专利名称：基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法
技术领域：
本发明涉及用于检测细胞凋亡或检测细胞程序性死亡的组合物和方法。
背景技术：
在本发明公开的内容中，不同的文献通过第一作者和日期，在括号内的，专利号或文献号被引用。完整的文献引用被提供在本申请的末尾用于参考。这些文献的内容通过引用被合并到本申请中用来更全面的描述本申请的相关技术。
细胞凋亡，也称为细胞程序死亡(“PCD”)，是在维持生物体的正常生理功能中起重要作用的非常重要的细胞过程[1，2]。例如，当DNA在细胞中被损伤且不能被修复时，细胞将进入细胞凋亡来避免在组织中形成畸形变态。此外，细胞凋亡过程被用于胸腺中来去除自我反应的T细胞从而来避免自身免疫。细胞凋亡必需被精确地调控来维持我们机体的正常功能。例如激活细胞凋亡的失败可引起癌症或自身免疫病[3]。另一方面，细胞凋亡的激活过度可导致有机体的巨大的损伤；其可导致很多的神经变性疾病例如亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)和阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)[4，5]。
由于很多重要的疾病，包括癌症，AIDS，自身免疫疾病以及神经变性疾病与细胞凋亡的不足或过度有关，能够启动或阻止细胞凋亡的药物在治疗很多的疾病中均是非常有用的。因此，在分子基础上研究细胞凋亡的过程是非常有意义的。指示细胞凋亡过程的信号途径是非常复杂的[6-8]。很多外部信号可以引发细胞凋亡的开始，包括UV照射，“死亡区域”通过TNF(肿瘤坏死因子)受体的激活，激素(例如，肾上腺皮质激素)治疗或化学疗法药物(例如，喜树碱)[6-9]。同样作为内部信号，已知细胞凋亡是细胞内事件程序性级联的结果，其主要激活一类称为半胱天冬酶(caspases)的半胱氨酸蛋白酶[7，10]。半胱天冬酶是死亡蛋白酶且彼此之间是异体同型的。它们在进化中是高度保守的且被发现可存在于从人到昆虫，线虫和水螅中[23-25]。在人体超过一打的半胱天冬酶已被鉴定，其中的三分之二被确信在细胞凋亡中行使功能[25，26]。
所有已知的半胱天冬酶具有一个活性位点半胱氨酸且在Asp-Xxx键处裂解底物。每一种半胱天冬酶的显著的特性通过裂解位点的4个残基氨基末端被检测[27]。半胱天冬酶被依据底物特异性，序列同源性以及结构相似性的程度被分成亚族。综述细胞凋亡的生物化学和半胱天冬酶的作用参见Hengartner，M.(2000)自然(Nature)407770-776。
目前，存在很多技术可以检测细胞凋亡在不同阶段的作用。例如，细胞凋亡的终止阶段可通过细胞的形态学变化被测定(例如存在凋亡体(apoptotic bodies))。在此之前，细胞凋亡可通过利用凝胶分析或TUNEL技术的DNA断裂来被检测[11]。细胞凋亡的早期阶段可通过Annexin V-FITC标记的蛋白[12]检测PS(磷脂酰丝氨酸)在膜中的转移来测定，或通过检测半胱天冬酶-3利用荧光染料连接到底物肽上的激活来测定[13]。然而所有的这些技术具有特定的局限性，例如凝胶分析仅被用于细胞的提取物，而不能用于单个细胞或完整的细胞。TUNEL方法仅仅可被应用于固定化细胞，而不是活的细胞。Annexin V仅仅检测外细胞表面而不是细胞内的情况。利用连接荧光染料肽的半胱天冬酶探针也具有其自己的局限性。首先，此探针不能穿透细胞膜，典型的其用于测定细胞提取物。其不能够进行体内测定。其次，半胱天冬酶裂解产生的荧光变化主要包括染料发射谱的迁移而不是荧光的全部破坏。其敏感性是有限的。因此，需要一种有效和精确的组合物和方法来检测程序性细胞死亡。本发明满足了这种需求并同时提供了相关的优点。
本发明也提供了实现可更好理解细胞凋亡的调控机制的研究以及有助于发现和改进新药来克服很多重要疾病的工具。
发明内容
目前，人们强烈地需要改进有效的方法来检测活细胞中的细胞凋亡过程的激活。本发明的检测方法基于的事实是程序性细胞死亡涉及一系列胞内称为“半胱天冬酶”的细胞内蛋白酶，这些半胱天冬酶的底物通常共享称为“底物序列”的共有序列识别和裂解氨基酸序列。通过遗传工程技术，分子探针被制备来通过插入编码底物序列的基因到连接两种不同颜色的荧光蛋白分子且显示荧光共振能量转移(FRET)特性的连接头上测定半胱天冬酶活性。当此改造的基因在细胞中表达时，其基因产物(例如探针的蛋白)是特异性半胱天冬酶的底物且在激活的基础上被半胱天冬酶裂解。在细胞裂解之后，探针的FRET特性被破坏。因此，半胱天冬酶的激活通过调控荧光探针的荧光特性的变化被检测。
与传统的检测细胞凋亡的技术不同，本发明提供了一种高度敏感性但简单的早期检测细胞凋亡的方法。本发明分子探针的改进利用三种不同的技术，其中的一些仅最近才被利用。其为(1)GFP技术的改进，(2)半胱天冬酶家族的已知底物序列，以及(3)FRET(荧光共振能量转移)方法。
本发明提供了一种用于检测蛋白酶和半胱天冬酶激活的细胞凋亡的荧光蛋白构建体。构建体含有一个供体荧光蛋白，一个受体荧光蛋白，和一个在受体和供体之间的连接肽。连接肽含有半胱天冬酶的底物序列。本发明也提供了编码荧光蛋白构建体的核酸，含有核酸的表达载体以及含有这些核酸的基因传递载体。
这些组合物在检测半胱天冬酶和蛋白酶激活的细胞凋亡地方法中是有用的，通过在适于刺激供体荧光蛋白的条件下培养含有上述核酸和/或蛋白的宿主细胞样本并检测样本中的荧光特性，其中存在细胞凋亡的样本细胞在供体蛋白和受体蛋白之间产生荧光共振能量转移的程度的变化。
图1显示了inter-GFP(“GFP”)探针设计的原理。此探针通过一个含有半胱天冬酶的底物序列的短肽(在此称为“传感蛋白”)连接一个蓝绿色的绿色荧光蛋白分子(CFP)与黄色GFP分子(YFP)来构建。当这两种GFP分子被连接在一起时，荧光共振能量转移现象就发生了。当细胞进入细胞凋亡时，激活的半胱天冬酶裂解了连接两个GFP分子的底物肽(例如“传感蛋白”)。当两种GFP分离时，就没有FRET发生了。
图2显示了纯化的重组FRET探针的SDS-PAGE分析。多组氨酸标记FRET融合蛋白在细菌中表达并通过Ni-NTA柱纯化。每一含有大约5.2μg蛋白的样本被通过12％SDS-PAGE凝胶电泳分析，然后用考马斯蓝染色。
图3A和图3B显示半胱天冬酶-3裂解的Western印迹分析。纯化的FRET探针与半胱天冬酶-3一起在反应缓冲液中于37℃温育1-2小时。反应混合物用SDS-PAGE分离并转到硝化纤维膜上。蛋白条带然后用抗-GFP抗体(Clontech)探针检测。CHO(AC-DEVD-CHO)，是半胱天冬酶-3特异性抑制剂。
图4A～图4C显示了半胱天冬酶-3处理改变了传感蛋白A和B的发射谱。通过分光荧光计(SPEX 1681)扫描谱分析测定每一探针的荧光发射谱。用于激发探针中CFP的波长为433nm。-cpp32在反应中没有半胱天冬酶-3。+cpp32半胱天冬酶-3被加到反应中。
图5显示了剂量依赖性的半胱天冬酶-3裂解试验。相同量的纯化的传感蛋白A和传感蛋白B蛋白与从0.3125ng到1.28μg范围的不同量的半胱天冬酶-3温育1小时。在反应的终止处通过分光荧光计测定每一样本的YFP和CFP的发射谱。每一样本的发射比率(YFP/CFP)依据没有半胱天冬酶-3的空白对照的比率被标准化。
图6显示了UV处理的HeLa细胞的传感蛋白A的图像分析。表达传感蛋白A和CFP-YFP融和蛋白的HeLa细胞被通过UV照射5分钟诱导细胞凋亡。当探针在440nm激活时，相同细胞的在UV处理前(A，C)和处理后(B，D)的CFP(480±15nm)和YFP(535±12.5nm)的荧光强度通过冷却的CCD成像系统记录。YFP/CFP的代表性的比率的图像显示在此。显著的FRET减少仅在表达传感蛋白A的两个细胞的B区观察到，而没出现在表达对照融和蛋白的细胞的D区中。
