区域内腐烂。阴性对照(仅用水处理)没有腐烂。AQ713在叶受损伤的8个圆圈中7个没有侵染。受到侵染的圆圈周围有两个位置受轻微侵染。
对于盘梗霉(Bremia)的测试，将莴苣种子种植在8厘米高和宽的干净小塑料植物共生器(Condominium)中的含有泥碳、珍珠岩和蛭石的灭菌盆栽混合层中。莴苣发芽后(一星期)，用AQ713肉汤培养物或上清液样品喷洒莴苣幼苗。令植物干燥，然后将从受侵染的莴苣幼苗中得到的霜霉孢于喷洒到幼苗上。将塑料覆盖物放在植物上并在Percival培养箱中于18-20℃培养。一星期后，评估测试。AQ713不能阻止由盘梗霉引起的莴苣幼苗霜霉病。实施例11 AQ713针对植物疾病的效力(温室测试)葡萄霜霉病AQ713在400L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用手提式喷雾器将用无菌水稀释成0.5X和0.25X浓度的400L发酵的全肉汤培养物喷酒葡萄(栽培品种Chardonnay)至流出。当叶干燥时，第二次喷洒植物。干燥后，用引起葡萄霜霉病的葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)病原体接种植物。每一剂量处理三株植物。基于0至100％控制的等级估计疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％控制是没有可见损伤的植物。使用化学杀真菌剂氨丙灵作为比较。结果如下AQ713 0.5X全肉汤培养物 97.7％控制AQ713 0.25X全肉汤培养物100％控制氨丙灵 30ppm 100％控制氨丙灵 10ppm 98.3％控制氨丙灵 1ppm 80％控制结果显示AQ713与化学杀真菌剂同样有效地控制葡萄霜霉病。实施例12 AQ713针对南瓜白粉病的效力AQ713在400L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用手提式喷雾器将用无菌水稀释成0.5X浓度的400L发酵全肉汤培养物喷洒南瓜(Crookneck和Acorn)至流出。干燥后，用南瓜白粉病病原体单丝壳(Sphaerothecafuligininea)接种植物。每一剂量处理两株植物。还测试全肉汤培养物喷雾干燥的粉末。将400L发酵肉汤培养物喷雾干燥以去除水分。如上所述，将10％和2.5％喷雾干燥粉末溶液喷洒到植物上至流出。以从0至5的评分对白粉病的发病进行评估。5级是100％疾病而0级为无疾病。结果示于下面表10中。
表10
AQ713全肉汤培养物和喷雾干燥粉末提供对南瓜白粉病几乎完全的控制。实施例13 温室中AQ713对晚疫病、灰霉病、葡萄白粉病、谷物白粉病、纹枯病(Sheath Blight)和稻瘟病的效力AQ713在250ml摇瓶中的以大豆为基础的培养基中生长72小时。疾病、致病病原体和寄主列在下面表11中。该全肉汤培养物在下文表11中所示的植物上进行检测。
表11
用手提式喷雾器将每种肉汤培养物以1X浓度喷洒至检测植物上，使其干燥，然后再喷洒一次。每种疾病和处理有三株植物被处理。干燥后，用病原体接种植物。基于0至100％控制的等级估价疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％控制是指没有可见损伤的植物。使用化学杀真菌剂作为比较。疾病指数是未处理对照上疾病的严重性。
表12
AQ713针对所有检测的病原体表现与化学杀真菌剂相当的活性。实施例14 AQ713针对芸苔属(Brassica)霜霉病的效力芽孢杆菌菌株AQ713在10L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用以压缩空气推动的工艺气刷将1X强度的全肉汤培养物喷洒在三周龄的花椰菜和全子叶期的孢子甘蓝植物上。每种处理喷洒15-25个幼苗/盆的三份。还以250ppm和125ppm的比率将来自Zeneca的azoxystrobin杀真菌剂QuadrisTM喷洒在植物上(每种处理三株)。在AQ713和Quadris喷洒物干燥后，将寄生霜霉(Peronospora parasitica)的孢子悬浮液以1-5×104孢子/ml喷洒在芸苔植物上。将植物于15-17℃放置24小时进行侵染，然后将幼苗于20-24℃培养6天。将盆放回到15-17℃过夜以使病原体的孢子形成，直到对测试进行分级。基于0至100％控制的等级估计疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％控制指没有孢子形成损伤的植物。重复花盆之间的平均结果示于下面的表14。
表14
