专利名称：食品添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有预防性抗癌效果的食品添加剂。
背景技术：
已知有多种用于补充营养尤其是补充人类营养的食品添加剂，这些食品添加剂对健康状况具有有益效果，任选地对某些疾病的出现具有抑制效果。
捷克(Czech)专利号285 721(WO 99/50434)描述了微生物草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的菌株，用于制备红色着色剂，以及所述着色剂的用途，尤其是用作食品着色剂。该菌株于1998年3月19日保藏在国际保藏单位CCM-捷克微生物保藏中心The MasarykUniversity，Tvrdého 14,602 00 Bmo，捷克共和国(Czech Republic)。该菌株是一种从阿勒山脉下山谷中地土壤中获得的自然微生物。
发明内容
现在已经发现，当通过生产性微生物草酸青霉菌变种ArmeniacaCCM 8242的菌株的生物合成而获得的产物用于食品添加剂中时，它可以使所述添加剂具有抗癌效果。
同时，本发明涉及一种具有预防性抗癌效果的食品添加剂，其中添加剂由20-99.99wt％的通过生产性微生物草酸青霉菌变种ArmeniacaCCM 8242的生物合成而获得的产物，该产物通过对含有碳水化合物和氨态氮的营养培养液的发酵而获得，和0.01-80wt％的生理惰性载体，以及任选的辅助添加剂组成。
为了获得该生物合成产物，可以用普通的发酵方法培养生产性菌株。通过在生物量分离后从培养的含水培养基中通过分离方法得到了红色着色剂，当对红色着色剂进行光谱分析时，已经发现，尽管含有不低于85wt％的干物质含量，红色着色剂中有色物质的含量不低于52wt％。
着色原理基于蒽醌型的发色团。着色剂中由所述发色团的物质的混合物组成，并且这些物质与基本结构的不同在于未确定的寡肽或寡糖侧链。
发色团本身是一种具有五个取代基的蒽醌，其具有三个分离的骨架氢。例如，该化合物可以通过通式I表示
其中R1是羟基，R2是3-甲基-1，3-丁间二烯基，并且任选地R1和R2通过羟基的氧原子环化在一起。
因此，分子式Ia对应于基本变体，分子式Ib对应于环化形式。
因此，分子式Ia和分子式Ib分别特别地描述了8-乙基-3，6-二羟基-5[(1E)-3-甲基-1，3-丁间二烯基]-9，10-二氧代-9，10-二氢蒽-2-羧酸和6-乙基-10-羟基-3，3-二甲基-7，12-二氢-3H-萘[2，3-f]色烯-9-羧酸。
着色物质可以与铵、钾或钠阳离子一起存在于生物合成产物中，它们可以过量存在。来自初始营养培养液的蛋白质特征(氨基酸，肽)的物质可以作为补助物存在于这些产物中。
可以用常规方法在液体营养培养液中培养生产性菌株而得到红色着色剂，例如通过在平皿或平板中的表面法，或通过在发酵罐中的浸没法。接种材料的量是3-7vol％。对于接种过程，使用接种在例如在甘蓝浸液中、在玉米或酵母提取物或酵母自溶物中带有培养了五天的培养物的操作有效量菌种。
进行微生物合成方法的最佳条件包括温度为27-29℃，用160-280min-1的圆周速度连续混合，以空气与培养液的1.2∶1.0的体积比供给空气，操作发酵罐中的表压计量为50-80kPa。
在生产性微生物已经发酵24-35小时后，培养物上的液体变为红色，并且在培养64-72小时后红色的强度为最强-深樱红色。
使用碳水化合物、多种糖类、多元醇和烃，以及生产糖的废物-糖蜜-每升水使用10-20克，作为培养液成分。
对于供给氮，可以使用例如玉米提取物、酵母自溶物或提取物，以及多种形式的含氮化合物(如氨基酸)，其中氮的用量为0.5-0.7wt％。
本领域的熟练技术人员理解到本发明不限于使用上述菌株，尤其优选的菌株草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242，而是使用能产生红色着色剂的其它菌株或通过普通方法例如用X射线或用紫外光照射或者通过噬菌体及其类似物的作用而获得的所述微生物的突变体也在本发明的概念和范围内。
在完成生物合成后，可以用普通的分离方法从营养培养液中分离所得的红色着色剂。在分离生物量之后或者不分离生物量，将发酵培养液进行超滤，然后通过超微过滤将其浓缩为着色剂含量为80-100g/L的浓缩物。可选择地，将液体从营养培养液中过滤或离心除去，以分离生物量。为了沉淀着色剂，将液体酸化为pH3.0-2.5。可以用在食品生产中可接受的任何有机酸或无机酸进行酸化。可以用硫酸铝钾AlK2(SO4)3进行沉淀。在沉淀后，从液体中分离着色剂，例如通过离心或过滤除去液体。