图7是在细胞凋亡的过程中FRET变化的统计分析。图像被记录在图6中。YFP和CFP的荧光强度被从每一个图像测定。来自13个表达传感蛋白A的细胞和9个表达CFP-YFP融和蛋白的细胞的UV照射前和照射后的YFP/CFP的平均值被图示在此。在表达传感蛋白A的apoptotic细胞中通过FRET探针检测发现有4倍的减少而在表达CFP-YFP融和基因的对照细胞中没有发现。
图8是Western印迹的结果，其表明纯化的传感蛋白C8和C8A蛋白(210nM)能够被两种不同的浓度(86nM和216nM)的半胱天冬酶-8裂解。YFP的位置和多组氨酸标记的CFP用箭头表示。
图9是剂量依赖性半胱天冬酶-8裂解实验。固定量的纯化传感蛋白C8和C8A蛋白(22.45nM)与不同量的半胱天冬酶-8一起温育1小时。每一样本的发射谱在反应终止时用分光荧光计测定(激发波长433nm)。发射比率(YFP526nm/CFP480nm)依据没用半胱天冬酶-8处理的对照样本的值进行标准化。
具体实施例方式
本发明的实施，除非另有说明，利用常规的分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的技术，其是本领域技术人员所公知的。这些技术具体的被阐述在文献中。这些方法被描述在下列文献中。参见，例如，Sambrook等，分子克隆(MOLECULAR CLONING)实验室手册，第二版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等eds.(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(学院出版社，Inc.)；PCRA PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等，IRL Press at Oxford University Press(1991))；PCR 2APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))；ANITBODIES，实验室手册(Harlow和Lane eds.(1988))；和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.(1987))。
定义在此处所用的特定的术语具有下面所定义的含义。
在本说明书中，单数形式″a″，″an″和″the″包括复数含义除非上下文清楚地显示其它的含义。例如，术语“一种细胞”包括多种细胞，包括其混合物。
此处所用的术语“包含”是指组合物和方法包含所列举的基本要素，而不包括其它的。当“基本上含有”被用于定义组合物和方法时，将排除组合的任意基本含义的其它要素。因此，在此定义的一种组合物基本上含有要素将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药理上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲液，防腐剂等等。“含有”意味排除多种其它成分的痕量元素以及用于实施本发明组合物的基本的方法。通过这些术语限定的实施方案在本发明的范围之内。
术语“多核苷酸”和“核酸”可选择的指任意长度核苷酸的聚合的形式。聚核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，和/或其类似物。核苷酸可具有任意三维结构，以及可执行任意已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括，例如，单，双链和三螺旋分子，基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，分离的任意序列的DNA，分离的任意序列的RNA，核酸探针，以及引物。核酸分子也可包括修饰的核酸分子。
被用于其用作广泛的含义的术语“肽”是指两或更多亚单位氨基酸，氨基酸类似物，或拟肽(peptidomimetics)的复合物。亚单位可被肽键连接。在另一个实施方案中，亚单位可被其它的键连接，例如，酯，醚等。此处所用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括，甘氨酸和D或L光学异构体二者，和氨基酸类似物和拟肽(peptidomimetics)。三或更多氨基酸的肽如果肽链很短通常被称为寡肽。如果肽链是长的，肽通常被称为多肽或蛋白。
术语“遗传修饰”是指含有和/或表达一个外源基因或核酸序列其依次修饰细胞或其子代的基因型或表现型。换句话说，其指细胞内源核苷酸的任意增加，删除或破坏。
此处所用的“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA并被翻译为肽，多肽，或蛋白质的过程。如果多核苷酸来自基因组DNA，表达可包括mRNA的剪接，如果适当的真核宿主被选择。表达所需的调控元件包括启动子序列来结合RNA聚合酶以及转录启动序列来用于核糖体结合。例如，一个细菌表达载体包括一个启动子例如lac启动子来用于转录启动Shine-Dalgarno序列以及启动密码子AUG(Sambrook等(1989)见上文)。类似的，一个真核表达载体包括RNA聚合酶II的异源或同源启动子，一个下游的多腺苷酸信号，启动密码子AUG和分离核糖体的终止密码子。此种载体可通过商业途径获得或通过本领域公知的序列来合成，例如，下面所述的常规的用于构建载体的方法。
“启动子”是DNA分子上的一个RNA聚合酶结合和启动转录的区域。启动子的核苷酸序列决定结合于其上的酶的特性和RNA合成的速率。在本发明中，术语“启动子”是指多核苷酸其不仅包括RNA聚合酶接合位点而且包括所有其它邻近的与调控转录启动例如阻遏或诱导转录的因子相互作用的序列元件。因此，此处所定义的“启动子”，是一个多核苷酸其包含所有的以相同于染色体中的天然元件的方式调控基因表达所需要的序列信息。
“在转录调控下”是本领域共知的术语，其表明多核苷酸序列通常为DNA序列的转录，依赖于其被可操作的连接于有助于启动的元件或启动子转录。“可操作地连接于”是指元件中的排列为允许其行使功能的方式。
术语“表达构建”是指一个含有启动子元件的多核苷酸可操作地连接于一个基因。表达构建可通过多种方式，例如子基因传递载体中或被插入到细胞的染色体中。此术语也指通过任意方法包括但不限于重组DNA技术，同源重组，基因或启动子元件的靶插入或基因或启动子元件的随机插入产生的启动子-基因融合。
“基因传递载体”被定义为可以携带被插入的多核苷酸到宿主中的任意分子。基因传递载体的例子为脂质体，生物相容的聚合物，包括天然的聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工的病毒外壳；金属粒子；和细菌，病毒，例如杆状病毒，腺病毒和逆转录病毒，噬菌体，质粒，真菌载体和其它的本领域所用的典型的重组载体，其已被描述用于在各种真核和原核宿主中的表达，以及可被用于基因治疗和简单蛋白表达。
“基因传递”，“基因转移”等类似术语是指外源多核苷酸(有时是指“转基因”)到宿主细胞中的导入，其与所用的导入方法无关。此方法包括各种已知的技术例如载体介导的基因转移(通过例如，病毒感染/转染，或各种其它的基于蛋白或基于脂类的基因传递的复合方法)以及促进“裸”多核苷酸传递的技术(例如，电穿孔，“基因枪”传递和不同的其它用于多核苷酸导入的技术)。导入的多核苷酸可以稳定的或短暂的维持在宿主细胞内。稳定的维持典型地要求导入的多核苷酸含有一个复制区域其与宿主细胞相容或被整合到宿主细胞的复制子中例如非染色体复制子(例如，质粒)或核的或线粒体染色体。如本领域和此处所述的，已知大量的载体能够介导基因传递到哺乳动物细胞中。
