编码1ysR1基因的新核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码1ysR1基因的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码lysR1基因的核苷酸序列，和通过弱化lysR1基因酶促生产氨基酸尤其L-赖氨酸的方法。lysR1基因编码LysR1蛋白，其是LysR家族的一种转录调节物。
现有技术L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工方法，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良棒杆菌菌株生产L-氨基酸的能力。
发明目的本发明人的目的是为酶促生产氨基酸，尤其L-赖氨酸提供改良的新方法。
发明描述本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有编码lysR1基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码包含SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO2氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)多核苷酸互补的多核苷酸，及d)包含a)，b)或c)多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，所述多肽优选具有转录调节物LysR1活性。
本发明还提供了上述多核苷酸，其优选是一种能复制的DNA，含有(i) SEQ ID NO1所示核苷酸序列，或(ii) 在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与(i)或(ii)序列的互补序列杂交的至少一个序列，及任选地，(iv) (i)中中性功能的有义突变。
本发明还提供了一种能复制的DNA，其含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列；一种多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；一种载体，其含有本发明的多核苷酸d)，尤其是插入大肠杆菌DSM13616中的pCR2.1lysR1int，保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，德国不伦瑞克)；及棒状细菌，其中lysR1基因中含有尤其是使用载体pCR2.1lysR1int进行的插入或缺失。
本发明因此提供了基本上由一种多核苷酸序列组成的多核苷酸，这些多核苷酸可通过用含有相应于SEQ ID NO1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库含有具有相应于SEQ ID NO1所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码LysR1蛋白的全长核酸、多核苷酸或基因，或分离与lysR1基因的序列具有高度序列相似性的核酸、多核苷酸或基因。
另外，含有本发明序列的多核苷酸还适用作引物，借助于其通过聚合酶链反应(PCR)，可以制备编码LysR1蛋白的基因的DNA。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为含有经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特别是具有LysR1蛋白生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO2的多肽至少70％，优选至少80％，特别优选至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸尤其L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码lysR1基因的核苷酸序列被弱化，尤其是被消除或低水平表达。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或消除，例如通过使用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及如果需要组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸特别是L-赖氨酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869和扩展短杆菌ATCC 14020或从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株，例如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳发酵短杆菌FERM-P 1712谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464谷氨酸棒杆菌DM58-1谷氨酸棒杆菌DG52-5谷氨酸棒杆菌DSM 5714和谷氨酸棒杆菌DSM 12866。
本发明人已成功地从谷氨酸棒杆菌中分离编码LysR1蛋白的新lysR1基因，该蛋白是LysR家族的一种转录调节物。
为了分离谷氨酸棒杆菌的lysR1基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。
为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller“细菌遗传学短期教材，针对大肠杆菌和相关细菌的实验指导和手册”，冷泉港实验室出版社，1992)。
然后将借助于粘粒或其它λ载体克隆的长DNA片段，亚克隆入适于DNA测序的常规载体中。
DNA测序方法参见于Sanger等(美国科学院院报745463-5467，1977)所述。
获得的DNA序列然后可以使用已知公式或序列分析程序加以检测，如Staden(核酸研究14，217-232(1986))所述，Marck(核酸研究16，1829-1836(1988))所述，或Butler所述GCG程序(生物化学分析方法39，74-97(1998))。
以此方式可获得编码lysR1基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，是本发明的一部分。另外，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得lysR1基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO2表示。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，本领域技术人员已知，蛋白质中的保守氨基酸置换如用丙氨酸置换甘氨酸，或用谷氨酸置换天冬氨酸，是有义突变，其不引起所述蛋白质活性的任何改变，即它们是中性的。另外，已知在蛋白质N末端和/C末端的变化基本不损害其功能而且甚至还稳定其功能。本领域技术人员可以找到关于这方面的信息，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169751-757(1987))，O’Regan等(基因77237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术61321-1325(1988))及熟知的遗传和分子生物学教材。以适当方式产生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
最后，使用得自SEQ ID NO1的引物通过聚合酶链反应(PCR)产生的DNA序列是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可见于Boehringer MannheimGmbH(德国曼海姆，1993)的“滤膜杂交的DIG系统使用指导”，和Liebl等(国际系统细菌学杂志41255-260(1991))。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在lysR1基因弱化后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