在分析评价中，这样分离的产物表现出下述特征。
着色剂是暗红到黑色粉末，可溶于pH8-9的碱性水(NH3)、冰醋酸、蛋白、乙醇、甲醇、丁醇，部分地溶于丙酮，并且不溶于己烷、醚、苯、四氯甲烷，并且可以与金属形成水不溶性螯合物。
所制备的溶液为紫红色到暗红，在pH9-4稳定，并且它们几乎不依赖于pH值改变其色调。甚至在将中性溶液煮沸30分钟时，该溶液的着色也没有变化(不同于胭脂红、内胺(betanine)、花青素)。在水中的溶解度是大约100g/L。
在评价化学纯度中，在所得产物中得到了下述值(wt％)
对在上述条件下分离的且具有上述特征的红色着色剂进行如下试验急性口服毒性，90天亚慢性毒性，急性皮肤/眼睛刺激，抗生素活性，细胞毒性，诱变性和抗癌活性。
急性口服毒性
在根据OECD指南的试验化学物品的方法进行的小鼠急性口服毒性试验中，在以每千克体重使用2克单一剂量后，没有观察到毒性作用并且没有动物死亡。
亚慢性毒性
在根据OECD指南No.408进行的大鼠90天亚慢性毒理研究中，将被试验着色剂每天以0.5、10.0和25.0mg/kg的剂量施用于共计120只SPF HanWistar大鼠，施用90天。施用通过管饲法经口进行。在随后的组织病理学检查中，没有发现由被试验物质引起的变化；既没有发现肝脏毒性也没有发现肾脏毒性效应。在血液学检查中，证明被试验物质没有血液毒性，在生物化学检查中，证明被试验物质对所检验的生物化学参数没有任何显著影响。
皮肤/眼睛刺激
急性皮肤刺激/腐蚀试验是根据OECD指南No.404进行的，没有发现急性刺激作用。直到施用后48小时也没有观察到刺激或腐蚀的迹象。急性眼睛刺激/腐蚀试验是根据OECD指南No.405进行的。在急性眼睛刺激/腐蚀试验中(仅在眼球结膜中)，红色着色剂表现出中等作用；在施用后72小时后，没有观察到刺激或腐蚀的迹象。
抗生素活性
在菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)和粘质沙雷菌(Serratia marcescens)中试验被试验物质，对每一菌株进行三组平行试验(总共18个皮氏培养皿)。在任一培养皿中的施用了被测试物质的圆盘周围没有观察到生长抑制，甚至在24小时培养本身之前在那些保存在低温下16小时的培养皿中也没有观察到(这应该证明了这些物质慢慢地转移进琼脂的现象)。
细胞毒性
细胞毒性是在小鼠中在标准小核试验中评价的。以2、15和50mg/kg的单一剂量经口施用的红色着色剂没有表现出任何细胞毒性作用。在施用之后，红血球中的小核数量没有增加。被试验物质没有表现出任何诱变效应。
诱变性
诱变性试验(埃姆斯回复突变试验)是根据OECD指南No.47l在组氨酸缺陷型菌株鼠伤寒沙门氏杆菌中进行的。在给定的条件下，没有观察到在该产品在细菌突变上的作用。
抗癌活性
将在上述条件下分离的且具有上述特征的红色着色剂进行针对抗癌特性的筛选研究。
将被试验物质施用于患有腹水形式的Gardner淋巴肉瘤(IP-LsG)的小鼠。具有总分子式C20H18N2O3.HCl的6-(2-(2-羟乙基)氨乙基)-5，11-二氧代-5，6-二氢-11H-茚[1，2-c]盐酸异喹啉被用作参考物质。
使用重量为26.1-27.3g的雌性C3H小鼠。这些动物被存放在塑料容器中，并且用RATIO，s.r.o.，B
eclav，Czech Republic生产的NOE食物喂养，并且随意地让其饮用可饮用水。保持室内温度，相对湿度为60％，并且没有调节灯光状况。
通过接种腹水细胞将C3H小鼠中Gardner淋巴肉瘤维持为腹水形式，其中腹水细胞是通过穿刺腹腔在前一次接种后一星期取出的。将0.2ml腹水用氯化钠的等渗溶液稀释，施用于小鼠，施用方式为腹膜内注射10-20次。用于试验的细胞材料是通过在接种后第七天穿刺腹腔而得到的。对于治疗试验，接种用腹水进行，其中腹水是用注射用氯化钠等渗溶液稀释的，在体积为0.2ml的溶液中含有107个细胞，将其腹膜内施用于每一动物。
C3H小鼠六个多星期大，重26.1-27.3g，以10个动物分组，对照组为普通小鼠。每一给药途径和每一被试验物质使用两个剂量组。