“病毒载体”被定义为重组产生的含有通过体内，来自体内(ex vivo)或体外被传递到宿主细胞中的多核苷酸的病毒或病毒粒子。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体及其类似物。其中的基因转移被介导通过逆转录病毒载体，含有逆转录基因组或其部分的多核苷酸的载体构建体，和一个转基因。此处的“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义其是指通过利用病毒进入细胞并整合其染色体组到宿主染色体组的能力将基因或核酸序列稳定的转移到宿主细胞中的过程。病毒进入宿主细胞通过其正常的感染机制或被修饰结合不同的细胞受体或配体来进入细胞。此处所用的逆转录病毒是指能够通过病毒或类病毒侵入机制导入外源核酸到细胞中的病毒粒子。
逆转录病毒以RNA的形式携带其遗传信息，RNA被逆转录成为DNA的形式整合到被感染细胞的基因组DNA中。被整合的DNA形式被称为原病毒。
一方面，其中的基因转移被DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺伴随病毒(AAV)，载体构建体，是指含有病毒基因组或其部分的多核苷酸，和转基因介质。腺病毒(Ads)是具有相关的特征，同源性的病毒组，包括超过50个血清型。参见，WO 95/27071。Ads较容易的生长且不需要整合到宿主细胞基因组中。重组体来源于Ad的载体，尤其是这些减少重组可能性和野生型病毒的产生的载体已被构建。参见WO 95/00655和WO 95/11984。野生型AAV具有高度的整合到宿主细胞基因组中的感染性和特异性。参见Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 816466-6470以及Lebkowski等(1988)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)83988-3996。
含有一个启动子和一个被可操作地连接于多核苷酸的克隆位点的载体是本领域公知的。此载体能够在体外或体内转录RNA，且可从例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)购买到。为了优化表达和/或体外转录，其可能有必要去除、增加或改变5′和/或3′的克隆的未翻译部分来除去额外的、可能的不适当的可选择的启动密码子或其它的在转录或翻译水平作用于或减少表达的序列。可选择的，共有核糖体结合位点可被插入在起始密码子的5’末端来增强表达。
基因传递载体也包括一些非病毒载体，包括DNA/脂质体复合体，以及靶向病毒蛋白-DNA复合物。含有靶向抗体或其片段的脂质体可被用于本发明的方法中。为了增强传递到细胞，本发明的核酸或蛋白可被结合于抗体或结合细胞表面抗原的抗体结合片段，例如，TCR，CD3或CD4。
此处所用的“报道基因”是一个编码被可被检测和测数的细胞所表达的蛋白的多核苷酸。因此，测定的报道分子的表达水平是使报道基因的表达的启动子元件的激活水平的指标。
“杂交”是指一个反应，其中的一或多个多核苷酸反应来形成复合体其通过核苷酸残基之间的氢键被稳定化。氢键可通过Watson-Crick碱基配对，Hoogotein结合，或以任意的其它序列特异性方式来产生。复合体可包括两条链形成的双螺旋结构，三或更多链形成的复合链结构，一个单链自我杂交链，或这些的任意组合。杂交反应可在更广的方法中构成为一个步骤，例如，PCR反应的启动，或多核苷酸被核酶的酶解。
严格杂交条件的例子包括大约25℃到37℃的温育温度；大约6×SSC到大约10×SSC的杂交缓冲液浓度。大约0％到25％的甲酰胺浓度；以及大约6×SSC的洗涤液。温和的杂交条件包括大约40℃到50℃的温育温度；大约9×SSC到2×SSC的缓冲液浓度；大约30％到50％的甲酰胺浓度；以及5×SSC到大约2×SSC的洗涤浓度。高度严格的杂交条件包括大约55℃到68℃的温育温度；大约1×SSC到0.1×SSC的缓冲液浓度；大约55％到75％的甲酰胺浓度；以及1×SSC到大约0.1×SSC的洗涤浓度，或去离子水。通常杂交时间为5分钟到24小时，用一个、两个或更多的洗涤步骤，以及温育时间为大约1，2，或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。可以理解，使用其它缓冲体系的SSC的等价物可被使用。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有特定(例如，80％，85％，90％，或95％)的“序列同一性”是指，当比对时，比较的两个序列的相同碱基(氨基酸)的百分比。此比对和百分比同源性或序列同一性可通过本领域已知的软件来测定，例如这些描述在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等，eds.，1987)增刊30，7.7.18部分，表7.7.1。优选的用于多核苷酸和多肽序列比对来测定百分比同源性的程序是CLUSTALW，使用缺省的参数。此程序可获自万维网的很多站点例如位于圣路易斯(Saint Louis)的华盛顿大学的生物计算学院的网站，MO(www.ibc.wustl.edu/msa/clustal.html)，德克萨斯州休斯敦医学Baylor学院的人类基因组测序中心(Human GenomeSequencing Center)，(dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及法国巴黎的巴斯德研究院(bioweb.pasteur.fr/seqanal/Interfaces/clustalw-simple.html)。
多核苷酸的“生物学等价物”被通过序列比对程序在缺省参数下测定的具有至少75％，或至少80％，或至少90％，或至少95％序列同一性，纠正序列数据的二义性以及在不改变功能的核苷酸序列中改变被表征的。“生物学等价物”多核苷酸也可通过在温和或严格条件下杂交被分离。除了序列相似性或与参照的多核苷酸杂交之外，生物学等价物多核苷酸与参照的多核苷酸具有相同或相似的生物学功能。
各种软件程序是本领域可获得的，其用来鉴定生物学等价物多核苷酸而不需要大量的试验。这些程序的非限制性的例子为BLAST家族程序包括BLASTN，BLASTP，BLASTX，TBLASTN，以及TBLASTX(BLAST可获自万维网http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，FastA，Compare，DotPlot，BestFit，GAP，FrameAlign，ClustalW，以及PileUp。这些程序可以是从市场上获得的综合的序列分析程序软件包例如GCG Inc.的Wisconsin软件包。其它的类似分析和比对程序可从不同的供应商购买例如DNA Star′s MegAlign，或GeneJockey比对程序。可选择的，序列分析和比对程序可通过万维网来使用，例如在www.sdsc.edu/ResTools/cmshp.html的CMSMolecular Biology Resource。任意的含有与基因或其片段相应的DNA或蛋白序列的序列数据库可以被使用来用于序列分析。通常使用的数据库包括但不限于GenBank，EMBL，DDBJ，PDB，SWISS-PROT，EST，STS，GSS，和HTGS。序列相似性可以通过比对靶序列和DNA序列数据库来辨别。可选择的，靶序列可被转换为六个阅读框；所有可能的阅读框的预知肽序列然后被与储存在蛋白数据库中的各个序列比较例如利用BLASIX程序。
