专利名称：两种酵母菌株及其用于制备光学纯2－芳基丙酸的方法
技术领域：
本发明涉及酵母菌株和采用微生物制备光学纯2-芳基丙酸的方法。
背景技术：
2-芳基丙酸(可用通式表示为Ar-C*H(CH3)-COOH，其中Ar表示含芳环的取代基，C*表示手性碳原子)，是一类非常重要的手性化合物，在医药和农药等领域具有十分广泛的用途。已经发现，2-芳基丙酸的两种对映异构体在生物活性上存在着明显的差异。以酮基布洛芬[2-(3-苯甲酰苯基)-丙酸]为例，其(S)-对映体是一种高效的非甾体抗炎剂，抗炎活性比(R)对映体高100倍以上，而(R)-酮基布洛芬则具有镇痛及防治骨质疏松的作用。在其它的2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(如萘普生、布洛芬、芬布芬等等)和2-芳氧基丙酸系列除草剂中也存在类似的手性效应。
通过传统的有机化学方法合成得到的各种手性2-芳基丙酸一般都是等量的(R)和(S)两种对映异构体的外消旋混合物。拆分手性羧酸的经典方法是先与一种单一异构体的手性胺形成非对映异构体的盐，然后利用溶解度的差异使一种异构体优先从溶液中结晶出来。由于非对映体结晶法需要使用价格昂贵的光学纯手性拆分剂，成本相对较高、过程比较繁杂，而且会产生大量废水，因此近年来利用微生物或其酶催化的手性化合物对映选择性转化拆分方法，获得了越来越多的开发和应用。不少文献和专利已涉及这方面的技术，较为典型的有以下两个方面(1)使用商品化的脂肪酶制剂(主要来源于假丝酵母属Candida sp.)为催化剂。由于商品酶来源容易，这方面的文献报道较多，但在用于拆分2-芳基丙酸特别是酮基布洛芬时往往立体选择性不够理想，所以必须对酶进行纯化或其它额外的处理。例如文献J.Am.Chem.Soc.1990，1121990-1995通过酶的纯化并用脱氧胆酸盐和丙酮处理提高酶的选择性；专利U.S.Pat.5108916，Apr.28，1992通过离子交换或等电聚焦对粗酶进行纯化，获取选择性较高的单一组分(CSC-1或CSC-2)；文献J.Org.Chem.直接用2-丙醇处理改善粗酶的立体选择性文献J.Am.Chem.Soc.1995，1176854则报道了交联酶晶体拆分手性羧酸酯的效果。上述方法的一个共同缺点是商品酶制剂价格相对较高，额外的处理过程比较麻烦，并造成酶的活力损失，从而使酶催化剂的成本大幅度增加，影响了工业化应用的实际可行性。
(2)直接使用含有酯酶的微生物细胞对外消旋的底物进行立体选择性生物转化。由于微生物细胞易于培养、操作简单、成本低廉，因此在经济上比商品酶更具有优势，关键是筛选到高效专一的产酶菌株。这方面典型的文献有美国专利U.S.Pat.5516690，May14，1996公开了一株丝孢酵母菌Trichosporon labbacchii，系用乙醇为唯一碳源，从土壤中分离获得；用它的培养液转化酮基布洛芬乙酯可获得纯度为93％的(S)-酮基布洛芬，如果以酮洛芬甲酯为底物则可获得(R)-酮基布洛芬，但对映体纯度仅有86％。如果要获得更高纯度的产品(作为医药品纯度一般应达到98％以上)，还需要通过非对映体结晶的方法除去残留的少量对映体杂质。另一篇美国专利U.S.Pat.5457051，Oct.10，1995则公开了一株专门用于制备(R)-酮基布洛芬的白僵菌Beauveria bassiana ATCC44860，用其菌丝转化酮基布洛芬胆碱酯，最好情况下所得(R)-酸的对映体过量值也只有93.6％ee(相当于对映体纯度为96.8％)。由于酮洛芬胆碱酯的合成步骤非常复杂，而且需要使用有毒试剂(如硫酸二甲酯和碘甲烷)，因此给工业化应用带来了很大困难。
