宿主植物的 垂直传播。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过种子进行。
[0025] 在一个实施方式中，该方法还包括从感染的宿主植物的群体中选择没有显示出内 生菌感染的外部症状的黑麦宿主植物的步骤。
[0026] 在第四方面，本发明涉及一种对宿主黑麦属植物赋予至少一定程度的害虫防护的 方法，包括使黑麦属植物人工地感染至少一种禾本科植物类内生真菌，其中，内生真菌-黑 麦植物组合产生了足以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护水平的至少一种生物碱。
[0027] 在第五方面，本发明涉及一种对宿主黑麦属植物赋予害虫防护的方法，包括使黑 麦属植物人工地感染至少一种禾本科植物类内生真菌，其中，内生真菌-黑麦植物组合产 生了赋予宿主植物所述害虫防护的至少一种生物碱。
[0028] 在第四或第五方面的一个实施方式中，所述至少一种生物碱是选自由以下构成的 组中的生物碱：波胺（peramine)、N-乙酰基降黑麦草碱（N-acetylnorloline)、黑麦草碱 (loline)、N-甲酰基黑麦草碱（N-formylloline)、N-乙酰基黑麦草碱（N-acetylloline) 和N-甲基黑麦草喊（N-methylloline)。
[0029] 在第四或第五方面的一个实施方式中，所述至少一种生物碱是黑麦草碱或波胺或 两者。
[0030] 在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以至少25ug/g的水平产生。
[0031] 在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以用于黑麦草碱的如表7中所示 的水平产生。
[0032] 在第四或第五方面的一个实施方式中，黑麦草碱以至少25ug/g至大约3660ug/g 的范围产生。
[0033] 在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以至少lug/g的水平产生。
[0034] 在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以用于波胺的如表7中所示的水平产 生。
[0035] 在第四或第五方面的一个实施方式中，波胺以至少lug/g至大约45ug/g的范围产 生。
[0036] 在一个实施方式中，该方法还包括选择内生真菌-黑麦植物组合的步骤，该内生 真菌-黑麦植物组合产生了水平足以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护的至少一种 生物碱。
[0037] 在第六方面，本发明涉及一种感染了禾本科植物类内生真菌的黑麦属种子。优选 地，黑麦属种子是选自由以下组成的组中的黑麦属的种子：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑 麦和瓦维洛夫黑麦。更优选地，种子是黑麦的种子。
[0038] 在如上所述的本发明的第三、第四、第五或第六方面中的任一个的一个实施方式 中，黑麦属选自由以下组成的组：黑麦、山黑麦、山地黑麦、森林黑麦和瓦维洛夫黑麦。优选 地，黑麦属是黑麦。
[0039] 在如上所述的本发明的第三、第四、第五或第六方面中的任一个的一个实施方式 中，至少一种内生真菌是从披碱草属中分离的内生菌。
[0040] 优选地，内生真菌从披木芙蓉中分离。优选地，内生真菌是禾本科植物类 内生菌。优选地，禾本科植物类内生菌选自由以下组成的组：AR3039(NRRL#50716)、 AR3046 (NRRL#50576)、AR3049 (NRRL#50577)、AR3050 (NRRL#50578)、AR3064 (NRRL#50718)、 AR3067 (NRRL#50719)、AR3068 (NRRL#50720)、AR3073 (NRRL#50721)、AR3074 (NRRL#50722)、 AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合。优选地，本发明涉及菌株 AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074 和 AR3078,优选地 AR3046、AR3050 或 AR3068〇
[0041] 本发明的其他方面可从以下仅通过举例并参照附图给出的描述中显而易见。
【附图说明】