用于检测同源性程度的上述比对程序的一或多个参数在本领域是确定的。其包括但不限于p值，百分比序列同一性和百分比序列相似性。p值是比对偶然产生的概率。对一个单一的比对来说，p值可通过Karlin等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872246被计算。对于多重比对来说，p值可通过利用启发式方法例如BLAST中的一个程序被计算。百分序列同一性通过在查询的序列和已知序列最佳比对时的核苷酸或氨基酸匹配的数目的比被定义。百分序列相似性通过与百分同一性相同的方式来计算除了一种计分的氨基酸，当计算百分相似性时其是不同的但是相似的。
“体内”基因传递，基因转移，基因治疗等术语是指含有外源多核苷酸的载体直接导入到生物体体内，例如人类或非人哺乳动物，由此外源多核苷酸被体内导入到此生物体的细胞中。
术语“分离的”是指分离自组分，细胞以及其它的方式，其中的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗体，或其片段，通常是天然产生的。例如，对于多核苷酸而言，分离的多核苷酸是分离自与染色体正常相连的5′和3′序列。对本领域技术人员是显而易见的是，非天然产生的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗体，或其片段，不需要“分离”来区别其与天然产生的相应物。此外，“浓缩的”，“单独的”，“稀释的”多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗体，或其片段被区别于天然产生的对应物，其每体积分子的浓度或数量与其天然产生的对应物相比大于“浓缩的”或小于“单独的”。多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗体，或其片段其在基本序列上区别于天然产生的对应物，或通过其糖基化形式，不需要其是存在于分离的形式由于其通过基本序列或可选择的，通过另外的特征例如糖基化形式被区别于其天然产生的对应物。尽管没有详述本发明在此公开的每一内容，可以理解所有用于描述下文公开的组合物和适当条件的上述实施方案，被本发明所提供。因此，非天然产生的多核苷酸被提供作为来自分离的天然产生的多核苷酸的单独的实施方案。在细菌细胞中产生的蛋白被提供作为来自分离自真核细胞的天然产生的蛋白的独立的实施方案，其中的细胞是自然产生的。
“宿主细胞”，或“基因修饰细胞”趋向于包括任意单独的细胞或细胞培养物，其可是载体或是载体的受体或包含外源核酸分子，多核苷酸和/或蛋白。其也包括单细胞的子代，且子代由于自然，偶然的，或定向的突变可能不是与起始的亲代细胞完全相同(在形态学或基因组或总DNA补体上)。细胞可以是原核的或真核的，且包括但不限于细菌细胞，酵母细胞，动物细胞，以及哺乳动物细胞，例如鼠科动物，鼠，猿或人类的。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物包括，但不限于，鼠科动物，猿，人类，农田动物，户外动物，和宠物。
“对照”是在实验中用于比较的目的的可选择的受试者或样本。对照可以为“阳性的”或“阴性的”。例如，当实验的目的是检测基因的改变的表达水平与癌症的特定表型的关系时，通常优选使用一个阳性对照(携带此种变化并显示该疾病的综合症状的特性的受试者或来自受试者的样本)，和一个阴性对照(缺少改变的表达和该病的临床症状的受试者或来自受试者的样本)。
术语“培养”是指细胞或生物体在不同类型培养基上或其中的体外繁殖。可以理解在培养基上生长的细胞子代可能与亲代细胞不完全相同(形态学，遗传学，或表型)。“放大”是指细胞的任意增殖或分裂。
“组合物”是指活性因子和其它化合物或组合物，惰性(例如，可检测的试剂或标记)或活性剂，例如助剂的组合。
“药物组合物”是指包括活性剂与载体，惰性剂或活性剂的组合产生适于体体，外内或来自体内的诊断或治疗用途的组合物。
此处所用的术语“药学上可接受的载体”包含任意的标准的药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液，水，和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。此组合物也可包含稳定剂和防腐剂。例如，载体，稳定剂和助剂，参见Martin REMINGTON′S PHARM.SCI，15th Ed.(Mack Pubi.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是指产生有益作用的或所期望的结果的充分的量。有效的量可以一或多种给药方式应用方法或剂量被给药。
绿色荧光蛋白(GFP)是一种非常有用的蛋白，其在过去几年的细胞和分子生物学的研究中有非常大的应用。GFP最初由Shimomura等人在1962年发现在水母Aequorea victoria中[14]且其基因被Prasher等人在1992年克隆和测序[15]。GFP分子含有通过设计三种氨基酸的氧依赖性环化反应产生的荧光团[16]。最近，人们发现GFP基因可在大量的细胞中表达来产生内源的荧光蛋白，而不需要外源的底物或辅酶[16-18]。利用这种内源荧光特性，GFP已成为用于研究基因表达的调控的强有力的工具。其也被用作融合标记来监视蛋白定位和在活细胞中的运动[16-18]。
本发明提供了基于GFP的分子探针，其对蛋白酶是更具体的，不同点的半胱天冬酶是敏感的。每种半胱天冬酶具有独特的识别和裂解的氨基酸序列(例如，“底物序列”)[19]。例如，半胱天冬酶-3的底物序列是DEVD(Asp-Glu-Val-Asp)。表1列举了几种半胱天冬酶及其底物序列。
表1蛋白酶别名 识别/裂解序列蛋白质底物半胱天冬酶-1 ICE Try-Val-Ala-Aap(YVAD)Pro-IL-1β半胱天冬酶-2 ICH-1/Nedd2 Asp-Glu-His-Asp(DEHD)PARP半胱天冬酶-3 CPP32/Yama/apopainAsp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，DNA-PK，SREBP1，2，rho-G半胱天冬酶-4 TX/ICH-2./ICEre1-II Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-5 TY/ICEre1-III Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-6 Mch2 Val-Glu-His-Asp(VEHD)Lamin A半胱天冬酶-7 Mch3/ICE-LAP3/CMH-1 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，pro-半胱天冬酶6，SREBP1，2半胱天冬酶-8 MACH/FLICE/Mch5 Leu-Glu-Thr-Asp(LETD)PARP半胱天冬酶-9 ICE-LAP6/Mch6 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)PARP半胱天冬酶-10 FLICE2/Mch4半胱天冬酶-11 ICH-3半胱天冬酶-12 DRONC半胱天冬酶-13 ERICE半胱天冬酶-14 MICE Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP聚(ADP-核糖)聚合酶参考Cryns V.和Yuan J.Genes Dev11，1551-1570，1998。Cohen G.M.Biochem J.326(Ptl)，1-16，1997.Negata S.Cell88，355-365，1997。Thomberry NA.等J.Biol Chem272，17907-17911，1997.