综上所述，在用生物催化法拆分2-芳基丙酸时，使用商品化的酶制剂价格较高，选择性不够理想，需要增加额外的处理步骤，而且通常反应的产物为(S)-酸和(R)-酯，后者需要经过进一步的化学水解才能转变为(R)-酸；比较而言，直接使用含酶的微生物细胞催化拆分手性羧酸的酯，工艺比较简单，成本比较低廉，因此具有较好的工业应用前景。但目前已公开的微生物转化技术中也存在着产酶菌株的选择性不够高，以及不能同时获得高纯度的(S)和(R)两种对映体等缺陷。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开两株立体专一性较高、而且对映选择性互补的酵母菌株，以及使用它们的细胞或从其中分离出的酯酶对外消旋的2-芳基丙酸酯进行一次或两次串联的水解反应，以制备高光学纯度的(S)和(R)-2-芳基丙酸的方法，以克服现有技术存在的选择性不够高，以及不能同时获得高纯度的(S)和(R)两种对映体等缺陷。
本发明的构思是这样的(1)自然界的微生物种类是非常丰富、多种多样的。既然自然界存在着(R)和(S)两种构型的手性酯，那末根据进化论的观点可以推断，自然界中必定也存在着对(R)和(S)两种底物具有较高专一性的酯酶。因此，发明人认为只要设计一定的方法，巧妙地筛选分离得到高度专一性的酯酶产生菌，那末通过高度对映选择性的酯水解，就可获得高度光学纯的单一对映体2-芳基丙酸。
(2)微生物及其酶催化的对映体拆分过程，实质上是以两种对映体底物的竞争性反应的速度快慢不同为前提的所谓“动力学拆分”过程，有关的定量分析及模拟曲线在文献J.Am.Chem.Soc.1982，1047294中已有详细记载。根据这一理论模型可以得到如下启示当目标对映体为反应的产物(酸)时，首先要选择对映选择率(E值)尽可能高的细胞或酶；其次，在细胞或酶的选择率不是特别高(如E＜50)的情况下，应当控制反应的时间，使反应的转化率(c)适当低一些(例如40％左右)；再次，当底物中的慢反应对映体被一定程度富集之后，再用对映选择性相反的另一种酶进行二次转化，则反应所得产物的光学纯度比单用后一种酶一步转化外消旋底物时所得产物的光学纯度要高。
使用的微生物用于本发明制备光学纯2-芳基丙酸的是一种属于Citeromyces属的酵母菌——固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCC No.0573和一种属于Trichosporon属的酵母菌——芸苔丝孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574，固囊酵母CGMCCNo.0573为Citeromyces属中的唯一种；芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574与Trichosporon laibacchii为同一属中的不同种。这两种菌株已于2001年05月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号分别为CGMCC No.0573和CGMCC No.0574。
上述菌种具有如下性质形态特征固囊酵母CGMCC No.0573该菌在麦芽汁液体培养基中30℃培养3天后，呈球形营养细胞，不产假丝，每个子囊中含一个子囊孢子，硝酸盐还原试验呈阳性，不产脲酶。该菌能发酵葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，不能发酵乳糖。该菌能同化琥珀酸、乳酸和乙醇，不能同化甲醇，对柠檬酸弱同化。
芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574在葡萄糖酵母膏蛋白胨液体培养基中25℃培养3天后，有真菌丝和节孢子，出芽细胞少见；细胞大小为(3-4.5)×(5-20)μm，有菌膜形成，沉淀物絮状。在葡萄糖酵母膏蛋白胨琼脂培养基中25℃培养一个月后，划线培养物灰白色，有邹纹，鹅绒状，质地坚韧，边缘有菌丝形成。在玉米粉琼脂Dalmau平板上培养时，有大量真菌丝产生。该菌不能发酵糖类。
