子进行表面消毒：浸没在50%硫酸溶液中15分钟，接着是用自来水 冲洗五次，然后浸没在10%家用漂白（Janola)溶液中15分钟，接着是用无菌水冲洗2次。 在置于4%的水琼脂培养皿中之前，在层流柜中在无菌Whatmann滤纸上干燥种子。培养皿 上的种子在黑暗中在22-25°C下发芽4-9天，并且对所得到的黄化幼苗接种，之后返回到黑 暗培养箱中7天。在此之后，将该培养板放置在白色荧光灯下至少7天，之后除去幼苗并将 它们种植在商业盆栽组合中且在温室中成长。在识别被感染的个体前，植物生长约6周。通 过Simpson等人的方法（2012)对被感染的植物进行鉴定。植物在温室中进一步生长，以与 典型的未受感染植物比较而检查被感染植物的植物表型，特别是确定是否将形成花序和种 子头。
[0151] 对于那些内生菌菌株标有"是"的成功接种的总结列于表4中，其中至少一些所接 种的植物是基本上正常的表型，并且能够通过正常的生活周期进展（图2)。从如表4中所 示的植物中采集种子。
[0152] 表4接种到黑麦中并感染黑麦的菌株以及种子生产的实例
[0153]
[0155] *接种到黑麦品种Rahu中
[0156] **接种到黑麦品种Amilo中
[0157] ***除Dr Mark Newell，罗伯茨塞缪尔贵族基金会外的黑麦（黑麦）的接种选择。 变种如所示：NF95307A、NF95319B、97326、Bates RS4 或 MAT0N2。
[0158] TBD =待确定
[0159] 是i =预期的结果
[0160] 实施例7
[0161] 被内生菌感染的天然亲本植物中的生物碱生产
[0162]通过已建立的方法（Kennedy 和 Bush，1983 ;Yates 等人，1989)和波胺（Rasmussen 等人，2012)的稍加修改，对于黑麦草碱生物碱和波胺，对感染了特定内生菌菌株的披木芙 蓉、犬草、甘草披碱草（Elymus uralensis)、粉绿披碱草（Elymus nevskii)和披木芙蓉变 种oschensis植物的叶片和假莖进行分析。结果示于表5中。在所检查的植物叶子中的黑 麦草碱生物碱的总量大于假茎中的总量。不希望受理论的束缚，本发明人认为，存在于被检 查的植物中的生物碱的总量代表一范围，其足以对宿主植物提供至少一定程度的害虫防护 (Wilkinson等人，2000)。这些结果表明，本文其他地方所提出的由SSR和0微管蛋白数据 所定义的分枝内的大量内生菌菌株，当在植物中时，可赋予共生组合产生显著量（可测量 的，measurable amount)的黑麦草碱生物碱或波胺或两者的能力。
[0163] 表5用于被内生菌感染的亲本披碱草（Elymus)植物的总的黑麦草碱和波胺生物 碱
[0164]
[0165]
[0166] 脚注：1由GC-FID进行分析，2由LC-MS进行分析
[0167] 实施例8
[0168] 从披碱草属选择的内生菌的来源和地理起源
[0169] 表6列出了本文所公开的一些分离的内生菌菌株、得到它们的来源登记号、原宿 主植物登记的推定物种和登记的地区来源。披碱草属宿主植物通常从中亚获得。
[0170] 表6通过AR代码号、原始推定的宿主物种、地区来源和来源登记号分离的内生菌 的菌株
[0171]
[0172]脚注：
[0173] 1.英国阿丁莱皇家植物园种子保存部
[0174] 2.铂尔曼学院，华盛顿州立大学，普尔曼，WA.，USA
[0175] 3?北欧遗传资源中心（NordGen)，奥纳普，瑞典
[0176] 实施例9
[0177] 黑麦植物中的生物碱生产
