具有条件Acvr1突变型等位基因的啮齿类动物的制作方法
【专利说明】具有条件AcvH突变型等位基因的啮齿类动物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2013年3月13日提交的US 61/778,814的非临时申请，其出于所有目 的通过引用整体并入。
[0003] 以计算机可读形式存在的序列表的引用
[0004] 本申请包括2014年2月21日创建的大小为1千字节的文本文件439616SEQLIST. txt (其通过引用并入）中的序列。
[0005] 领域
[0006] 具有Acvrl基因的突变型等位基因的经遗传修饰的非人动物；包含Acvrl基因的 条件突变体的核酸构建体；展示进行性骨化性纤维发育不全（FOP)的表型特征的非人动 物。展示异位骨形成的经遗传修饰的小鼠。含有子宫外但非子宫内表达的条件突变型ACRVl 等位基因的非人动物。
[0007] 背景
[0008] Acrvl是骨形态发生蛋白（BMP)的I型受体。人Acvrl基因中的某些突变，包括产 生氨基酸修饰R206H突变的突变，与疾病进行性骨化性纤维发育不全（FOP)强相关（参见， 例如，美国专利申请公开号 2009/0253132 ;也参见，Pignolo, R.J. (2011)Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:Clinical and Genetic Aspects,Orphanet Journal of Rare Diseases，6:80, 1-6)。R206H突变，除其它以外，据信增强受体对活化的灵敏度并且使 其对沉默更具抗性。在Acvrl中具有R206H突变的嵌合小鼠发展FOP样表型（参见，例 如，Chakkalakal 等人(2012)An Acvrl R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva, J. Bone and Mineral Res. 27:1746-1756)〇
[0009] Acvrl中的某些突变，例如导致R206H Acvrl蛋白突变的那些突变，在小鼠中是围 产期致死性的。当突变是围产期致死性时，不可能通过非人动物的种系传递包含突变的敲 入基因。例如，上述研究需要利用嵌合小鼠的工作，所述嵌合小鼠在一些细胞中具有指定的 突变，但不能在种系中传递该突变；因此，还未建立在种系中包含R206H突变的稳定且有用 的小鼠品系。仍然存在对可在种系中传递是围产期致死性的或胚胎致死性的ACRVl突变以 产生用于例如产生非人动物（其展示与ACRVl突变相关的表型例如F0P、FOP特征，或相关 病症的特征、或相关病症）的后代的非人动物的需要。
[0010] 概述
[0011] 提供了在它们的种系中包含含有Acvrl基因的修饰的核酸序列的经遗传修饰的 非人动物。
[0012] 提供了在它们的种系中包含含有Acvrl基因的条件遗传修饰的核酸序列的经遗 传修饰的非人动物，其中所述遗传修饰使得非人动物易于异位骨形成。
[0013] 提供了在它们的种系中包含含有包含条件突变型Acvrl外显子的条件遗传修饰 的核酸序列的经遗传修饰的非人动物，其中条件突变型Acvrl外显子的表达的诱导赋予非 人动物对异位骨形成的易感性。在一个实施方案中，所述突变型Acvrl外显子是外显子5。 在具体实施方案中，所述突变表达具有拥有R2026H突变的外显子5的Acvrl-编码的蛋白。
[0014] 提供了条件地表达突变型Acvrl等位基因的非人动物。在不同方面，突变型Acvrl 等位基因是赋予表达所述等位基因的非人动物病理表型的等位基因。在不同方面，非人动 物包含上游和下游侧翼连接有位点特异性重组酶识别位点（SRRS)的Acvrl等位基因的突 变型外显子，并且非人动物包含识别SRRS的重组酶，其中所述重组酶是可诱导的。
[0015] 提供了包含引起（在一个实施方案中，在杂合子中；在一个实施方案中，在纯合子 中）、促进非人动物异位骨化、或使非人动物对异位骨化易感的Acvrl等位基因的修饰的非 人动物。
[0016] 提供了包含Acvrl等位基因的条件突变的非人动物，其中所述突变型Acvrl等位 基因不在子宫内表达，并且不在围产期表达，并且其中所述非人动物以条件方式表达突变 型Acvrl等位基因，其中所述条件表达通过向非人动物施用目标化合物来诱导。
[0017] 提供了包含条件突变型外显子的修饰的Acvrl基因座，其中所述条件突变型外显 子在实验性诱导的诱导后表达。