根据文献“Theyeastsa taxonomic study”(Kurtzman et al，1998)和“酵母菌的特性与鉴定”(Barnettett et al，1983Yeasts-characteristics and identification，青岛海洋大学出版社)提供的鉴定方法和上述的试验结果，表明固囊酵母CGMCC0573属于固囊酵母菌属，而且该酵母菌类群中只有Citeromyces matriensis一个种；芸苔丝孢酵母CGMCC0574属于丝孢酵母属中的Trichosporon brassicae种，该菌种于2000年5月9日由中国科学院微生物研究所鉴定定名(“2000微检字第119号”)。通过常规的发酵方法，可以培养上述的固囊酵母CGMCC No.0573和芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574菌种。
上述的菌种是在上海地区获得的，筛选方法如下取1g新鲜土样，加到50ml筛选培养基中(含0.2％(NH4)2SO4，0.2％K2HPO4，0.05％NaCl和0.05％MgSO4·7H2O)，另加入少量酮基布洛芬乙酯的吐温-80乳化液或乙醇溶液作为唯一碳源，进行两轮富集培养；富集后进行薄板层析，取有酯水解产物(酮洛芬)的培养液，稀释涂平板(培养基组成同上)培养，取有透明圈的单菌落，在摇管中用丰富培养基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)培养24h后，加入酮基布洛芬乙酯的乳化液(10mM)，转化24h后，用等体积的乙酸乙酯萃取出产物酸和残留的酯，作HPLC分析(使用日本Daicel公司的手性色谱柱ChiracelOJ，φ0.46cm×25cm，流动相为正己烷/异丙醇/乙酸＝90∶10∶0.1)，计算底物的转化率和产物的对映体过量值(eep)。最后从500多株侯选菌株中选出两株分别选择性水解(R)-和(S)-酮基布洛芬乙酯的微生物固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCCNo.0573和芸苔丝孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574。
采用上述的微生物制备光学纯2-芳基丙酸的方法依次包括如下步骤(1)采用常规的方法进行菌种和细胞的培养菌种的准备分别将固囊酵母Citeromyces matriensis CGMCC No.0573和芸苔丝孢酵母Trichosporon brassicae CGMCC No.0574在灭过菌(121℃，20-40min)的丰富培养基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，琼脂1.5％)平板上划线，于25-30℃静置培养约2天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养(培养条件同上)，约2天后保存于4℃冰箱中备用。
细胞的培养挑取上述斜面培养的种子，接种到装有20mL液体培养基(组成同上，但不加琼脂)的100mL小摇瓶中，在适当温度(20-50℃，最好25-40℃)和转速(例如60-300r/min，一般120-180r/min)的摇床上培养12-18h后，按适当比例(比如5％)接种于含有100mL生长培养基的500mL大摇瓶中，在摇床上(30℃，150r/min)培养24-30h后取出，在4℃、8000r/min离心去除上清液，所得细胞用生理盐水(0.85％NaCl)洗涤一次。
(2)底物的转化将保藏号为CGMCC No.0574的菌株所培养的细胞(胞内含S-专一性酯酶)，以10g～200g(湿重)/L的浓度悬浮于磷酸钾缓冲液中，磷酸钾缓冲液的浓度为20～100mmol/L，pH为6-11，最好为pH＝8-9，加入含乳化剂的底物酯的乳化液，优选的乳化剂为吐温-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一种及其混合物，加入量为1～20g/L，于20～50℃的摇床上振荡反应1～5天时间后，将反应液用盐酸酸化至pH为2～3左右，再加等体积的乙酸乙酯萃取，静置，分相，收集含有酸和酯的有机相。从有机相取样作手性高效液相色谱分析，计算底物的转化率和产物的对映体含量(eep)；所说的底物酯为2-芳基丙酸与C1～C8脂肪醇所形成酯中的一种。