[0042] 现在将仅通过举例并参照附图来描述本发明，在附图中：
[0043] 图1示出了根据如表2中列出的SSR等位基因大小的亲缘关系的树形图。
[0044] 图2示出了黑麦品种Rahu的四种植物；一种是未感染的（E-);并且三种感染了 AR3046。从左至右为：正常、矮化和发育迟缓的形态。E-和AR3046感染的正常和矮化植物 表现出花香出现，发育迟缓的植物没有。
[0045] 图3示出了在感染了 AR3046内生菌的黑麦品种Rahu植物（Rahu AR3046)上以及 在未感染植物（无Rahu (Rahu Nil))上观察到的分泌物的量或吹沫虫/植物的数量。还示 出了在感染了其天然存在的内生菌的牛尾草（草甸羊茅（Festuca pratensis syn)、黑麦草 (Lolium pratense syn)、长花序亚属羊茅（Schedonorus pratensis))植物上，羊茅属植物 (Neotyphodium uncinatum) (MF E+)和在未感染植物（MF E-)上观察到的分泌物的量或吹 沫虫/植物的数量。
[0046] 图4示出了在双培养中显著（P彡0.05)抑制了禾谷镰孢菌（禾谷镰刀菌， Fusarium graminearum)的菌丝体生长的某些内生菌菌株（来自AgResearch有限公司 Stuart Card的未发表研究的数据）。
[0047] 图5示出了在双培养中显著（P彡0. 05)抑制了立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)的菌丝体生长的某些内生菌菌株（来自AgResearch有限公司Stuart Card的未发 表研究的数据）。
【具体实施方式】
[0048] 定义
[0049] 给出以下定义，以更好地定义本发明并在本发明的实践中作为本领域普通技术人 员的指导。
[0050] 除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语应当理解为具有本公 开所属相关领域的普通技术人员所理解的相同含义。植物学、微生物学、分子生物学和 生物化学中的常见术语的定义的实例可以在以下中找到：Biology of Plants, Raven et al. (eds.),ff.H. Freeman and Company, (2005) ；Plant Physiology, Taiz et al. (eds.), Sinauer Associates, Incorporated, (2010) ；Botany:An Introduction to Plant Biology,J.D.Mauseth, Jones&Bartlett Learning, (2003) ；Methods for General and Molecular Microbiology, 3rd Edition, C. A. Reddy, et al. (eds.),ASM Press, (2008);微生物学百科全书（Encyclopedia of Microbiology),2nd ed., Joshua Lederburg, (ed. ), Academic Press, (2000) ；Microbiology By Cliffs Notes,I. Edward Alcamo, Wiley, (1996);微生物学与分子生物学词典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology), Singleton et al. (2d ed.) (1994);微生物生物学（Biology of Microorganisms) 11th ed. , Brock et al. , Pearson Prentice Hall, (2006);真菌的生 物多样性(Biodiversity of Fungi):Inventory and Monitoring Methods, Mueller et al.,Academic Press, (2004) ；Genes IX,Benjamin Lewin, Jones&Bartlett Publishing, (2007);分子生物学百科全书（The Encyclopedia of Molecular Biology)，Kendrew et al. (eds.)，Blackwell Science Ltd.，（1994);分子生物学与生物技 术（Molecular Biology and Biotechnology):a Comprehensive Desk Reference，Robert A. Meyers(ed.)