为了开发有实用用途的探针来检测半胱天冬酶在活细胞中的活性一些技术问题被解决和克服，例如(1)作为供体和受体的GFP的最匹配对的筛选；(2)优化连接头的设计使得FRET的影响在连接头被半胱天冬酶裂解之前最大化；和(3)优化连接头设计使得底物序列在连接头处较容易地被半胱天冬酶作用。
本发明的一个方面是荧光蛋白构建体用来检测蛋白酶或半胱天冬酶激活细胞凋亡或细胞程序死亡，其中的构建体含有1)一个供体荧光蛋白；2)一个受体荧光蛋白；以及3)一个含有蛋白酶或半胱天冬酶底物序列的肽连接头。该连接头位于连接供体荧光蛋白和受体荧光蛋白之间。此处的术语“半胱天冬酶激活的细胞程序死亡或细胞凋亡”是指细胞凋亡和细胞程序死亡由一系列的在凋亡(apoptotic)细胞中被特异性激活的半胱氨酸蛋白酶所引起。构建体特定的适于检测蛋白酶或鉴定在表1中的细胞凋亡激活的半胱天冬酶，上面的或选自含有半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12组的半胱天冬酶。酶的底物序列是本领域公知的，参见例如上文表1。
在另一方面，至少一个供体或受体是分离自生物体。在另一个方面，至少一个供体荧光蛋白或受体荧光蛋白是Aequorea-相关的荧光蛋白或其突变体或变体。可选择的，供体荧光蛋白或受体荧光蛋白二者均是Aequorea-相关的荧光蛋白或其突变体或变体。Aequorea-相关蛋白和其功能性变体是本领域的技术人员所公知的且是商业可获得的。参见，例如美国专利第5,981,200号以及其中引用的参考文献。尽管始终没有清楚的阐述，至少供体和/或荧光蛋白可为野生型，突变体或其生物学等价物是人们趋于理解的。生物学等价物可通过基于同源比较的测序或通过在前面所述的温和或严格条件下杂交来被检测。
两种GFP分子可具有不同的“颜色”(荧光特性)使得第一GFP(供体)的发射谱与第二GFP(受体)的吸收谱重叠。由于这两种GFP分子被连接在一起，“荧光共振能量”(FRET)现象就发生了[20]。也就是说，当供体分子被适当波长的光激发时，能量被转移到受体分子且其将发射荧光。在一方面，FRET现象对于检测半胱天冬酶的激活是有用的且当细胞进入细胞凋亡时，半胱天冬酶被激活。当两个GFP分子分离时，没有FRET发生。因此，当供体分子被激发时没有从受体的光的发射。这种荧光特性的改变可通过不同的光学装置被检测(例如，荧光显微镜或分光荧光计)。申请人测定到下面的GFP颜色对特别适于本发明BFP-GFP(蓝色-绿色)；CFP-GFP(青色-绿色)；BFP-YFP(蓝色-黄色)；以及YFP-CFP(黄色-青色)。
特定设计的探针含有两个GFP分子连接在一起通过含有半胱天冬酶的底物或裂解序列的短肽(参见图1)。肽连接头优选在4到30个氨基酸之间，或在6到30之间，或8到30之间，或8到20之间，或16到30之间，或16到20之间。在一个情况下连接头是16个氨基酸或更长。在另一个方面，连接头侧接于一个两个甘氨酸对，例如，GXXXXG或GGXXXXGG。在一个选择性的实施方案中，肽连接头超过50％的含有一或多的选自包括甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的组的氨基酸。
本发明也提供了一个编码荧光蛋白构建体的核酸和含有一或多个这些核酸的表达构建体。这些可进一步包含在基因传递载体中。蛋白构建体，核酸，表达构建体和本发明基因传递载体可在载体例如药学可接受的载体中，或在宿主细胞中以分离的形式提供。宿主细胞，依次的，可以分离的形式提供，或可选择的，与载体例如药学上可接受的载体结合的形式提供。
本发明的核酸分子可通过聚合酶链式反应(“PCR”)(Perkin-Elmer)被分离或复制。例如，序列可通过PCR(Perkin-Elmer)化学合成，其与寡核苷酸的合成结合，使得DNA序列容易的复制。PCR技术是美国专利第4,683,195号，第4,800,159号，第4,754,065号和第4,683,202号的主旨且描述于PCRTHE POLVMERASECHAIN REATION Mullis等eds，Birkhauser出版社，波士顿(1994)在此引用作为参考。可选择的，本领域的技术人员可使用此处所提供的序列和商业可获得的DNA合成仪来复制DNA。相应的，本发明也提供了获得本发明多核苷酸的方法通过提供多核苷酸，核苷酸，适当的引物分子，化学物质例如酶的线性序列和用于其复制和化学复制或在正确方向连接核苷酸来获得多核苷酸的操作规程。在一个独立的实施方案中，这些多核苷酸被进一步的分离。进一步的，本领域的技术人员可插入核酸到合适的复制载体中并插入载体到合适的宿主细胞中用于复制和扩增。如此扩增的DNA可通过本领域公知的方法自细胞分离。获得核酸分子的方法以及所获的核酸分子也被提供。
RNA可通过利用分离的DNA并可操作地连接其到适于宿主细胞的调控区并将其插入到宿主细胞中获得。DNA可通过任意合适的方法被插入，例如通过利用适宜的插入载体或通过电穿孔。当细胞复制物和DNA被转录为RNA时；RNA也可通过本领域公知的方法被分离，例如，上文的Sambrook等人所描述的(1989)。
本发明进一步提供了可操作地连接于RNA转录的启动子的核酸分子，以及其它的用于复制和/或DNA或RNA的短暂或稳定表达的调控序列。在特定的实施方案中，细胞特异性启动子被用于插入的核酸分子的细胞特异性表达。含有一个启动子或一个启动子/增强子，带有终止密码子和选择性标记，以及可操作的连接于启动子的DNA片段可被插入的克隆位点的载体是本领域公知的和商业可获得的。常规的方法学和克隆策略，参见GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY，Goeddel ed.，Academic press，Inc.(1991)引用在此作为参考以及VECTORSESSENTIAL DATA Series，Gacesa和Ramji，eds.，John Wiley & Sons，N.Y.(1994)，其包含图，功能特性，商品供应商以及不同合适的载体的GenEMBL注册号。优选的，这些载体能够在体外或体内转录RNA。