(3)产物的分离在上述含有酸和酯的有机萃取液中加入稀碱液反萃，即可获得含有(S)-酸的水相和含有(R)-酯的有机相。稀碱液包括NaOH或/和NaHCO3，其浓度为0.01～1.0mol/L，加入量以使最终pH为10～12时较为合适；向水相中加入盐酸酸化至pH为2-3，静置过夜后过滤，即可得到光学纯的(S)-型的单一对映体2-芳基丙酸的晶体产品。
将含有(R)-酯的有机相加热蒸发，去处除溶剂，即获得(R)-酯。
(4)二次拆分将上述萃取分离得到的(R)-酯，加入乳化剂如吐温-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一种及其混合物，乳化剂加入量为1～20g/L，制成(R)-酯的乳化液。将保藏号为CGMCC No.0573的菌株所培养的细胞(含R-专一性酯酶)作催化剂，以10g～200g(湿重)/L的浓度悬浮于磷酸钾缓冲液中，磷酸钾缓冲液的浓度为20～100mmol/L，pH为6-11，最好为pH＝8-9。将(R)-酯的乳化液与细胞的悬浮液等体积混合，于20～50℃的摇床上振荡反应1～5天后，用盐酸酸化至pH为2～3左右，再加等体积的乙酸乙酯萃取，静置，分相，收集含有酸和酯的有机相。从有机相取样作手性高效液相色谱分析，计算底物的转化率和产物的对映体过量值(eep)；向上述含有酸和酯的有机萃取液中加入稀碱液(控制最终pH在10-12)反萃，即可获得含有(R)-酸的水相和含有(S)-酯的有机相。向分离后的水相中加入盐酸至pH＝2-3，然后静置过夜并过滤，即可获得光学纯(R)-芳基丙酸的晶体。
按照本发明，也可以将外消旋的2-芳基丙酸酯先用含R-专一性酯酶的固囊酵母CGMCC No.0573的细胞催化水解至30-40％转化率，经萃取分离出光学纯度较高的(R)-型2-芳基丙酸和光学纯度较低的(S)-2-芳基丙酸酯；然后再用含S-专一性酯酶的芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574的细胞催化水解反应剩余的(S)-对映体部分富集的酯，再经碱液萃取和酸化结晶，以获得光学纯的(S)-型2-芳基丙酸晶体。
按照本发明，最好将培养所获得的细胞在含有丙酮或异丙醇的缓冲溶液中振荡处理1～15小时，再用于上述的催化反应。
采用本发明所说的生物转化工艺，不仅可以同时获得光学纯度很高的(S)和(R)-型2-芳基丙酸单一对映体产品，满足不同用途的医药或农药工业的需要，而且作为反应底物的2-芳基丙酸乙酯易于合成，无需使用昂贵或有毒的试剂，从而降低了原料的成本；此外，还省却了反应剩余酯的消旋化和循环利用，从而简化了操作步骤，并提高了原料的利用率。
具体实施例方式
以下将通过实施例对本发明的具体实施方式
进行详细的说明。
实施例1～6在5L发酵罐中装入3L生长培养基(葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)，灭菌后按5％的接种量接入CGMCC No.0574种子培养液，在温度为30℃、搅拌转速为600r/min和通气速率为0.4vvm的条件下，约12h后葡萄糖基本耗尽，菌体密度达到8.5g(干重)/L，酯酶活力达到10.3U/L。此时，补加葡萄糖至5g/L，该菌又继续生长并产酶，至24h放罐时菌浓可提高60％，酶活提高约50％。
各取100mL上述培养液，离心收集菌体，用生理盐水洗涤后，悬浮于20mL磷酸缓冲液中(50mM，pH＝7.0)，加入0.1g吐温-80，再加入酮基布洛芬与不同醇合成所得的酯(20mM)，于30℃和120r/min的摇床上保温反应，结果见下表。