[0018] 在一个方面，提供了经遗传修饰的Acvrl基因座，其以反义方向包含突变型外显 子，在上游和下游侧翼连接SRRS。在一个实施方案中，所述基因座存在于非人动物中，所述 非人动物还包含识别侧翼连接所述突变型外显子的SRRS的诱导型重组酶基因。
[0019] 在一个方面，提供了包含以反义方向含有突变型外显子的经修饰的Acvrl基因座 的非人动物，其中所述突变型外显子在上游和下游侧翼连接有RSSR，当通过识别RSSR的重 组酶作用时所述RSSR被定向来指导倒转。在一个实施方案中，所述突变型外显子在倒转后 替代Acvrl基因座的对应野生型外显子。在一个实施方案中，非人动物还包含诱导型重组 基因，其中诱导型重组酶基因的重组酶识别RSSR。在具体实施方案中，所述RSSR是Iox位 点或其变体，所述重组酶是Cre，并且所述重组酶可由他莫西芬诱导。在具体实施方案中，所 述重组酶是Cre-ERT2。在一个实施方案中，非人动物是啮齿类动物，例如小鼠或大鼠。在具 体实施方案中，啮齿类动物是大鼠，并且所述突变型Acvrl外显子是外显子5。
[0020] 在一个方面，提供了包含含有编码R206H突变的突变型外显子5 (e5)的核酸构建 体的经遗传修饰的小鼠，其中所述突变型e5以反义方向存在，并在上游和下游侧翼连接有 被定向来指导突变型e5的倒转的RSSR ;并且所述小鼠包含编码能够使反义突变型e5外显 子倒转成有义方向的重组酶的诱导型重组酶基因。
[0021] 在一个方面，提供了在小鼠的种系中的Acvrl基因座上包含核酸构建体的经遗传 修饰的小鼠，其中所述核酸构建体，相对于Acvr 1基因的转录方向，包含以有义方向含有 野生型型e5基因和以反义方向含有突变型e5等位基因的构建体，其中野生型e5等位基 因的上游是与正好位于反义突变型e5的下游（相对于Acvri基因的转录方向）的第二 RSSR(RSSR2)相容的第一 RSSR(RSSRl)，其中RSSRl和RSSR2被定向来指导倒转。所述构 建体还包含置于野生型e5与突变型反义e5之间的第三RSSR (RSSR3)，并且所述构建体还 包含与RSSR3相容的并且位于RSSR2的下游（相对于Acvrl基因的取向的方法）的第四 RSSR(RSSR4)，其中RSSR3和RSSR4被定向来指导倒转。每一个RSSR(l-4)被相同的诱导型 重组酶识别。
[0022] 在一个实施方案中，所述诱导型重组酶存在于小鼠的种系中。
[0023] 在一个实施方案中，所述RSSR位点可被Cre重组酶识别。
[0024] 在一个实施方案中，RSSRl和RSSR2是1οχ2372位点；RSSR3和RSSR4是IoxP位 点，并且诱导型重组酶是CreERT2(参见，例如，图1)。
[0025] 在一个实施方案中，RSSRl和RSSR2是IoxP位点；RSSR3和RSSR4是1οχ2372位 点，并且诱导型重组酶是CreERT2(参见，例如，图1)。
[0026] 在一个实施方案中，CreERT2存在于R0SA26基因座（例如，Gt (R0SA26) Sor &eERT2/+ 上。
[0027] 在一个方面，提供了包含基因型ACvrl[R2° 6_w+、Gt (R0SA26) Sor&eERt2/+的经遗传修 饰的小鼠。
[0028] 在一个方面，提供了在子宫内和围产期表达正常Acvrl外显子5的经遗传修饰的 啮齿类动物，其中在用重组酶处理经遗传修饰的啮齿类动物时，小鼠表达包含由外显子5 编码的突变的Acvrl编码的蛋白质。在一个实施方案中，所述突变是编码R206H突变的外 显子5突变。
[0029] 在一个方面，提供了表达特征在于R206H修饰的突变型Acvrl基因产物的成年啮 齿类动物，其中至少99%的小鼠的细胞包含编码R206H修饰的突变型Acvrl基因。
[0030] 在一个方面，提供了包含特征在于R206H修饰的突变型Acvrl基因产物的经遗传 修饰的啮齿类动物，其中所述突变型Acvr 1基因存在于至少90%、95%、96%、97%、98%或 99 %或更多的经遗传修饰的啮齿类动物的细胞中。
[0031] 在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物在其种系中 包含Acvr 1基因座，所述基因座，在暴露于重组酶后，表达由包含R206H修饰的Acvr 1基因 座编码的蛋白质。
[0032] 在一个方面，提供了表达包含R206H突变的突变蛋白质的啮齿类动物，其中所述 小鼠是非嵌合的。在一个实施方案中，啮齿类动