[0178] 用如表7中所列出的内生菌接种黑麦品种Rahu的幼苗，在温室中生长，并被确认 为含有具有基本正常的植物表型的内生菌。分别进行叶片和茎的黑麦草碱生物碱（Kennedy 和Bush，1983 ;Yates等人，1989)或波胺（Garthwaite等人，1994)的分析。表7中的结果 示出了对于黑麦草碱生物碱和波胺的浓度范围。不希望受理论的束缚，本发明人认为，存在 于被检查植物中的黑麦草碱生物碱和波胺的总量代表一范围，其足以对宿主植物提供至 少一定程度的害虫防护（Rowan，1993 ;Wilkinson 等人，2000 ;Bacetty 等人，2009a 2009b)。
[0179] 表7感染了内生菌的黑麦植物（多达3种植物）的生物碱分析观察
[0180]
[0181]
[0182] 脚注：1由GC-FID进行分析，2由ELISA进行分析
[0183] 实施例10
[0184] 具有抗病虫害生物活性的批木芙蓉/内生菌组合
[0185] 在没有无内生菌的批木芙蓉对照的情况下，使用具有和没有其天然内生菌（羊茅 属植物（Neotyphodium uncinatum)的牛尾草，因为它对于产生黑麦草碱生物碱是已知的并 且具有防治蚜虫的已知活性。
[0186] 对蚜虫的效果
[0187] 姐虫禾谷溢管姐（Rhopalosiphum padi)是谷类植物的重大害虫，因为它传输大麦 黄矮株病毒。
[0188] 在使用分蘖在培养皿中进行的选择生物测定中，感染了 AR3050的批木芙蓉上的 禾谷溢管姐的数量类似于感染了其天然内生菌Neotyphodium uncinatum的牛尾草上的数 量，并且显著少于无内生菌对照的牛尾草上的蚜虫的数量（表8)。
[0189] 表8选择试验3天，在感染了 AR3050的批木芙蓉的分蘖上发现的禾谷缢管蚜的数 量以及具有（MF E+)和不具有（MF E-)其天然内生菌N. uncinatum的牛尾草的分蘖上发现 的数量
[0190]
[0191]
[0192] 这项试验的结果表明，作为在批木芙蓉和AR3050之间形成的共生组合（共生体） 的结果而产生的黑麦草碱生物碱可能会阻止如在牛尾草上看到的蚜虫（Wilkinson等人， 2000)〇
[0193] 对螨虫的效果
[0194] 螨属，特别是小麦卷叶螨（A. tosichella)，是在澳大利亚传输小麦条花叶病的螨 虫。在这些试验中所用的螨虫已被确定为螨属，暂定为小麦卷叶螨。
[0195] 由于缺乏无内生菌的批木芙蓉对照和植物基因型对荔枝癭螨（Aceria)的发生 的未知效果，在六种被内生菌感染和六种无内生菌的牛尾草植物上，对黑麦草碱生物碱对 螨虫的影响进行评估。在每种植物的三个分蘖上计数荔枝癭螨。无内生菌的植物上比被 内生菌感染的植物上出现显著更多的螨（编号/分蘖：对于E+cf为74,对于E-为454。 P〈0. 001)。下面在表9中给出了结果。
[0196] 表9在具有（E+)和没有（E-)内生菌N. uncinatum的六颗牛尾草植物上的三个分 蘖中的两片叶子上的荔枝癭螨的平均数
[0197]
[0198] 如以上在所应用的试验中所示出的，该螨虫试验中的结果表明黑麦草碱生物碱负 责阻止螨的食草动物，类似于已在牛尾草中显示的对蚜虫的效果（Wilkinson等人，2000)。
[0199] 对浅褐色苹果蛾的效果
[0200] 已知这种昆虫对黑麦草中的内生菌产生的生物活性的敏感性。本文这里用来表示 生物活性在感染了 AR3046的批木芙蓉植物中的存在。