表1芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574对酮基布洛芬不同酯水解的结果。酮基布洛芬相对速率转化率产物的构型对映选择率的各种酯(％) (％)及其含量(％) (E值)实施例1 甲酯 211 49R(93) 34实施例2 乙酯 100 45S(96) 54实施例3氯乙酯 67 49S(80)7.0实施例4异丙酯 38 44R(85)9.7实施例5正丁酯 47 37S(70)2.9实施例6正辛酯 26 23S(65)2.0实施例7将固囊酵母CGMCC No.0573接种于含有4mL生长培养基(葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)的摇管中，于30℃、120r/min培养42h后，加入20μl浓度为2M的酮基布洛芬乙酯的乙醇溶液，转化48h后，用4mL乙酸乙酯萃取后，进行HPLC分析，结果获得了(R)-酮基布洛芬，对映体纯度为96.8％，产率为27％。
当底物酮基布洛芬乙酯以吐温-80乳化液加入转化反应体系中时，反应速度明显加快，16h时转化率即达到31％，而产物(R)-酮基布洛芬的对映体纯度为96.5％。
实施例8用试管各取培养24h后的芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574培养液10mL，离心、洗涤收集所得菌体，重新悬浮于2mL含有1％丙酮或异丙醇的磷酸缓冲液中(50mM，pH7.0)，在摇床上振荡处理12小时后，离心、洗去处理试剂，再在2mL加有10mM底物乳化液(含0.5％吐温-80)的磷酸缓冲液中保温反应，测定酯水解的相对速率和对映选择性。结果与未作通透化处理的新鲜细胞相比，用丙酮处理过的细胞反应的初速度提高了61％，而用异丙醇处理过的细胞的反应速度则增加到2.35倍，反应的对映选择性则无明显变化，产物的对映体纯度保持在96-97％。
当把上述通透处理的缓冲液由pH＝7.0的磷酸盐替换为pH＝10的甘氨酸-NaOH缓冲液时，反应速度又提高了75％。在pH＝10的缓冲液中用1％的异丙醇处理不同时间，结果以10h的效果为最佳。在此条件下，2％异丙醇的处理效果比1％更好，反应速度为对照组的3倍多。当固定异丙醇的浓度为2％而改变细胞的浓度时，对处理的效果也有明显的影响，以30g(湿重)/L的细胞量为最佳。
实施例9用500mL的大摇瓶分别培养CGMCC No.0573和CGMCC No.0574的细胞(条件同上)，离心、洗涤后备用。
取4g芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574的细胞在(30g/L细胞、2％异丙醇，pH＝10)下处理10h后，悬浮于50mL的磷酸缓冲液中(100mM，pH 8.0)，加入1.4g酮基布洛芬乙酯(100mM)和0.25g吐温-80(0.5％)，在30℃、120r/min保温反应36h后，加数滴浓盐酸酸化至pH＝2，然后用50mL乙酸乙酯萃取生成的酮洛芬酸和反应剩余的酯，取样1mL作HPLC分析，结果(S)-酸的产率为30％，对映体纯度为95.5％。其余的萃取液用0.1N NaOH溶液反萃得到(S)-酮基布洛芬的盐溶液，用盐酸酸化后即得到(S)-酮洛芬的沉淀，再经过进一步结晶(NaHCO3/HAc)后，光学纯度提高到98％以上。
将上述反萃后得到的有机相蒸发浓缩，得到(R)-酮洛芬乙酯(对映体含量为78％)。取该酯0.46g悬浮于50mL磷酸缓冲液(100mM，pH＝7.0)中，加入0.25g吐温-80和4g固囊酵母CGMCC No.0574的湿细胞，在30℃、120r/min保温反应90h，测得(R)-酮基布洛芬的产率为40％，对映体纯度为97.8％；经分离和结晶后，产品中(R)-对映体的含量超过99％。
根据本发明公开的技术方案和实施例，有关的工程技术人员可以方便地将本发明所说的两株酵母菌及其培养与转化工艺举一反三地用于其它类型的2-芳基丙酸(如萘普生和布洛芬等)和2-芳氧基丙酸的对映体拆分。
权利要求
1.一种固囊酵母菌株CGMCC No.0573。
2.一种芸苔丝孢酵母菌株CGMCC No.0574。
