专利名称：采用两套重组系统删除特定外源基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备转基因植物的方法，具体的说，本发明涉及的是利用一种两套不同来源的位点特异性重组系统的协同作用使特定的外源基因在转基因植物的杂交后代中删除的方法。
目前已通过基因工程的方法获得了能够抵抗病虫害，除草剂以及适应各种极端环境(如抗旱，抗寒)的转基因作物，其中相当一部分已进入田间试验并进行大规模的商业应用。与此同时，对转基因作物后代中外源基因的控制也越来越为人们所重视。一方面为了保护生物技术公司的利益，促使农户使用携带优良性状基因的商业化种子和种子的更新，使得制种部门始终能够在种子质量上保持优势。另一方面是出于对转基因作物安全性的考虑，比如控制抗虫基因在转基因棉花子代中的行为，我们既要保证子一代棉花大田生产中抗虫基因在适当启动子的控制下高效表达，将虫害的威胁降至最低程度。又要使这种转基因棉花的群体在以后的世代中会逐步删除其中的抗虫基因，从而降低棉花群体的抗虫性。由此可见，对转基因作物后代中外源基因的控制对于转基因植物的产业化和种子的商业化具有重要的应用价值。到目前为止，国内还没有报道能够特异地删除转基因植物后代中特定的外源基因的有效的方法。本发明提供的就是一种能够把特定外源基因从转基因作物的杂交后代中直接删除的分子方法。这在国内来说尚属首创。
美国USDA和D&P公司于1998年共同申请的专利US 5723765公开了一种控制植物基因表达的方法，即将三个DNA序列导入一种植物细胞，其中第一个DNA序列含有一个致死基因和一个在晚期胚胎发生中活化的启动子，致死基因和晚期胚胎发生中活化的启动子功能性相互连接，但由一个两端具有特异切除序列的阻断序列分隔开，阻断序列的存在阻止了致死基因的表达。第二个DNA序列含有位于一个阻抑型启动子调控下的重组酶基因，该重组酶特异于第一个DNA序列中阻断序列两端的特异切除序列。第三个DNA序列含有编码特异于第二个DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物的基因。对外源基因的控制既可以通过施加外部刺激物而获得，也可以通过杂交获得。该专利描述了利用一种位点特异性重组系统控制植物基因表达的分子生物学方法，比如可以通过造成杂交种子的败育以达到对转基因植物后代中基因的控制。但其中并没有涉及到对转基因作物的后代中外源基因进行直接的删除和控制。
本发明的优点就在于利用两套不同的位点特异性重组系统的协同作用，通过转基因亲本植株之间的杂交而直接删除其后代中特定的基因。从技术的角度来说，本发明使用的方法具有明显的创新性。而且由于所选用的定位重组系统的严格的特异性，外源基因的删除只发生在特定的两种转基因植株之间，它不会因为花粉的传播造成其它植株中基因的丢失或者种子的败育，从保护生物多样性这一点上说，本发明相对于国外的种子终止技术也具有明显的优越性。
来源于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母2u质粒的FLP/FRT系统，酵母PSR1质粒的R/RS系统和噬菌体Mu的Gin/gix系统是目前研究的较清楚的四种定位重组系统。这些定位重组系统都由重组酶和特异识别位点组成(Odell，《Recombination and Gene Silencing in Plants》，J.Paszkowski(ed.)，219-270(1994))。其中Cre，FLP，R和Gin分别编码重组酶，重组酶由单个多肽构成，它们的蛋白序列之间有很大的差异，但C端都有一个40个氨基酸的同源区域。其中有三个保守的氨基酸序列His-Arg-Tyr，可能是它们的活性位点。loxP，FRT，RS和gix是分别被上述四种重组酶所识别的特异序列。重组酶的靶位点都含有约12-13bp的倒置重复序列，中间隔以2-8bp的间隔区，间隔区的方向决定了重组酶介导的重组的方向性。如果两个识别位点的方向相反，中间的DNA序列会发生倒位。两个识别位点的方向相同则会切除中间的DNA片段，如果两个识别位点分别位于两个DNA分子上，则会发生整合反应。除了Gin需要一个大肠杆菌宿主的辅助因子外，其它的几种重组系统都可以独立的行使功能，不需要任何其它的辅助因子。到目前为止，定位重组系统已经被广泛应用于转基因动植物中外源基因的失活或活化，从而控制生物体的发育和表型特征。其中以Cre/loxP和FLP/FRT应用最为广泛，研究也最深入。FLP/FRT在果蝇中应用较多而Cre/loxP则在小鼠中广泛使用，而且这两套系统都已分别应用于高等植物中外源基因的控制以及染色体研究。但现有技术并没有描述两套不同的定位重组系统结合使用在植物基因工程方面的应用，也没有描述在它在转基因作物后代中外源基因的控制和删除方面的应用。