如上所述，本发明的核酸分子可操作地连接于RNA转录的诱导型或非诱导型的启动子。这些核酸分子对于荧光蛋白和多肽的重组制备或作为诊断用途的载体是有用的。相应的，本发明也提供了一种被插入上述核酸分子的载体(插入，复制或表达载体)，例如病毒载体，例如噬菌体，棒状病毒，逆转录病毒，或粘粒，或质粒，YACS，酵母和其它重组的载体。核酸分子通过本领域公知的方法被插入到载体基因组中。例如，插入子和在载体DNA可均被暴露于限制性酶来在两个分子上产生互补末端然后通过连接酶被结合在一起。可选择的，合成的核酸连接头可被结合于对应载体DNA限制性位点的插入DNA，其然后用识别特定核苷酸序列的限制性酶降解。此外，含有终止密码子和合适的限制性位点的寡核苷酸可被结合用于插入到含有例如一些或所有的下列元件的载体中一个选择性标记基因，例如新霉素基因用于哺乳动物中的稳定性或短暂转染子筛选；来自人巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的用于转录的高水平表达的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的SV40的转录终止和RNA加工信号；SV40多型瘤复制起点和用于正确的游离基因复制的ColE1；多向复合的克隆位点；以及用于正义和反义RNA体外转录T7和SP6 RNA启动子。
本发明的载体构建体的另一个实施例是包括启动子例如lac启动子且用于转录启动，Shine-Dalgarno序列和起始密码子AUG的细菌表达载体(Sambrook等(1998)见上文)。类似的，一个真核表达载体是含有异源或同源用于RNA聚合酶II的启动子，一个下游的多腺苷化信号，起始密码子AUG，和一个用于分离核糖体的终止信号。此载体可通过商业获得或通过此处所述的序列来合成。当一个核酸被插入到合适的宿主细胞中时，例如，原核或真核细胞以及宿主细胞复制物，蛋白可被重组制备。合适的宿主细胞将依赖于载体且可包括哺乳动物细胞，动物细胞，人细胞，猿细胞，昆虫细胞，酵母细胞，以及通过公知方法构建的细菌细胞。参见Sambrook等(1989)，见上文。除了利用病毒载体插入外源核酸到细胞中，核酸可通过本领域公知的方法被插入到宿主细胞中，所述方法例如细菌细胞的转化；利用磷酸钙沉淀转染哺乳动物细胞；或DEAE-葡萄聚糖；电穿孔；或微注射。此方法参见Sambrook等(1989)，见上文。因此，本发明也提供一种含有编码荧光构建体的核酸分子的宿主细胞，例如，一种哺乳动物细胞，动物细胞(鼠或小鼠)，人细胞，或细菌细胞。
本发明也提供了一种方法来检测半胱天冬酶激活的细胞程序性死亡，通过在激发供体荧光蛋白的条件下培养含有本发明宿主细胞的样本并检测样本中的荧光特性，其中半胱天冬酶激活的细胞程序性死亡在样本细胞中存在的情况下产生在供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度变化。检测的方法可被用于定量测定荧光能量转移程度的变化。
在另一方面，人们可以利用下述方法来检测是否试剂修饰了样本中细胞程序性死亡激活的半胱天冬酶，通过用试剂接触样本然后在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养并检测样本的荧光特性，其中试剂的活性通过荧光特性在试剂的存在和不存在的情况下的程度的变化被检测。此处的术语“试剂”包括但不限于小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，以及反义核酸分子。试剂可扩大细胞凋亡或下调控细胞凋亡。两种下调控半胱天冬酶激活的细胞凋亡的试剂的例子是(AC-DEVD-CHO)。方法可进一步被修改通过提供含有本发明宿主细胞的第二样本，在适于激发供体荧光蛋白的条件下培养细胞并比较两个样本中荧光共振能量转移的程度。
本发明也提供了用于实施上述方法的试剂盒，其中试剂盒含有核酸及其使用的说明。
试验实施例1尽管特定的实施例描述了半胱天冬酶-特异性探针的构建，对于本领域的技术人员来说很显然任意的蛋白酶及其底物可在所提供方法中被取代。相应的，下面的实施例旨在阐述，而不是限制本发明。
FRET探针的构建含有CFP-YFP融合基因的哺乳动物构建体通过下述来产生首先，EYFP从pEYFP-C1通过PCR扩增，其利用含有EcoRI位点的5`引物KL-3(5`-CCG GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAGG)，以及带有BamHI位点的3`引物KL-5(5`-CCG GAA TTC TATGGT GAG CAA GGG CGA GG)。其次，PCR产物从载体pECFP-C1(Clontech)的EcoRI和BamHI位点之间的CFP基因下游克隆。连接CFP和YFP的连接头的氨基酸序列是SGLRSRAQASNS。
第一FRET探针(传感蛋白A)通过用含有半胱天冬酶-3识别基序的GGDEVDGG替换CFP-YFP融合基因连接头区域的氨基酸RAQA。编码此多肽的双链DNA利用寡KL-6(5′-GGA AGA TCTGGA GGC GAC GAG GTG GAT GGA GGC TCG AAT TCT CGG-3′)作为模板和寡KL-8(5′-CCG AGA ATT-3′)作为引物进行引物延伸来被合成。然后DNA被克隆到BglII和EcoRI位点之间的CFP-YFP探针的连接头区。CFP和YFP之间的传感蛋白A的连接区由16个氨基酸组成且其序列是SGLRSGGDEVDGGSNS。
第二FRET探针(传感蛋白B)通过用GGSGGDEVDGGSGG替换CFP-YFP探针的连接头中的氨基酸RAQA来制备。插入的双链DNA通过利用寡KL-7(5′-GGA AGA TCT GGA GGC AGC GGA GGCGAC GAG GTG GAT GGA GGC AGC GGA GGC TCG AAT TCTCGG-3′)作为模板并用寡KL-8作为引物来产生。因此，传感蛋白B在两种GFP之间具有较长的连接头(22个氨基酸)并且其氨基酸序列为SGLRSGGSGGDEVDGGSGGSNS。
细菌版的FRET探针通过克隆来自哺乳动物构建体的CFP-YFP融合基因到载体pRSET-B(Invitrogen)的NcoI和钝末端HindIII位点之间。所有的融合蛋白在其N末端含有聚组氨酸标记。
构建的FRET探针可被半胱天冬酶-3裂解为了检测是否这些FRET探针对半胱天冬酶-3裂解敏感，纯化的蛋白与半胱天冬酶-3一起被温育然后进行Western印迹分析。抗体购自Clontech。图3A显示了半胱天冬酶-3可以裂解几乎所有的传感蛋白A和传感蛋白B蛋白，而在相同的条件下CFP-YFP融合蛋白没有被观察到裂解。在半胱天冬酶-3抑制剂(AC-DEVD-CHO)存在的条件下，没有FRET探针(传感蛋白A)被裂解，此表明裂解是半胱天冬酶-3特异性的(图3B)。
光学测定证明了FRET作用结果的变化对应于半胱天冬酶-3活性