为获得弱化，可降低或消除lysR1基因的表达或酶蛋白的催化活性。两种措施可任选地组合。
可通过适当控制培养或通过遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构而实现降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如专利申请WO96/15246，Boyd & Murphy(细菌学杂志1705949(1988))，Voskuil & Chambliss(核酸研究263548(1998))，Jensen & Hammer(生物技术和生物工程58191(1998))，Patek等(微生物学1421297(1996))，Vasicova等(细菌学杂志1816188(1999))，以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例如Qiu和Goodman的论文(生物化学杂志2728611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学611760-1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶酶的变构调节和结构，Berichte des Forschungszentrums Julichs，Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德国，1994)。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
合适的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸置换对酶活性的影响，分别为错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至少一个碱基对(bp)导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。缺失几个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，GeorgThieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(″普通遗传学″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
在谷氨酸棒杆菌中突变基因的常用方法是基因破坏和基因置换方法，如Schwarzer和Puhler所述(生物/技术9，84-87(1991))。
在基因破坏方法中，将所述基因编码区的中心部分克隆在质粒载体中，所述载体能在一种宿主(典型地为大肠杆菌)中复制，但在谷氨酸棒杆菌中不能复制。适当的载体例如pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志1745462-65(1992))，pGEM-T(Promega公司，Madison，Wis.，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994))，生物化学杂志26932678-84；美国专利No.5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bemard等，分子生物学杂志234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志1734510-4516)。然后将含有所述基因编码区中心部分的质粒载体通过接合或转化移至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等(应用和环境微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如Thierbach等(应用微生物学及生物技术学29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。在通过“交换”同源重组后，相应基因的编码区被载体序列间断，并获得两个不完整的等位基因，一个缺失3’末端，一个缺失5’末端。这个方法例如已经由Fitzpatrick等使用，以消除谷氨酸棒杆菌中的recA基因(应用微生物学和生物技术42，575-580(1994))。


图1示出质粒载体pCR2.1lysR1int，利用其可破坏或消除lysR1基因。
在基因置换方法中，突变例如缺失，插入或碱基置换是在体外在相应基因中产生的。然后将产生的等位基因克隆入在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，然后将其通过转化或接合移至所需谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”事件，及实现切除的第二次“交换”事件的同源重组后，实现靶基因或靶序列中掺入突变体或等位基因。这种方法例如已经由Peters-Wendisch等使用，以通过缺失而消除谷氨酸棒杆菌中的pyc基因(微生物学144，915-927(1998))。
以此方式可以在lysR1基因中掺入缺失，插入或碱基置换。
另外，除了lysR1基因的弱化之外，特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的增强特别是过表达，对L-氨基酸尤其L-赖氨酸的生产也可以是有益的。
因此，例如为生产L-赖氨酸，选自以下的一或多种基因可以同时增强尤其过表达·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·编码烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，·编码zwf基因产物的zwf基因(JP-A-09224661)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144，915-927(1998)，·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)。
为生产氨基酸尤其L-赖氨酸，除了弱化lysR1基因之外，同时弱化选自以下的一或多种基因也是有益的·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)，·编码编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396478，DSM12969)，·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)。
另外，除lysR1基因的弱化之外，抑制非所需的二级反应对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
本发明还提供了根据本发明制备的微生物，其可连续培养或在分批方法，或在补料分批法或重复补料分批法中分批培养以生产L-氨基酸尤其L-赖氨酸。已知的培养法由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。另外培养基还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析方法是现有技术中已知的，分析可如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)·大肠杆菌菌株TOP10F/pCR2.1lysR1int，保藏号DSM 13616。
本发明的方法用于发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、Klenow处理和碱性磷酸酶处理方法，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.美国)。大肠杆菌的转化方法也见于这本手册。