本发明提供一种能把特定的外源基因从转基因植物的杂交后代中删除的方法。包括从以下两个不同的重组DNA序列稳定地转化植物细胞，其中所述的第一个重组DNA序列包括两端接有第一种能被特异性识别和剪接序列的编码一种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第一个重组DNA序列还包括编码能识别第二个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列。其中所述的第二个重组DNA序列包括两端接有第二种能被特异性识别和剪接序列的编码与第一个重组DNA序列中相同或者不同种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第二个重组DNA序列还包括编码能识别第一个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列。并由此植物细胞再生得到的完整植株。当这两种转基因植株发生杂交以后，两种重组酶基因都在启动子的驱动下表达，由于和它们的识别切割位点在空间上的靠近，两种重组酶就能够切割和删除它们各自识别位点之间的特定的核苷酸序列。
根据本发明的一个实施方案，其中所说的第一个重组DNA序列中的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白质编码序列，并且还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列以及下游3’端的终止子序列。
根据本发明的这一实施方案，其中所说的第二种位点特异性重组酶选自于包含Cre，FLP，R编码的位点特异性重组酶中的一种。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第二种位点特异性重组酶的编码序列上游的组成型启动子序列包括但并不仅限于35S启动子序列。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第一种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列选自于包含能分别被Cre，FLP，R所识别并剪接的特异性DNA序列中的一种。它们分别为loxP，FRT和RS。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第一种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列不能被第一个重组DNA序列中编码的第二种位点特异性重组酶所识别并剪接。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的一种能改善植物某种形状的蛋白质可以是一种与抗虫，抗除草剂或者可以抵抗各种不良环境等有关的的蛋白质。包括但并不仅限于来源于苏云金杆菌的Bt抗虫基因。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的一种能改善植物某种形状的蛋白质的核苷酸序列不但包括该蛋白质的编码序列，还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列和一些起表达调控功能的序列，以及下游3’端非编码区的表达调控元件。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第二个重组DNA序列中的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白质编码序列，并且还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列以及下游3’端的终止子序列。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第一种位点特异性重组酶选自于包含Cre，FLP，R编码的位点特异性重组酶中的一种。但不同于第一个重组DNA序列中的第二种位点特异性重组酶。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第一种位点特异性重组酶的编码序列上游的组成型启动子序列包括但并不仅限于35S启动子序列。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第二种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列选自于包含能分别被Cre，FLP，R所识别并剪接的特异性DNA序列中的一种。它们分别为loxP，FRT和RS。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的第二种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列不能被第二个重组DNA序列中编码的第一种位点特异性重组酶所识别并剪接。
根据本发明的这一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种分别被第一个和第二个重组DNA序列转化的两个亲本植物细胞或植株。所说的外源基因的删除是由含有两个不同的重组DNA序列的转基因种子发育成的完整植株进行杂交而得到的。