FRET探针中荧光能量从CYP到YFP的转移通过分光荧光计被测量。当每一探针中的CFP被激发时，激发的波长为433nm，来自FRET探针的非常弱的发射光在已知的CFP的发射波长处(480nm)检测。相反，显著量的发射的荧光在峰值在526nm的YFP的发射波长处被检测到(图4A～图4C)。此结果表明有效的能量转移发生在CFP的供体分子和YFP的受体分子之间。其然后被测定是否FRET作用是对半胱天冬酶裂解敏感的。FRET探针被用半胱天冬酶-3测定并用分光荧光计分析。发现半胱天冬酶-3处理完全改变了传感蛋白A和B的发射波长，产生了YFP的发射峰的较大的减少以及CFP发射峰的显著的增加(图4A～图4C)。作为对照，从缺少底物序列的CFP-YFP融合蛋白的发射谱没有发现变化(图4A)。相似于图4A～图4C的图谱，测定半胱天冬酶处理前和处理后所有三种FRET探针的YFP(526nm)/CFP(480nm)的发射比率。此YFP/CFP比率被用于定量测定FRET的作用效果。我们发现，在用半胱天冬酶-3温育传感蛋白A或传感蛋白B后，YFP/CFP的发射比率减少4-5倍，传感蛋白A从3.02减少到0.59且传感蛋白B从2.76减少到0.59。
比较传感蛋白A和传感蛋白B的灵敏度为了比较传感蛋白A和传感蛋白B对半胱天冬酶-3活性的灵敏度，剂量依赖性的半胱天冬酶-3裂解方法被实施。在此试验中，1.28μg量的纯化传感蛋白A或传感蛋白B被与从0.3125ng到1.28μg范围的不同量的半胱天冬酶-3温育1小时。每一样本的YFP和CFP的发射谱在反应终止时用分光荧光计进行测定。每一半胱天冬酶反应的发射比率(YFP/CFP)用在反应中没有半胱天冬酶-3的空白对照的发射比率进行标准化。结果显示于图5中。人们发现两种FRET探针均对半胱天冬酶-3高度敏感，尽管传感蛋白A看上去比传感蛋白B稍微地更敏感。
使用FET探针来检测细胞凋亡期间的活细胞中的半胱天冬酶-3活性为了检测是否此FRET探针可被用于检测活细胞中的半胱天冬酶活性，传感蛋白A于HeLa细胞中表达并通过冷却的CCD成像系统测定探针在单细胞中的FRET作用。获自CFP和YFP的发射波长的细胞在UV处理前和处理后的荧光影像被记录。计算机软件(Metamorph，Universal Imaging)被用于产生每一细胞在不同处理中的YFP/CFP的比率图像。图6中A显示了在UV照射前表达传感蛋白A的两种HeLa细胞。在UV处理3小时后，这些细胞进入细胞凋亡。这些细胞的YFP/CFP比率图像的敏感性被发现突然降低(图6中B)。类似的试验在表达缺乏DEVD序列的CFP/YFP探针的HeLa细胞中进行，在UV处理的前后没有观察到比率图像的显著的变化(图6中C和D)。计算13个表达传感蛋白A的细胞凋亡细胞的平均YFP/CFP发射比率的变化，发现在UV处理后几乎4倍的减少(图7)。在另一方面，在9个表达CFP/YFP构建体的对照细胞中没有发射比率的显著的减少(图7)。
这些结果表明FRET探针是一种灵敏的工具，其可检测内源半胱天冬酶-3在细胞凋亡过程中的活细胞中的激活。最近，传感蛋白A被用于研究UV诱导的细胞凋亡过程中的活HeLa细胞的半胱天冬酶-3激活的动力学。我们发现，利用此种FRET探针，半胱天冬酶-3激活在任意的可视的细胞形态变化之前被清楚地检测到。此结果证明了FRET是用于细胞凋亡过程的早期检测的强有力的工具。
可以理解当本发明利用上述的实施方案来协助描述时，前面的说明和下面的实施例旨在阐述而并非限定本发明的范围。本发明范围内的其它方面，优点和修改对于本发明的技术人员而言是显而易见的。
试验实施例2半胱天冬酶-8特异性探针的制备1.半胱天冬酶-探针的结构和化学特征除了上述的半胱天冬酶-3特异性探针，传感蛋白A和传感蛋白B以外，我们改进了其它的FRET探针用于检测细胞凋亡过程中的半胱天冬酶-8活性。这些探针与传感蛋白A有类似的设计，其通过含有半胱天冬酶-8特异性裂解序列IETD(Ile-Glu-Thr-Asp)的肽连接头融合YFP基因与CFP基因。为了检测IETD位点增加探针对半胱天冬酶-8的裂解效率的可能性，我们导入单和双IETD位点到传感蛋白中。也即，传感蛋白C8具有一个IETD位点，而传感蛋白C8A具有两个IETD位点，如下所示传感蛋白C8His(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-S-N-S-YFP传感蛋白C8AHis(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-I-E-T-D-S-N-S-YFP多组氨酸标记的传感蛋白C8蛋白被在细胞中表达并利用Ni-NTA亲和柱纯化。纯化的传感蛋白C8蛋白与半胱天冬酶-8酶一起温育并进行SDS-PAGE和通过抗组氨酸抗体进行Western印迹分析。结果被显示于图8中。在应用半胱天冬酶-8之前。传感蛋白C8和传感蛋白C8A为单链，其带有大约63kDa的分子量，其接近所期望的CFP和YFP融合蛋白的分子量(见图8的条带1和2)。在半胱天冬酶-8被加入到反应中之后，两个传感蛋白被裂解为两个与抗-GFP作用的带。上面的条带具有His-CFP的大约33kDa的期望的分子量且显示出有与抗-组氨酸抗体的反应。这些结果表明传感蛋白C8和C8A能够被半胱天冬酶-8裂解来释放CFP和YFP分子。
为了比较两个C8探针之间的裂解的效率，相同量的传感蛋白C8蛋白(120nM)被与不同量的半胱天冬酶-8酶一起温育，反应混合物通过Western印迹试验分析。显示在图8中的结果表明与传感蛋白C8相比，传感蛋白C8A蛋白被半胱天冬酶-8裂解为较大的片段(参见图8，条带3-6)。条带5和6中的蛋白的强度分析表明95％的传感蛋白C8A蛋白在用半胱天冬酶-8(216nM)温育一小时后被裂解(条带6)。而仅有58％的传感蛋白C8蛋白在相同条件下被裂解(条带5)。此结果表明传感蛋白C8A中双IETD的存在通过半胱天冬酶-8显著的增加其裂解的敏感性。
2.光学检测表明传感蛋白C8A是一种用于检测半胱天冬酶-8活性的更敏感的探针为了检测传感蛋白C8A中的CFP和YFP之间是否具有能量转移，我们利用分光荧光计检测了纯化的传感蛋白蛋白的发射谱。当传感蛋白C8蛋白在CFP的发射波长处(433nm)被激发时，在YFP的发射波长(526nm)处比在CFP的发射波长(480nm)处检测到更多的荧光，此清楚的表明具有FRET作用。能量转移的效率通过两种半胱天冬酶-8传感蛋白的YFP(526nm)/CFP(480nm)的发射比率被计算。测定传感蛋白C8和C8A的FRET比率分别为2.82和2.54。