剂量水平对于20g体重，分别以0.2-0.4ml和0.2-0.4ml口服(参考物质)的体积施用200和100mg/kg×5口服以及100和50mg.kg×5皮下。施用频率在第一天开始时每天1次。以表1中给出的剂量在第1-5天以连续方式施用被试验物质，并且在第一天参考物质被施用口服一次。
在施用完成后，留下动物监控其存活时间。与未施用对照组比较，评价剂量与存活时间的依赖关系。根据hájek(Fabián V.Základnístatistické metody(“基本统计方法”)，
Prague 1963、)，通过非参数试验即时评价作为生物响应的时间。
在实验完成后，假定时间值的对数是正态分布，方差为多个未知，用两个均值的相同性检验(t-检验)评价每个估计点的时间值(Roth Z，Josífko M.，
V.，
V.Statistické metody v experimentálnímedicíně(“试验医学中的统计方法”)，第278页，SZN，Prague 1962)。从时间对死亡的个体值计算几何平均值。如果试验标准值超过了临界值，那么对于显著性水平5％，平均值的差异被称作统计上显著。
结果概括在下述表中
表1
该表说明了时间对死亡的中值，根据Hájek在α＝0.05的显著性水平下通过非参数试验评价的统计显著性，以及依赖于物质剂量，存活动物数量的值与初始值相关。
n- 每组中的动物数量
1) 在α＝0.05的显著性水平下与对照组相比有统计显著性差异
LTS- 在第65天存活的动物数量
表2
该表说明了平均存活时间，对于P＝1＝α＝0.95的几何平均值的置信区间，和平均存活时间依赖于物质剂量的相对值，以与对照组的百分比表示。
n-每组中的动物数量
表3
该表说明了在试验开始时动物的平均重量，以及在治疗开始后一星期与依赖于物质剂量的对照组相比的体重降低系数。
n-每组中被评价动物的数量
基于上述表中列出的结果可以判断出，在最高测试剂量200mg/kg口服×5附近可以发现最适剂量，即在大约1g/kg口服的累积剂量附近。从经口和皮下施用中活性曲线行为的差异，可以预测到肝脏中物质的代谢转化。在强烈代谢变化的假定下，可以估计出人类可以忍受的重复剂量为600mg/m2口服。该剂量相当于16.2mg/kg口服，相当于1135mg口服×5的重复日剂量，即相当于在体重70kg的人体中5.67g口服的累积剂量。由于与被试验物质的施用相关的重量损失低于10％，尤其与参考物质相比，所以被试验物质没有表现出毒性。
附图简述
图1中的活性曲线表示在多种给药途径中依赖于物质剂量的相对风险系数R的自然对数的函数。
实施例
实施例1
用培养了两天的草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的培养物接种一种培养液，其中所述培养液含有12g/L的砂糖，5g/L的玉米提取物，0.002g/L的硫酸锌和0.001g/L的硫酸镁，并且所述菌株已经在接种设备中进行了培养，其基于培养液的量为4vol.％。在完成红色着色剂的生物合成后，从培养液中离心除去液体，以便从生物量中分离出来。用乙酸将液体酸化为pH3.0-2.5。用硫酸铝钾AlK2(SO4)2进行沉淀。在沉淀后，通过离心从液体中分离着色剂。
实施例2
用培养了两天的草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的培养物接种一种培养液，其中所述培养液包括16g/L的砂糖，7g/L的酵母提取物，0.002g/L的硫酸锌和0.001g/L的硫酸镁，其中所述菌株已经在接种设备中进行了培养，其基于培养液的量为6vol.％。在完成红色着色剂的生物合成后，从培养液中离心除去液体，以便从生物量中分离出来。用柠檬酸将液体酸化为pH 3.0-2.5。用硫酸铝钾AlK2(SO4)2进行沉淀。在沉淀后，通过离心从液体中分离着色剂，并将着色剂再结晶。
实施例3
用培养了两天的草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的培养物接种一种培养液，其中所述培养液包括20g/L的砂糖，10g/L的酵母自溶物，0.002g/L的硫酸锌和0.001g/L的硫酸镁，其中所述菌株已经在接种设备中进行了培养，其基于培养液的量为8vol.％。在完成红色着色剂的生物合成后，用10000-20000μm的薄膜对培养液进行超滤，随后用200-500μm的薄膜通过超微过滤的方法将培养液浓缩为一种含有100g/L着色剂的浓缩物。