，VCH Publishers，Inc.，（1995);草与种传内生真菌的共生（Symbioses of grasses with seedborne fungal endophytes). Schardl CL et al. (2004)Annual Review of Plant Biology 55:315-340 ;以及禾本科植物类的化学型多样性、草的真菌共 生体(Chemotype diversity of epichloae，fungal symbionts of grasses)，Schardl CL,Young CA,Faulkner JR,Florea S,Pan J (2012)Fungal Ecology 331-344(Schardl et al.，2012)。
[0051] 还应该相信，可以利用标准的植物学、微生物学、分子生物学和生物化学协 议和本领域已知的并且例如如在以下中所描述的程序：Methods of Studying Root Systems,vol.33,Wolfgang B6hm, Springer-Verlag, (1979) ；Root methods:A Handbook, Albert L.Smit Springer, (2000) ；Biodiversity of Fungi:Inventory and Monitoring Methods, Mueller et al. , Academic Press, (2004) Environmental Microbiology:Methods and Protocols, J. F. T. Spencer et al. , Humana Press, (2004)； Environmental Microbiology, P. D. Sharma, Alpha Science International, (2005)； Environmental Microbiology,J.R.Leadbetter,Gulf Professional Publishing，（2005)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Maniatis et al. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1982) ；Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2ed.), Sambrook et al. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)；分 子克隆技术的指导（Guide to Molecular Cloning Techniques)Vol. 152, S.L. Berger and A. R. Ki_erl (Eds. )，Academic Press Inc.，（1987);禾草内生真菌的生物技术 (Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses). 1994Bacon和White(Eds.)以及本公 开所属领域中相关的其他常用的参考资料来执行本发明的实践，并且通过引用将它们的全 部内容均结合于本文。
[0052] 如本文所使用的术语"植物"包括整个植物和来自植物生命周期的所有阶段的植 物的所有部分，这些阶段包括但不限于营养和生殖细胞和组织、繁殖体、种子、胚胎、芽、茎、 叶、叶鞘和叶片、花序、根、花药、叶舌、栅栏、叶肉、表皮、耳廓、内稃（palea)、外稃（lemma) 和分蘖。
[0053] 如本文所使用的术语"禾本科植物类（epichloae) "是指含有两个属（genera)的 内生真菌的内生真菌的集体组：变形形态属Neotyphodium(羊茅属，禾本草属）的成员和有 性属(香柱菌属）的成员。
[0054] 如本文所使用的术语"禾本科植物类内生菌"是指本领域已知的或本文已经示出 的与宿主植物形成共生体的"禾本科植物类"组的内生菌。
[0055] 如本文所使用的术语"赋予至少一定程度的害虫防护"涵盖可显著降低害虫对 黑麦属植物的发病率、严重程度和/或持续时间。优选地，可显著降低（可测量的降低， measureable reduction)是在统计学上具有0. 05或更小的P值的显著减少。
