ry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的大豆植株；同时以野生型大豆植株 作为对照。
[0109] 对于农杆菌介导的大豆转化,简要地，将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基（B5 盐3.lg/L，B5维他命，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5. 6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养 基上，按以下条件培养：温度25±1°C;光周期（光/暗）为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的 子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4毫米处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、 侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶 节组织，其中农杆菌能够将Cry2Ab核苷酸序列和/或Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列传递 至创伤过的子叶节组织（步骤1 :侵染步骤）在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬 浮液（〇D66CI= 0?5-0. 8,侵染培养基（MS盐2. 15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、 乙酰丁香酮（AS)40mg/L、2-吗啉乙磺酸（MES)4g/L、玉米素（ZT)2mg/L，pH5. 3)中以启动接 种。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2 :共培养步骤）。优选地，子叶节 组织在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4. 3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-吗 啉乙磺酸（MES)4g/L、玉米素2mg/L、琼脂8g/L，pH5.6)上培养。在此共培养阶段后，可以有 一个选择性的"恢复"步骤。在"恢复"步骤中，恢复培养基（B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗 啉乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、玉米素（ZT)2mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸 100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5. 6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢 霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤3 :恢复步骤）。优选地，子叶节再生的组织块在 有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接 着，子叶节再生的组织块在含选择剂（潮霉素）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤 组织（步骤4 :选择步骤）。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基（B5 盐3.lg/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸（MES)lg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤（6-BAP)lmg/L、 琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，潮霉素50mg/L，pH5. 6) 上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，转化的细胞再生成植物（步骤5:再生步骤）， 优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基（B5分化培养基 和B5生根培养基）上培养以再生植物。
[0110] 筛选得到的抗性组织块转移到所述B5分化培养基（B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗 啉乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、玉米素（ZT)lmg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸 50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素lmg/L、生长素lmg/L、潮霉素50mg/L，pH5.6)上，25°C下 培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基（B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗啉 乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、吲哚-3- 丁酸（IBA)lmg/L)， 在生根培养上，25°C下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26°C下培 养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0111] 第四实施例、用TaqMan验证转基因植株
[0112] 分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab_CrylA. 105核苷酸序列 的玉米植株的叶片约l〇〇mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组 DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry2Ab基因和CrylA. 105基因的拷贝数。同 时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0113] 检测Cry2Ab基因和CrylA. 105基因拷贝数的具体方法如下：
[0114] 步骤11、分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab_CrylA. 105核苷 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各l〇〇mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个 样品取3个重复；
[0115] 步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具 体方法参考其产品说明书；
[0116] 步骤13、用NanoDrop2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓 度；
[0117] 步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为 80-100ng/u1；
[0118] 步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知 拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平 均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
[0119] 以下引物和探针用来检测Cry2Ab核苷酸序列：
[0120]引物 1:CTGATACCCTTGCTCGCGTC如序列表中SEQ ID N0:8所示；
[0121]引物2 :CACTTGGCGGITGAACTCCTC如序列表中SEQ ID N0:9所示；
[0122]探针 1:CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG如序列表中SEQ ID NO:10 所示；
[0123] 以下引物和探针用来检测CrylA. 105核苷酸序列：
[0124]引物3 :GCGCATCCAGTTCAACGAC如序列表中SEQ ID N0:11 所示；
[0125]引物 4:GITCTGGACGGCGAAGAGTG如序列表中SEQ ID NO:12 所示；
[0126]探针2 :TGAACAGCGCCCTGACCACCG如序列表中SEQ ID NO:13 所示；
[0127] PCR反应体系为：
[0128]
【主权项】
1. 一种控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，包括将桃蛀螟害虫至少与Cry2Ab蛋白接 触。
2. 根据权利要求1所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存在 于至少产生所述Cry2Ab蛋白的宿主细胞中，所述桃蛀螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少 与所述Cry2Ab蛋白接触。
3. 根据权利要求2所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存在 于至少产生所述Cry2Ab蛋白的细菌或转基因植物中，所述桃蛀螟害虫通过摄食所述细菌 或所述转基因植物的组织至少与所述Cry2Ab蛋白接触，接触后所述桃蛀螟害虫生长受到 抑制和/或导致死亡，以实现对桃蛀螟危害植物的控制。
4. 根据权利要求3所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物可以 处于任意生育期。
5. 根据权利要求3所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物的组 织为根、叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
6. 根据权利要求3所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述对桃蛀螟危害植 物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
7. 根据权利要求3至6任一项所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述植物来 自玉米、向日葵、大豆、高粱、板栗、桃、石榴、苹果、番茄、茄子、甘蔗、草坪草、棉花、油菜或草 毒。
8. 根据权利要求2至7任一项所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述接触步 骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
9. 根据权利要求1至8任一项所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述 Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
10. 根据权利要求9所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白的核 苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
11. 根据权利要求2至10任一项所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述植物 还可以包括至少一种不同于编码所述Cry2Ab蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
12. 根据权利要求11所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素 、α -淀粉酶或过氧化物 酶。
13. 根据权利要求12所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 编码CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
14. 根据权利要求13所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry 1A. 105蛋白 的氨基酸序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
15. 根据权利要求14所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
16. 根据权利要求11所述的控制桃蛀螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
17. -种Cry2Ab蛋白质控制桃蛀螟害虫的用途。
18. -种产生控制桃蛀螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中 引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
19. 一种产生控制桃蛀螟害虫的植物种子的方法，其特征在于，包括将由权利要求18 所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序 列的种子。
20. -种培养控制桃蛀螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括： 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列； 使所述植物种子长成植株； 使所述植株在人工接种桃蛀螟害虫和/或桃蛀螟害虫自然发生危害的条件下生长，收 获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或 具有增加的植物产量的植株。
【专利摘要】本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，所述控制桃蛀螟害虫的方法包括：将桃蛀螟害虫至少与Cry2Ab蛋白接触。本发明通过植物体内产生能够杀死桃蛀螟的Cry2Ab蛋白来控制桃蛀螟害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治桃蛀螟害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
【IPC分类】A01N47-44, A01H1-02, A01H5-00, A01P7-04, C12N15-84, A01G13-00, A01H4-00, A01G1-00
【公开号】CN104621171
【申请号】CN201510048338
【发明人】李建勇, 李梅, 庞洁
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月30日