实施例4
用培养了两天的草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的培养物接种一种培养液，其中所述培养液包括18g/L的砂糖，19g/L的酵母提取物，0.002g/L的硫酸锌和0.001g/L的硫酸镁，其中所述菌株已经在接种设备中进行了培养，其基于培养液的量为8vol.％。在完成红色着色剂的生物合成后，从培养液中离心除去生物量，并且用10000-20000μm的薄膜对培养液进行超滤，随后用200-500μm的薄膜通过纳米过滤的方法将培养液浓缩为一种含有80g/L着色剂的浓缩物。
实施例5
用75g麦芽糊精使根据实施例3得到的25g浓缩物均质化，并且在180-220℃的喷雾干燥器中干燥。
实施例6
用35g淀粉使根据实施例3得到的65g浓缩物均质化，并且在180-220℃的喷雾干燥器中干燥。
可以将根据实施例1-6得到的产物加入食物产品中，如香肠、糖果、酸乳酪和酒精饮料及其类似物中，基于食物产品的加入量为50-400mg/kg。它们可以被进一步用于制备具有2-10 vol.％的活性物质浓度的水溶液、酒精溶液或含水的酒精溶液。
实施例7
用乳液形式的药物赋形剂使根据实施例2得到的结晶产物均质化，用乳糖均质化，并且压缩为具有350-450mg的活性物质含量的片剂。也可以用乳糖和其它药物上可接受的载体制备片剂。
权利要求
1.一种具有预防性抗癌效果的食品添加剂，其特征在于它是由20-99.99wt％的通过生产性微生物草酸青霉菌变种Armeniaca CCM8242的生物合成而获得的产物，该产物是通过对含有碳水化合物和氨态氮的营养培养液的发酵而获得，和0.01-80wt％的生理惰性载体、以及任选的辅助添加剂组成的。
2.根据权利要求1所述的食品添加剂，其特征在于生物合成产物包括红色着色剂，该红色着色剂的发色团是式I的蒽醌衍生物
其中R1是羟基，R2是3-甲基-1，3-丁间二烯基，并且任选地R1和R2通过羟基的氧原子环化在一起的。
3.根据权利要求2所述的食品添加剂，其特征在于所述的发色团是8-乙基-3，6-二羟基-5[(1E)-3-甲基-1，3-丁间二烯基]-9，10-二氧代-9，10-二氢蒽-2-羧酸。
4.根据权利要求2所述的食品添加剂，其特征在于所述的发色团是6-乙基-10-羟基-3，3-二甲基-7，12-二氢-3H-萘[2，3-f]色烯-9-羧酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的食品添加剂，其特征在于所述食品添加剂包括11-75wt％的麦芽糊精作为生理惰性载体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的食品添加剂，其特征在于所述食品添加剂包括30-40wt％的淀粉作为生理惰性载体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的食品添加剂，其特征在于所述食品添加剂是以单位剂量形式存在的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的食品添加剂，其特征在于所述食品添加剂是以片剂、胶囊或丸剂的形式存在的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的食品添加剂，其特征在于所述食品添加剂包括一种作为载体的生理上可接受的液体。
10.一种为了抑制肿瘤的形成而施用于人类的药物组合物，其特征在于所述组合物包括一种通过生产性微生物草酸青霉菌变种Armeniaca CCM 8242的生物合成而获得的产物，通过对含有碳水化合物和氨态氮的营养培养液的发酵而获得。
11.一种产品，尤其是一种食物产品，其特征在于所述产品包括权利要求1-9中任一项的添加剂。
全文摘要
一种具有预防性抗癌效果的食品添加剂，其中添加剂包括20－99.99wt％的通过生产性微生物草酸青霉菌变种Armeniaca CCM8242的生物合成而获得的产物，是通过对含有碳水化合物和氨态氮的营养培养液的发酵而获得，和0.01－80wt％的生理惰性载体，以及任选的辅助添加剂。
文档编号C12R1/80GK1446053SQ01813990
公开日2003年10月1日 申请日期2001年7月23日 优先权日2000年8月10日
发明者E·萨尔达里扬 申请人:E·萨尔达里扬