[0201] 当从感染了 AR3046的植物中提取的批木芙蓉植物材料被并入人工饲料中并喂养 给浅褐色苹果蛾时，发现了 AR3046的严重影响。在将新生幼虫置于测试饮食上的第一个 24小时内建立和开始喂养的幼虫的平均百分比为：与吃了含有感染了 AR3046的批木芙蓉 的幼虫中的4%相比，其它三个披碱草属物种的平均88%未感染内生菌。试验第10天，与 被喂养AR3046且蜕皮到龄的只有13%的那些相比，喂养没有内生菌的植物材料的幼虫中 的60%已经蜕皮至第1龄。下面在表10中给出了该试验的结果。
[0202] 表10当置于结合了来自没有内生菌或感染了产生黑麦草碱的内生菌AR3046的披 碱草属的冻干植物材料的饮食上时，对已设定饮食24小时之后以及开始饲养24小时和48 小时之后的浅褐色苹果蛾的比例，以及至第一次蜕皮的平均时间。
[0203]
[0204] 这种蛾试验的结果有力地表明，AR3046产生负责阻止浅褐色苹果蛾食草动物的黑 麦草碱生物碱。
[0205] 实施例11
[0206] 在被内生菌感染的黑麦中的害虫防护
[0207] 利用黑麦品种Rahu的分蘖，带有或没有AR3046内生菌，进行实验，以测试内生菌 保护黑麦不受根腐线虫（短体线虫属）影响的能力。E+和E-Rahu的11个个体分蘖，其从每 次处理的4棵独立的亲本植物（每个亲本植物2-3次克隆）中选择，被移植到5 X 5 X 12cm 的含有l〇〇g场地采集土壤中且具有每l〇〇g含30个短体线虫属的自然侵扰的深根培养器 中。另外30个实验室饲养的穿刺短体线虫被加入到各个根培养器中，使得每棵植物暴露于 60个线虫。植物在照明的生长室中在20°C下培养30天。然后从土壤中取出植物，将根部 洗净，然后用1.5 %的氯化钠清洗3分钟。使用在甘油中的苯胺蓝对根部内的线虫进行染 色。然后在显微镜下检查根部，
[0208] 并计数根部系统内的线虫的数量。内生菌感染并没有影响根部重量。
[0209] AR3046内生菌的存在导致每个根部系统的线虫数量的显著（p〈0. 05)减少（表 11) 〇
[0210] 如在上所描述的昆虫威慑试验中所示出的，该线虫试验的结果有力地表明，通过 AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责通过阻止内生菌感染的黑麦植物的根部的线虫定植而 赋予被感染的黑麦至少一定程度的害虫防护。这与正在示出的黑麦草碱一致，对线虫具有 威慑和杀虫效果（Bacetty等人，2009a 2009b)。
[0211] 表11在具有内生菌（AR3046)和没有内生菌（E-) (P = 0. 013)的黑麦品种Rahu 植物的根部中的根腐线虫（短体线虫属）的数量
[0212]
[0213] 实施例12
[0214] 感染有内生菌AR3046的黑麦变种"Rahu"对角潜蝇芦苇（Cerodontha australis) 的影响
[0215] 新西兰和澳大利亚的牧草和谷物经常被叶采蝇，角潜蝇芦苇（Cerodontha australis)(双翅目：潜蝇科），也被称为小麦鞘矿工，的幼虫骚扰。这个蝇科的幼虫在一系 列牧草和谷物的组织上内部饲养，从而造成可能导致分蘖死亡的破坏。螨在叶子上留下明 显的痕迹。
[0216] 在该实验中，感染了产生黑麦草碱的内生菌（AR3046)或未感染（无）的黑麦品种 Rahu植物由C. australis暴露于虫害。感染了其天然内生菌Neotyphodium uncinatum的 牛尾草被包含在实验中，因为这种内生菌也产生黑麦草碱生物碱。
[0217] 方法