所说的第一个重组DNA序列按5’→3’的顺序包括编码能识别第二个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列，两端接有第一种能被特异性识别和剪接序列的编码一种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列。所说的第二个重组DNA序列按5’→3’的顺序包括编码能识别第一个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列，两端接有第二种能被特异性识别和剪接序列的编码与第一个重组DNA序列中相同或者不同种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列。
在上述的这个实施方案中，用所说的两个重组DNA质粒分别转化的植株均携带有Bt抗虫基因，它可以在5’端35S启动子的驱动下表达，使两种转基因植株都表现出抗虫性。虽然两种植株均携带有一种重组酶的核苷酸编码序列以及两个同向的重组酶识别位点序列，但由于第一个重组DNA序列中编码的重组酶是特异于第二个重组DNA序列中的识别序列的，而第二个重组DNA序列中编码的重组酶则特异于第一个重组DNA序列中的识别序列。它们之间不能发生相互识别和切割，所以在两个相对独立的转基因植株中抗虫基因不会被删除。如果两种转基因植株之间发生相互传粉，而且异株的花粉往往更优先参与受精过程，将会发生以下的过程由第一个重组DNA序列转化的植株上的重组酶基因进入由第二个重组DNA序列转化的植株的胚胎中，或者由第二个重组DNA序列转化的植株上的重组酶基因进入由第一个重组DNA序列转化的植株的胚胎中，由于空间上的靠近，两种重组酶都在CaMV35S启动子的驱动下表达，识别其相对应的识别序列并切除基因组中的35S/Bt结构。从而导致转基因植株杂交后代中Bt基因的删除。
本发明用于靶植物的实际转化方法对本发明不是关键，可以使用本领域技术人员所熟知的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但并不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
用于将转化细胞再生成整个植株的方法对本发明不是关键，可以使用任何对靶植物合适的方法，本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。
给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，但并不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。
图1为携带35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的双元表达载体pBFC的构建流程。图2为携带35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的双元表达载体pBLF的构建流程。
实施例1酿酒酵母Sacchromyces Cerevesiea中克隆FLP重组酶基因根据已发表的酿酒酵母菌株2μ质粒中FLP重组酶的核苷酸序列设计并合成下列一对寡核苷酸引物引物1GAG AAG ATC TAAGCA TGC CAC AAT TTG G(SEQ ID NO1)和引物2GAG GTCACC GCG TAC TTA TAT GCG TCT(SEQ ID NO2)。
将酿酒酵母菌株A364a接种于50mlYEPD液体培养基，28℃振荡培养至对数生长期，以6000rpm/min离心5分钟收集菌体，每管加入1ml蒸馏水重悬细胞，再加入100μl的0.5MEDTA(PH8.0)和40μl巯基乙醇，混匀后在室温下放置5分钟。以6000rpm/min离心5分钟，去上清，加入500μl柠檬酸磷酸盐缓冲溶液(PH5.8，含1M山梨醇)和200μl蜗牛酶溶液(15mg/ml)，混匀后于37℃摇床振摇1小时。以5000rpm/min离心5分钟，去上清，每管加入1ml柠檬酸磷酸盐缓冲溶液(PH5.8，含1M山梨醇)重悬和洗涤，重复三遍。每管加入400μl柠檬酸磷酸盐缓冲溶液，轻轻振荡，重悬细胞，缓慢加入40μl 20％SDS溶液，混匀后于65℃水浴30分钟。加入200μl 5MKac溶液，冰上放置1小时。以12000rpm/min离心10分钟，取上清，加入等体积的酚；氯仿∶异戊醇(25；24；1)，混匀后以10000rpm/min离心5分钟。将上相转移至另一离心管中，重复抽提一遍。加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA以12000rpm/min离心10分钟，每管加入20μl蒸馏水溶解DNA沉淀。