常用的培养基如LB培养基或TY培养基的组分也得自Sambrook等所著手册。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库如Tauch等(1995，质粒33168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCos1粘粒载体试剂盒，编号251301)的粘粒载体SuperCos1(Wahl等(1987)美国科学院院报842160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编号27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编号27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编号27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编号200217)包装进噬菌体中。
为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 lysR1基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。
得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将这一连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报874645-4649)并在含有50μg/ml的zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。
重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmeermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报745463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(291)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始序列资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)制备计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。对该核苷酸序列的分析显示一912碱基对的开放读框，其被称为lysR1基因。lysR1基因编码304个氨基酸的多肽。
实施例3用于lysR1基因的整合诱变的整合载体的制备用Eikmanns等的方法(微生物学1401817-1828(1994))从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸棒杆菌的lysR1基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应lysR1intA5′-TTC CAA TCC CTG CTG TTC AC-3′lysR1intB5′-GTG ACC TTT GAA ACC AGC GA-3′。
所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，根据Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社)，用来自曼海姆宝灵格公司的Pwo聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离了lysR1基因的一个323bp长的内部片段，示作SEQ ID NO3。
用来自Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carsbad，CA，USA；目录号K4500-01)，将扩增的DNA片段连接进载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)生物/技术9657-663)中。
然后将这一连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10F(Hanahan，DNA克隆实用方法，卷I，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国，1985)。通过将转化混合物在补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化子中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI限制消化及琼脂糖凝胶电泳(0.8％)而证实。质粒命名为pCR2.1lysR1int。
实施例4 lysR1基因在赖氨酸生产菌株DSM 5715中的整合诱变根据Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信123343-347(1994))，将实施例3中的载体pCR2.1lysR1int电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。菌株DSM5715是AEC抗性赖氨酸生产菌(EP-B-435132)。载体pCR2.1lysR1int在DSM 5715中不能独立复制，只有在其整合进DSM5715的染色体中后才能在细胞中保持。通过将电穿孔混合物在补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带整合进染色体的pCR2.1lysR1int的克隆。
通过用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒，根据宝灵格曼海姆有限公司的“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)的方法标记lysR1int片段，以检测整合已经发生。根据Eikmanns等的方法(微生物学1401817-1828(1994))，从潜在整合子中分离染色体DNA，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII切割。经琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒在68℃杂交。实施例3中的质粒pCR2.1lysR1int已插入DSM5715染色体中的染色体lysR1基因内。该菌株命名为DSM5715∷pCR2.1lysR1int。
实施例5赖氨酸的生产实施例4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1lysR1int在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这一琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)pH调节为7.4。
向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始光密度(OD，660nm)是0.1。培养基MM用作主培养基。
培养基MMCSL(玉米浆)5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l盐(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l亮氨酸(过滤灭菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。
所得结果示于表1。
表1
附图简述图1质粒pCR2.1lysR1int图谱。