[0218] 六棵植物，分别为感染了 AR3046的"Rahu"黑麦和感染了 N. uncinatum的牛尾草， 其与内生菌无关（无），对这六棵植物通过C. australis比较它们对虫害的影响。植物被随 机地布置在重复组（复制组）内，所述组包括每次处理的单个植物，并且从在温室中生长的 多年生黑麦草植物切开的四个叶矿蝇蛹被放置在每个植物的基部（在分蘖当中）。此外， 已经从所收集的蛹出现的一雌一雄成年蝇被释放到重复组1-5,并且一雄成年蝇被释放到 重复组6。用放置在铁丝笼上的细网布覆盖四种植物的每个重复组。在笼子被设置2周后 将笼子从植物上除去。在温室中在22°C的最高日温下进行实验，并且根据需要手工浇灌植 物。
[0219] 在将蛹和成虫置于植物上且每个茎中的幼虫损坏或蛹存在6周时，记录每个叶子 中的分蘖数以及幼虫的数量和长度4和6周。
[0220] 在通过重复（复制）阻止的AN0VA在GenStat vl6中进行分析之前，对统计数据 进行对数变换（In)和比例数据平方根变换。
[0221] 结果
[0222] 与所有六个无Rahu植物相比，感染了 AR3046的六棵Rahu植物中的仅一棵感染了 苍蝇。在4周和6周检查时，感染了 AR3046的Rahu比无Rahu具有显著较少的分蘖/植物 (P〈0. 001)和被C. australis感染的较低比例的分蘖（P〈0. 002)(表12)。此外，AR3046减 少了潜道（mines)/植物的数量（P〈0. 001)(潜道（mines)是由幼虫在植物组织内喂养时留 下的垂直路径）和被幼虫或蛹损坏或含有幼虫或蛹的分蘖茎的数量（即，各分蘖的下部）。
[0223] -般来说，所有植物被攻击时，牛尾草植物更容易被苍蝇感染。由N. uncinatum对 牛尾草的感染减少了在4周（P〈0. 007)和6周（P〈0. 002)时感染C. australis的分蘖比例 (表12)。此外，被内生菌感染的牛尾草与无内生菌的牛尾草相比，被损坏或含有幼虫的分 蘖茎显著减少（P〈〇. 05)。
[0224] 表12在蛹和成虫被释放到黑麦变种"Rahu"的植物以及具有（MF N. unc.)内生菌 和无（MF Nil)内生菌的牛尾草上之后，在4周和6周时，活分蘖的平均数，损坏分蘖的数 量，损坏分蘖的比例以及由角潜绳芦_ (Cerodontha australis)引起的潜道（mines)/植 物的数量列表如下。给出了分蘖茎中的带有损坏和/或蛹的分蘖的平均数，用于6周的检 查。对于平均数的数据进行对数（In)变换并且对比例数据进行平方根变换。
[0225]
[0227]:SED =对于所有四次处理的比较的标准误差
[0228] 2P值用于物种内的感染内生菌和无内生菌的植物之间的比较
[0229] 结论
[0230] 感染了产生黑麦草碱的内生菌（AR3046)的黑麦品种Rahu的感染显著减少了叶采 绳角潜绳芦_ (Cerodontha australis)的感染。牛尾草中的内生菌的另一个产生黑麦草 碱的物种也减少了由蝇蛆损坏的分蘖的比例和具有茎损坏的分蘖的数量。
[0231] 该试验的结果有力地表明，通过减少C. australis对感染内生菌的黑麦属植物的 侵扰，由AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责赋予被感染的黑麦属至少一定程度的害虫防 护。这与正在示出的黑麦草碱一致，对其他昆虫和植物害虫具有威慑和杀虫效果（Schardl 等人，2007 ;Bacetty 等人，2009a 2009b)。
[0232] 实施例13