NT＝未测试AQ713有效控制霜霉持续三周。实施例15 AQ713和商业化杀真菌剂的协同作用AQ713在10L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长72小时。用无菌水将细菌培养物稀释为0.5X和0.25X浓度。用以压缩空气推动的工艺气刷将1X、0.5X和0.25X浓度的培养物喷洒到三周龄的胡椒上。每种处理喷洒三株植物。还将来自Zeneca的azoxystrobin杀真菌剂QuadrisTM以500ppm、250ppm和125ppm的浓度喷洒在植物上(每种处理三株)。另外，将Quadris和AQ713他肉汤培养物以1∶1比率组合喷洒在胡椒植物上(每种处理三株)。含和不含Quadris的处理列于下文表15中。在AQ713和Quadris喷洒物干燥后，将灰葡萄孢以1×106孢子/ml的孢子悬浮液喷洒在胡椒上。将植物在20-22℃放置3天，然后对测试进行分级。灰霉病的发病率以0至5分级。5级表示100％疾病而0级表示没有疾病。结果示于下面表15。
表15
结果清楚地表明使用Quadris和AQ713的结合控制灰霉病显著优于单独使用Quadris或AQ713。实施例16 AQ713杀虫成分的确定按如下提取脂肽组分(伊枯草菌素、制磷脂菌素、agrastatins及枯草菌表面活性剂)用于在昆虫上实验对全肉汤培养物进行涡旋后用HCl将dH值调至1.5，再次涡旋，然后于10,500rpm离心15分钟。倒掉并弃去上清液。沉淀用80％的乙腈/水(ACN/H20)悬浮，然后超声处理30分钟。将此样品再次离心15分钟，沉淀再次用80％的ACN/H2O涡旋悬浮。再次离心15分钟后沉淀于快速真空装置内干燥过夜，然后将样品重新溶解于80％的ACN/H2O中。
单独检验枯草菌表面活性剂(一种脂肽)。枯草菌表面活性剂购于Sigma Chemicals(ST.Louis，MO)并且经HPLC检验证实与AQ713中的枯草菌表面活性剂相同。因此，Sigma公司枯草菌表面活性剂被用于抗昆虫实验。
表16抗昆虫害虫脂肽的活性
NT＝未检测菌株AQ713的脂肽提取物具有杀虫效果。单独使用枯草菌表面活性剂显示出抗蚜虫及黄瓜十一星叶甲的活性，但不抗贪夜蛾。因此，菌株AQ713的杀虫活性可用菌株AQ713中的脂肽部分解释。
尽管本发明在这里已经进行了详细描述并有具体的实施方案作为参考，但本领域技术人员将明了，可在不偏离本发明实质和范围的前提下对本发明进行变更与修改。
序列表<110> AgraQuest，Inc.
Heins，Sherry D.
Manker，Denise C.
Jimenez，DeSmond R.
McCoy，Randy J.
Marrone，Pamela G.
Orjala，Jimmy E.<120>控制植物害虫的组合物和方法<130>127384200966<140>待定<141><150>09/223,587<151>1998-12-30<150>09/074,870<151>1998-05-08<150>08/853,753<151>1997-05-09<150>60/108,266<151>1998-11-12<160>5<1/0>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>7<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>1Leu Leu Asp Leu Leu Asp Leu1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<220><221>变体<222>(1)<223>Glu具有一个脂肪酸侧链。<220><221>变体<222>(6)<223>Xaa是Ala或Val。<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Orn<400>2Glu Xaa Tyr Thr Glu Xaa Pro Gln Tyr Ile1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<220><221>变体<222>(1)<223>Gln或Glu<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Orn<220><221>变体<222>(5)<223>Gln或Glu<220><221>变体<222>(6)<223>Ala或Val<220><221>变体<222>(1)<223>连接脂肪酸<400>3Xaa Xaa Tyr Thr Xaa Xaa Pro Xaa Tyr Val1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213> 枯草芽孢杆菌<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Orn<220><221>变体<222>(1)<223>连接脂肪酸<400>4Glu Xaa Tyr Thr Glu Ala Pro Gln Tyr Val1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Orn<220><221>变体<222>(1)<223>连接脂肪酸<400>5Glu Xaa Tyr Thr Glu Val Pro Gln Tyr Val1 5 10
权利要求