图中所采用的缩写和符号有如下含义KmR卡那霉素抗性EcoRI限制酶EcoRI的酶切位点lysR1intlysR1基因的内部片段ColE1 ori质粒ColE1的复制源点序列表<110>德古萨股份公司<120>编码lysR1基因的新核苷酸序列<130>000179 BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1311<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><221>CDS<222>(201)..(1109)<223>lysR1基因<400>1acagcccagg ggccgttgag ggggaaaagc tgcgttccaa tggcagcacc aaattgcagg 60gatagggcgg aacccatcac catcaacact gcagcggact gtttattcat gcccttgatt 120attgccaaag aaacctttaa ggactagatc gaaaaacagc caactatagt taagtaatac 180tgaacaattt tggaggtgtc gtg ctc aat ctc aac cgc tta cac atc ctg cag 233Met Leu Asn Leu Asn Arg Leu His Ile Leu Gln1 5 10gaa ttc cac cgc ctg gga acg att aca gca gtg gcg gaa tcc atg aac 281Glu Phe His Arg Leu Gly Thr Ile Thr Ala Val Ala Glu Ser Met Asn15 20 25tac agc cgc tct gcc atc tcc caa caa atg gcg ctg ctg gaa aaa gaa 329Tyr Ser Arg Ser Ala Ile Ser Gln Gln Met Ala Leu Leu Glu Lys Glu30 35 40att ggt gtg aaa ctc ttt gaa aaa agc ggc cga aac ctc tac ttc aca 377Ile Gly Val Lys Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg Asn Leu Tyr Phe 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His Leu Gln Val Glu Ile Ser Gln Leu115 120 125Glu Val Thr Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Arg Val Asp Val130 135 140Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Val Glu Val Pro Leu Val Glu Ala Ser145 150 155 160Ile His Arg Glu Val Leu Phe Glu Asp Pro Met Leu Leu Val Thr Pro165 170 175Ala Ser Gly Pro Tyr Ser Gly Leu Thr Leu Pro Glu Leu Arg Asp Ile180 185 190Pro Ile Ala Ile Asp Pro Pro Asp Leu Pro Ala Gly Glu Trp Val His195 200 205Arg Leu Cys Arg Arg Ala Gly Phe Glu Pro Arg Val Thr Phe Glu Thr210 215 220Ser Asp Pro Met Leu Gln Ala His Leu Val Arg Ser Gly Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Thr Pro Met Leu Glu Ser Val His Ile245 250 255Gln Pro Leu Pro Gly Asn Pro Thr Arg Thr Leu Tyr Thr Ala Val Arg260 265 270Glu Gly Arg Gln Gly His Pro Ala Ile Lys Ala Phe Arg Arg Ala Leu275 280 285Ala His Val Ala Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Val Glu290 295 300<210>3<211>383<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><223>lysR1内部片段<400>3ttccaatccc tgctgttcac ccttgccccg aaagccatcg cgcgcctgac 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1.一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有编码lysR1基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸，所述多肽优选具有转录调节物LysR1的活性。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是在棒状细菌中能复制的优选重组的DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。
4.权利要求2的能复制的DNA，含有(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。
5.权利要求2的多核苷酸，含有SEQ ID NO1所示核酸序列。
6.一种棒状细菌菌，其中lysR1基因被弱化，优选被消除。
7.一种生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤(a)发酵生产所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少lysR1基因是弱化的，(b)浓缩培养基或细菌细胞中的所需产物，及(c)分离L-氨基酸。
8.权利要求7的方法，其中使用的细菌中所需L-氨基酸生物合成途径的其它基因额外被增强。
9.权利要求7的方法，其中使用的细菌中降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分消除。
10.权利要求7的方法，其中编码lysR1基因的一或多种多核苷酸的表达被弱化，尤其是被消除。
11.权利要求7的方法，其中由lysR1多核苷酸编码的多肽的调节性质被降低。
12.权利要求7的方法，其中为生产L-氨基酸尤其L-赖氨酸，发酵的细菌中选自以下的一或多个基因被同时增强，优选过表达12.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2编码烯醇化酶的eno基因，12.3编码zwf基因产物的zwf基因，12.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.5编码赖氨酸输出的lysE基因。
13.权利要求7的方法，其中选自以下的一或多个基因被同时弱化13.1编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，13.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，13.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因。
14.前述任一项权利要求的方法，其中使用的是谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌的微生物。
15.一种发现RNA、cDNA和DNA以分离编码转录调节物lysR1的核酸、多核苷酸或基因，或与lysR1基因的序列具有高度相似性的核酸、多核苷酸或基因的方法，所述方法包括用权利要求1-4的多核苷酸序列作为杂交探针。
全文摘要
本发明涉及一种分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的一种多核苷酸序列a)与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。本发明还涉及使用棒状细菌酶促生产L－氨基酸的方法，所述细菌中至少编码一种转录调节物的lysR1基因以弱化形式存在。本发明还涉及所述多核苷酸序列作为杂交探针的应用。
文档编号C12N1/21GK1446226SQ01813989
公开日2003年10月1日 申请日期2001年7月18日 优先权日2000年8月10日
发明者贝蒂娜·默克尔, 迈克尔·法尔维克, 托马斯·赫尔曼, 卡罗琳·克罗伊策, 瓦尔特·普费勒 申请人:德古萨股份公司