[0233] 感染了内生菌AR3046的"Rahu"黑麦对吹沫虫的影响
[0234] 进行实验，比较感染了 AR3046的黑麦变种Rahu和感染了其天然的产生黑麦草碱 的内生菌N. uncinatum的牛尾草、连同各自的未感染对照物对被认为对黑麦草碱生物碱敏 感的木质取食害虫沫蝴（Philaenus spumarius)(吹沫虫）的影响。对植物进行克隆，使得 每个实验用不同的昆虫，使用感染了 Rahu以及感染和未感染牛尾草的六种遗传学上相同 的植物，但是六种无内生菌的Rahu植物中只有三个是相同的。
[0235] 进行两个实验，第一个使用很快发展到成年的成熟吹沫虫幼虫，而第二个使用更 年轻的幼虫。在这两种情况下，3个吹沫虫被释放到每棵植物上。在第一个实验中，植物被 覆盖有没有完全防虫的乙酸笼子，而在第二个实验中，使用防虫尼龙罩。目前吹沫虫的数 量以及在吹沫虫饲养时排出的小、中和大唾沫排泄物的数量，在每个实验过程中被定期计 数。与无内生菌的相比，感染AR3046的Rahu黑麦减少了吹沫虫的数量和吹沫虫产生的唾 沫量（图3)。
[0236] 在第一个实验中，在整个实验过程中，与无内生菌的相比，显著更少的吹沫虫存在 于AR3046植物上，而在第二个实验中，只在实验开始时数量的减少是显著的。相对于这些 结果，内生菌感染的牛尾草对吹沫虫的数量或饲养没有影响。
[0237] 该试验的结果有力地表明，通过减少吹沫虫对感染内生菌的黑麦属植物的侵扰， 由AR3046产生的黑麦草碱生物碱负责赋予被感染的黑麦至少一定程度的害虫防护。这 与正在示出的黑麦草碱一致，对其他昆虫和植物害虫具有威慑和杀虫效果（Schardl等人， 2007 ;Bacetty 等人，2009a 2009b) 〇
[0238] 实施例13
[0239] 植物病害试验
[0240] 以下体外结果表明所选的内生菌对谷物真菌病原体的影响，包括抑制一系列病原 和腐生真菌的发展。例如，一些内生菌菌株显著（P< 0.05)抑制禾谷镰刀菌和稻纹枯病菌 的菌丝体生长（图4和图5)。这两种病原体分别是赤霉病和裸补丁的致病因子，这两种都 是谷类作物的毁灭性疾病。这些内生菌具有提供保护防止许多谷物疾病的潜力。不希望受 理论的束缚，发明人相信，虽然迄今没有确定动作的机制来解释这种抑制作用，但通过产生 未知的次级代谢产物的抗菌是一种可能的机制。
[0241] 试验结果表明，一些内生菌菌株显著（(P彡0. 05)抑制了禾谷镰刀菌（图4)和稻 纹枯病菌（图5)的菌丝体生长。
[0242] 虽然已经通过实例并参考【具体实施方式】描述了本发明，但应当理解的是，在不脱 离本发明范围的前提下，可以进行修改和/或改进。
[0243] 此外，尽管按照马库什组的方式描述了本发明的特征或各方面，但本领域技术人 员将认识到，也由此按照马库什组的任何个别成员或成员的子组来描述本发明。
[0244] 本领域技术人员将理解，如本文所阐述和描述的本发明并不仅仅局限于如所描 述的各方面、各实施方式和各实施例，而且在本发明的精神和范围内也涵盖本发明的那些 变化和修改，鉴于本文所提供的公开内容和普通知识，这些变化和修改对本领域技术人员 (包括本领域中的普通技术人员）而言是显而易见的。
[0245] 工业应用
[0246] 根据如本文所公开的本发明，禾本科植物类内生菌菌株、植物/真菌共生体、从这 种共生体产生的种子和制造这种共生体的方法都具有工业应用，以便生产用于人或动物消 费的植物。
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