1.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括向所述植物和果实施用有效量的枯草芽孢杆菌菌株AQ713，NRRL保藏号B-21661，或其具有所述菌株所有鉴别特征的突变体。
2.权利要求1的方法，其中昆虫侵袭为叶昆虫侵袭或地下昆虫侵袭。
3.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括向所述植物和果实施用权利要求1之枯草芽孢杆菌菌株产生的有效量的表现抗昆虫活性、溶剂可提取、分子量小于10,000道尔顿的代谢物。
4.权利要求3的方法，其中昆虫侵袭为叶昆虫侵袭。
5.权利要求3的方法，其中昆虫侵袭为地下昆虫侵袭。
6.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的从枯草芽孢杆菌菌株AQ713培养物得到的表现抗昆虫活性的上清液。
7.权利要求6的方法，其中昆虫侵袭为叶昆虫侵袭。
8.权利要求7的方法，其中昆虫侵袭为地下昆虫侵袭。
9.权利要求1至7之任一项的方法，进一步包括施用有效量的生物或化学杀虫剂。
10.权利要求1的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以全肉汤培养物的形式施用。
11.权利要求1的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以上清液的形式施用。
12.权利要求6的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以可湿性粉剂、颗粒、flowable或微胶囊的形式施用。
13.权利要求1至7之任一项的方法，其中植物的根或根周围的土壤得到处理。
14.权利要求13的方法，其中处理植物的根或根周围的土壤。
15.一种从菌株AQ713分离的具有杀昆虫活性的脂肽提取物。
16.一种从菌株AQ713分离的具有杀昆虫活性的枯草菌表面活性剂脂肽。
17.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的具以下结构式的化合物 其中R1是C8-C20的支链或直链脂肪族侧链；X为Ala或Val；R2为乙酸或酯衍生物；Glx为Gln或Glu。
18.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的具以下结构式的化合物(SEQID NO4) 或(SEQ ID NO5)
19.一种保护或治疗植物和果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素和枯草菌表面活性剂的组合物。
20.权利要求20的方法，进一步包括施用有效量的agrastatin.
21.一种从菌株AQ713分离的具有杀昆虫活性的脂肽提取物。
22.一种从菌株AQ713分离的具有杀昆虫活性的枯草菌表面活性剂脂肽。
23.一种治疗或保护植物或果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的含有权利要求22之提取物的组合物。
24.一种治疗或保护植物或果实免受昆虫侵袭的方法，包括施用有效量的含有权利要求23之枯草菌表面活性剂的组合物。
25.权利要求24或25的方法，其中将所述组合物施用于植物根周围的土壤，或处理所述根。
全文摘要
本发明涉及表现杀昆虫、抗真菌和抗细菌活性的产抗生素和产代谢物的新枯草芽孢杆菌菌株。此新菌株的上清液中含有有效的杀昆虫、抗真菌和抗细菌剂。本发明也包括上清液中产生的溶剂可提取的小分子量(<10,000道尔顿)的具黄瓜十一星叶甲活性的代谢物。本发明还包含保护或治疗植物免受真菌和细菌侵染及黄瓜十一星叶甲侵袭的方法,包括给植物施用有效量的产抗生素/代谢物的新枯草芽孢杆菌菌株、由该新枯草芽孢杆菌菌株产生的抗生素/代谢物或其组合物,并选择性地进一步包括另一种产抗生素的细菌菌株和/或化学杀虫剂。本发明还包括单独使用从此新枯草芽孢杆菌菌株培养物获得的全肉汤培养物或上清液、或与化学杀虫剂和/或其它生物防治剂联合使用以预防或治疗真菌和细菌侵染的方法。本发明还包括命名为agrastatin的新型抗真菌和抗细菌化合物以及含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合物。本发明还提供治疗或保护植物免受真菌和细菌侵染以及黄瓜十一星叶甲侵袭的方法,包括施用新型的agrastatin及包含A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合物。本发明还进一步提供了从AQ713菌株分离的具杀虫活性的脂肽提取物以及从AQ713菌株分离的具杀昆虫活性的枯草菌表面活性剂脂肽。
文档编号A01N63/00GK1335854SQ99815075
公开日2002年2月13日 申请日期1999年10月21日 优先权日1998年11月12日
发明者S·D·海因斯, D·C·曼克, D·R·吉姆尼兹, R·J·麦科伊, P·G·马伦, J·E·奥加拉 申请人:阿格拉奎斯特公司