[0056] 如本文参照生物碱的水平所使用的术语"足以赋予害虫防护的水平"是指根据本 发明由植物-内生菌共生体产生的对感染了内生真菌的黑麦属宿主植物的虫害感染或不 利影响足以产生发生率、严重程度或持续时间的可显著降低的生物碱的任何水平。优选地， 生物碱是波胺或黑麦草碱或黑麦草碱衍生物。优选地，可显著降低是在统计学上具有0. 05 或更小的P值的显著减少。
[0057]如本文所使用的术语"统计学上显著"指的是由除随机机会外的其他原因造成的 结果或关系的可能性。结果可以利用统计假设检验而被认为是在统计学上显著，如本领域 已知和使用的。统计假设检验提供如本领域已知的"P值"，其表示仅由于随机而造成的所 测得结果的概率。被认为是本领域普遍接受的是，5% (0.05)或更低的显著水平被认为是 统计学上显著的。
[0058] 如本文所使用的术语"增强的害虫防护"是指赋予共生体中的黑麦属植物的害虫 防护的水平，其中与对缺乏内生真菌（对照植物）的黑麦属植物和/或具有不同内生真菌 的黑麦属植物的同样虫害、感染或有害影响的发病率、严重程度和/或持续时间相比，由于 给定害虫的存在和/或活性，禾本科植物类内生真菌降低了对植物的虫害、感染或有害影 响的发病率、严重程度和/或持续时间。
[0059] 如本文所使用的术语"人工感染"和"人工接种"包括用内生真菌对植物的任何接 种，特别是黑麦属植物，特别是黑麦，以形成本质上未知的植物/真菌共生体。
[0060] 如本文所使用的术语"植物中（在植物体内，原位，in planta)"在内生真菌的背 景下是指当其在宿主植物内共生地生活时的内生菌。
[0061] 如本文所使用的术语"稳定的植物/真菌共生（fungal symbiosis) "是指在植物 的整个生命周期内持续存在的共生体，其中植物没有显示出内生菌感染的外部症状。在"稳 定的共生组合"中，宿主植物在第一代感染了内生菌并且产生种子，所述种子在发芽时成长 为也感染了内生菌的第二代宿主植物。
[0062]如本文所使用的术语"正常的生命周期"是指黑麦的正常生殖周期，其包括第一代 植物的生长，以产生发芽时成长为第二代植物的种子。
[0063]如本文参考包括内生真菌的宿主植物所使用的术语"没有显示出内生菌感染的外 部症状"是指宿主植物具有如本领域已知的用于该宿主植物的基本上正常的形态学表型。 其中，如本文所使用的宿主植物的"基本上正常的形态学表型"是指如本领域中已知和普遍 接受的用于该宿主植物在给定的一组生长条件下的该宿主植物的典型形态。
[0064]如本文所使用的宿主植物的术语"正常表型"是指如在宿主植物的生命周期过程 中所显示的宿主植物的典型形态、生长和其它表型特征，包括如本领域已知和普遍接受的 用于不包含内生菌时的该宿主植物的宿主植物生殖周期和宿主植物种子。
[0065]如本文所使用的针对宿主植物的术语"异常表型"是指在宿主植物生命周期的任 何阶段的宿主植物的形态、生长或其它表型特征，包括作为典型或在对于宿主植物的通常 观察范围内的不同于本领域已知和普遍接受的宿主植物生殖周期和宿主植物种子。如本文 所使用的针对宿主植物的术语"异常表型"可以包括发育不完全的植物或矮小植物或具有 明显可见的内生菌感染的外部证据的植物或未能通过种子完成正常生殖的植物，但不限于 此。
[0066] 如在本说明书中使用的术语"包括"是指"至少部分地由…组成"。当解释本说明 书中的包括该术语的语句时，每个语句中的由该术语开头的特征都需要存在，但也可以存 在其他特征。以相同的方式来解释相关的术语，诸如"包括"和"包含"。
[0067] 旨在提及本文所公开的数字的范围（例如，1至10)还结合引用在该范围内的所有 有理数（例如，1，1. 1，2, 3, 3. 9,4, 5,6,6. 5, 7,8,9和10)以及在该范围内的任何范围的有理 数（例如，2至8,1. 5至5. 5和3. 1至4. 7)，因此，明确地在此公开的所有范围的所有子范 围被在此明确地公开。这些仅仅是具体意图的示例，并且所列举的最低值和最高值之间的 数值的所有可能的组合都被认为在本申请中以类似的方式被明确陈述。
[0068]详细描述
[0069] 许多冷季型草（禾本科，早熟禾亚科）具有因它们的生物保护性而已知的种 传禾本科植物类内生真菌，并且尤其是因抗虫害生物碱的生产而已知的，诸如黑麦草碱 (lolines) (Zhang 等人，2010)和波胺（peramine) (Koulman 等人，2007)。无性禾本科植物 类（Neotyphodium物种）主要或完全垂直传播，而相关的物种的性结构（基质） 可以产生可水平传播的孢子（子囊）（Zhang等人，2010)。