为了比较不同传感蛋白对半胱天冬酶-8的敏感性，我们进行了一系列的剂量依赖性的半胱天冬酶裂解试验，相同量(22.45nM)的传感蛋白C8和C8A蛋白与不同量的半胱天冬酶-8酶温育一个小时。然后，我们用CFP的激发波长(433nm)的光来激发反应产物，并通过光学荧光计测定其发射谱。结果显示在图9中，其中YFP(526nm)/CFP(480nm)的发射比率以相对于半胱天冬酶的浓度被绘制。发射比率(YFP/CFP)被标准化来区别于未裂解传感蛋白蛋白的发射比率。我们观察到需要大约0.71nM的半胱天冬酶-8来减少传感蛋白C8A的50％的FRET作用，而需要5倍的更多的半胱天冬酶-8(3.4nM)来产生传感蛋白C8的相同FRET减少量。这些结果表明含有双IETD位点的传感蛋白C8A比仅含有单个IETD位点的传感蛋白C8对半胱天冬酶-8裂解更敏感。
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权利要求
1.一种用于检测在细胞凋亡中半胱天冬酶或蛋白酶激活的荧光蛋白构建体，含有a.一个供体荧光蛋白；b.一个受体荧光蛋白；以及c.一个含有半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列的连接供体荧光蛋白和受体荧光蛋白的肽连接头。
2.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中至少一个供体荧光蛋白或受体荧光蛋白含有Aequorea-相关的荧光蛋白。
3.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白均是Aequorea-相关的荧光蛋白。
4.如权利要求3所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白均是绿色荧光蛋白。
5.如权利要求4所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白选自含有BFP-GFP；CFP-GFP；BFP-YFP和YFP-CFP的供体和受体荧光蛋白对。
6.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中至少一个供体荧光蛋白或受体荧光蛋白含有分离自生物有机体的荧光蛋白。
7.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头含有一个选自半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12的半胱天冬酶的裂解位点的裂解识别位点。
8.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头实质上含有具有4至30个氨基酸的多肽。
9.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头侧接于甘氨酸氨基酸。
10.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中连接供体荧光蛋白和受体荧光蛋白的肽连接头含有两个或更多的半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列。
11.编码如权利要求1-10中任一项所述蛋白构建体的核酸。
12.含有如权利要求11所述核酸的表达构建体。
13.含有如权利要求1-10中任一项所述蛋白构建体的分离的宿主细胞。
14.含有如权利要求11所述核酸的分离的宿主细胞。
15.含有如权利要求12所述表达构建体的分离的宿主细胞。
16.含有如权利要求11所述核酸的基因传递载体。
17.一种用于检测在细胞凋亡中半胱天冬酶激活的方法，包括在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养含有如权利要求1所述的蛋白构建体或编码如权利要求1所述的蛋白构建体的核酸的宿主细胞并检测样本中的荧光特性，其中半胱天冬酶激活的细胞凋亡或细胞程序性死亡在样本细胞中的存在导致供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度的变化。
18.如权利要求17所述的方法，进一步包括对荧光能量转移程度变化的定量测定。
19.一种检测在细胞凋亡中某种试剂是否改变了宿主中半胱天冬酶或蛋白酶激活的方法，包括用试剂接触含有如权利要求1所述的蛋白构建体或编码蛋白构建体的核酸的宿主细胞，并在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养该细胞，及检测样本荧光特性，其中试剂的活性通过在试剂的存在或不存在时的荧光特性的变化而检测。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述试剂选自小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，反义核酸以及来自传统中药的分离的化合物及其化学衍生物。
21.如权利要求19所述的方法，进一步包括提供宿主细胞的第二样本并在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养第二样本，并比较两个样本中荧光共振能量转移的程度。
全文摘要
本发明涉及一种基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法。提供一种荧光蛋白构建体来用于检测在细胞凋亡中蛋白酶或半胱天冬酶的激活。该构建体含有一个供体荧光蛋白；一个受体荧光蛋白；以及一个连接头肽，其中的连接头肽含有半胱天冬酶的底物序列。连接头肽位于供体和受体蛋白之间。本发明还提供了该编码荧光蛋白构建物的核酸，含有该核酸的表达构建体以及含有这些核酸的基因传递载体。所述方法通过在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养含有上述核酸和/或蛋白的宿主细胞的样本并检测样本中的荧光特性，其中细胞程序性死亡在样本细胞中的存在导致供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度的变化。
文档编号C12Q1/37GK1396265SQ0212042
公开日2003年2月12日 申请日期2002年5月24日 优先权日2001年5月24日
发明者张东才, 罗茜 申请人:香港科技大学