3.一种制备光学纯2-芳基丙酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)采用常规的方法对权利要求1和权利要求2的菌株进行培养；(2)将保藏号为CGMCC No.0574的菌株所培养的细胞，在pH为6-11的缓冲液中，与含乳化剂的底物酯的乳化液振荡反应，然后将反应液用酸酸化至pH为2～3，用乙酸乙酯萃取，收集含有酸和酯的有机相；所说的底物酯为2-芳基丙酸与C1～C8脂肪醇所形成酯中的一种；(3)产物的分离在上述含有酸和酯的有机相中加入碱液反萃，获得含有(S)-酸的水相和含有(R)-酯的有机相，碱液加入量以使最终pH为10～12；用酸将水相酸化至pH为2-3，收集其中的光学纯的(S)-型的单一对映体2-芳基丙酸；将含有(R)-酯的有机相加热蒸发，去除溶剂，获得(R)-酯。(4)二次拆分以保藏号为CGMCC No.0573的菌株所培养的细胞在pH为6-11的缓冲液中与含乳化剂的(R)-酯的乳化液振荡反应，用酸酸化至pH为2～3，用乙酸乙酯萃取，收集含有酸和酯的有机相；在有机相中加入碱液，控制最终pH在10-12，收集含有(R)-酸的水相和含有(S)-酯的有机相，用酸酸化水相至pH＝2-3，收集其中的光学纯(R)-2-芳基丙酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的缓冲液为磷酸钾缓冲液，浓度为20～100mmol/L，缓冲液中的细胞以湿重计为10g～200g/L，缓冲液pH为8-9。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的乳化剂为吐温-80、聚乙烯醇或壬基酚聚氧乙烯醚中的一种及其混合物，加入量为～20g/L。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的碱包括NaOH或/和NaHCO3，碱液浓度为0.01～1.0mol/L。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的酸为盐酸。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，振荡反应温度为20～50℃，时间为1～5天。
9.一种制备光学纯2-芳基丙酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)采用常规的方法对权利要求1和权利要求2的菌株进行培养；(2)将外消旋的2-芳基丙酸酯先用固囊酵母CGMCC No.0573的细胞催化水解至30-40％转化率，经萃取分离出光学纯度较高的(R)-型2-芳基丙酸和光学纯度较低的(S)-2-芳基丙酸酯，然后再用芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574的细胞催化水解反应剩余的(S)-对映体部分富集的酯，再经碱液萃取和酸化结晶，获得光学纯的(S)-型2-芳基丙酸。
10.如权利要求1～9任一所述的方法，其特征在于，将培养所获得的细胞在含有丙酮或异丙醇的缓冲溶液中振荡处理1～15小时。
全文摘要
本发明公开了两种酵母菌株,固囊酵母CGMCCNo.0573和芸苔丝孢酵母CGMCC No.0574,并使用它们的细胞或从其中分离出的酯酶对外消旋的2－芳基丙酸酯进行一次或两次串联的水解反应,制备出高光学纯度的(S)和(R)－2－芳基丙酸。本发明不仅可以同时获得光学纯度很高的(S)和(R)－型2－芳基丙酸单一对映体产品,满足不同用途的医药或农药工业的需要,而且作为反应底物的2－芳基丙酸乙酯易于合成,无需使用昂贵或有毒的试剂,从而降低了原料的成本;此外,还省却了反应剩余酯的消旋化和循环利用,从而简化了操作步骤,并提高了原料的利用率。
文档编号C12N1/16GK1336437SQ0112661
公开日2002年2月20日 申请日期2001年9月4日 优先权日2001年9月4日
发明者许建和, 武慧渊, 沈端, 宫鹏飞 申请人:华东理工大学