[0070] 大多数Neotyphodium物种被认为与属的物种密切相关。许多 Neotyphodium物种可能通过包括种间杂交的过程已经从射进化（Tsai等人， 1994)。基于分子系统发育学证据，一些作者认为无性羊茅属（Neotyphodium)或者从个体 母紐^物种衍生，或者从共享至少两个祖先均属物种的杂种衍生（Tsai等人， 1994 ;Moon等人，2004)。目前的分类学认为，变形形态属Neotyphodium的成员与有性属 内的成员非常密切相关（Glenn等人，1996)。遵循先前的植物命名代码，形态属 是指无性孢子或植物状态，并且有性属是指性状态。目前，植物命名代码用单个命名协议处 理单个真菌（Miller等人，2011)。总的来说，这两个属，Neotyphodium和￡)?/(； _力/〇<?.在本领 域中被称为"禾本科植物类"内生菌。
[0071] 禾本科植物类真菌和宿主禾草之间的共生体是很常见的，并且分子系统发育学证 据表明，在这些共生体中所观察到的物种特异性是由于这些组（group)的植物和内生真菌 的共同进化的结果（Schardl等人，2008)。
[0072] 现代驯化谷物不会被禾本科植物类内生菌自然感染，但一些野生型亲属可能会被 感染（Marshall等人，1999)。不希望受到理论的束缚，本发明人认为，在现代谷物的进化过 程中，农业实践（诸如存储种子）可能已导致历史联系的损失，如果它们存在的话（Welty 等人，1987)。
[0073] 禾本科植物类内生真菌和宿主植物（其不是真菌的天然宿主）之间的稳定植物/ 真菌共生体的建立既是有问题的又是不可预测的（Simpson和Mace，2012)。
[0074] 这被认为是由于形成这种共生体时的要求，以便在可以包括生态、生物化学和/ 或分子不兼容性的伙伴（partner)之间成功整合多个生物学变量（Christensen等人， 2000)。本公开内容详细介绍了大量的所需要的研究，包括重大试验和试错实验，以开发成 功的协议和程序，通过所述协议和程序，建立禾本科植物类内生真菌的某些菌株与黑麦属 宿主植物（其不是这些真菌的天然宿主）之间的稳定共生体。
[0075] 令人惊讶的是，发明人已经确定人工接种可以用于建立一些禾本科植物类内生真 菌和黑麦属宿主植物之间的稳定的植物/真菌共生体。通过使用本文所描述的本发明的方 法，发明人能够生产与感染真菌形成稳定共生体的受感染的黑麦属宿主植物，所述感染真 菌允许受感染的植物通过正常的生命周期进展，和/或其中受感染的植物没有显示出内生 菌感染的外部症状。此外，发明人已经发现，这种共生体的建立可以在至少一种黑麦草碱生 物碱、黑麦草碱生物碱衍生物、或波胺、或它们的组合的植物的生产方面对宿主植物提供至 少一定程度的好处，其可以赋予宿主植物至少一定程度的害虫防护。
[0076] 发明人已令人惊讶地确定取自谷物的野生亲属的某些内生真菌菌株适于与黑麦 属宿主植物（特别是黑麦）建立稳定的植物/真菌共生体。特别是，发明人已经建立了导 致内生真菌/黑麦属宿主植物组合的共生体（symbiotic association)，其与黑麦属对照 植物（即，未感染同样的共生禾本科植物类真菌菌株的同样的黑麦属植物）相比，可以具有 至少一定程度的增强的害虫防护。不希望受理论的束缚，发明人相信，在产生某些生物碱， 尤其是黑麦草碱、黑麦草碱衍生物和/或波胺的内生真菌/宿主植物组合中，增强的害虫防 护是可以预料的。因此，发明人相信，由禾本科植物类内生真菌或内生真菌/宿主植物组合 生产黑麦草碱和/或波胺生物碱（多种）对宿主植物提供至少一定程度的增强的害虫防 护。特别是，遵循在此公开的本发明的内生菌菌株的使用和方法，发明人已经确定，与黑麦 对照植物相比，被禾本科植物类内生真菌的某些菌株感染的黑麦属宿主植物，特别是黑麦 宿主植物，具有增强的抵御线虫防护。
[0077] -般来说，宿主植物与它们的禾本科植物类内生真菌之间形成的共生体基于导致 对于内生菌和宿主两者而言具有高度物种特异性的复杂且亲密的生物相互作用（Simpson 和 Mace，2012)。
[0078] 作为长期研究方案的结果，申请人已首次确定了能够与黑麦属宿主植物形成稳定 的植物/真菌共生体的禾本科植物类真菌。申请人已进一步确定了在与黑麦属宿主植物 (特别是黑麦宿主植物）共生时能够赋予被感染宿主植物的内生菌，与未感染的对照植物 相比，具有产生一种或多种已知生物碱的能力，以对植物提供至少一定程度的增强的害虫 防护。具体地，一种或多种生物碱可以是黑麦草碱、黑麦草碱衍生物或波胺生物碱。
[0079] 因此，在一个方面，本发明涉及一种选自由以下组成的组中的禾本科植物类内 生真菌的分离菌株：AR3039 (NRRL#50716)、AR3046 (