取1μl 2μ质粒DNA作为模板，利用上述的引物1和引物2进行PCR扩增反应94℃预变性10分钟；94℃变性1分钟，48℃退火45秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃继续延伸10分钟。从琼脂糖凝胶上回收1260bp的特异条带。按3∶1的比例使回收产物与pGEM-T-easy载体(Promega公司)连接过夜。用连接反应混合物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，于37℃培养过夜。挑取白色菌落提取质粒，经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，将所得到的重组质粒命名为pFLP-T2。经核苷酸序列分析，所克隆的DNA片段的核苷酸序列与已发表的编码FLP重组酶的核苷酸序列完全相同。实施例2 携带FRT-35S/Bt-FRT的重组载体的构建pSVpaZ11质粒携带有两个同向FRT位点，pGΩ4AB质粒则含有35S启动子调控下的苏云金杆菌Bt毒蛋白基因。用HindIII酶切消化pGΩ4AB质粒，从中切出一个含有35S/Bt基因的3.0kb片段，将该片段连接至同样用HindIII酶切消化的pSVpaZ11质粒中。经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到携带两端含有两个同向的FRT位点35S/Bt基因的重组质粒pBt-FRT。实施例3 携带35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的表达载体的构建用HindIII和SacI消化pMM23质粒，从中切出1.8kb含有35S/Cre的片段，将该片段连接至同样用HindIII和SacI酶切消化的双元表达载体pGPTV-bar中。经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到含有35S/Cre的表达载体pCre-bar。
用PvuII消化实施例2中所述的重组质粒pBt-FRT，回收3.0kb含有FRT-35S/Bt-FRT的片段，连接HindII-XmnI adaptor(SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)后将该片段连接至用HindIII消化的表达载体pCre-bar中，经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到含有35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的双元表达载体pBFC。用冻融法将其转入土壤农杆菌LBA4404中，经PCR鉴定后保存菌种备用。实施例4 携带loxP-35S/Bt-loxP的重组载体的构建用HindIII酶切消化pGΩ4AB质粒，回收含有35S/Bt基因的3.0kb片段。加入dGTP和dATP后用klenow DNA聚合酶将其粘末端部分补平，得到只有两个碱基的粘性末端。用XbaI酶切消化pGlGUS18质粒，回收含有两个同向的loxP位点的3.1kb的载体片段。加入加入dCTP和dTTP后用klenow DNA聚合酶将其粘末端部分补平，得到只有两个碱基的粘性末端。将上述的经过部分补平的载体和片段连接，经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到含有loxP-35S/Bt-loxP的重组质粒pBt-loxP。实施例5 携带35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的表达载体的构建用SalI和PvuII消化实施例4中所述的重组质粒pBt-loxP，回收含有loxP-35S/Bt-loxP的3.1kb的片段。将该片段连接到用SalI消化的双元表达载体pCAMBIA1301中，经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到含有loxP-35S/Bt-loxP的表达质粒pBt-loxP-1301。
用BglII和BstEII酶切消化表达质粒pBt-loxP-1301，回收12.8kb的载体片段。同样用BglII和BstEII酶切消化实施例1中所述的pFLP-T2重组质粒，回收1.2kb的编码FLP重组酶的片段，将上述的回收的载体和片段连接，即将FLP重组酶基因置换表达质粒pBt-loxP-1301中GUS基因，使FLP重组酶基因置于35S启动子的调控之下。经过限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到含有35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的双元表达载体pBLF。用冻融法将其转入土壤农杆菌LBA4404中，经PCR鉴定后保存菌种备用。实施例6 含35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的土壤农杆菌转化烟草取实施例3中所述的pBFC转化的土壤农杆菌LBA4404菌种，接种到含有200mg/l链霉素，50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的20ml的液体YEB培养基中，于28℃振荡培养20-24个小时。用此培养物按Horsch的方法(Science，2271229-1231)进行烟草的叶盘法转化。取上述土壤农杆菌培养物1ml按1∶20的比例稀释到20ml液体MS培养基中。把在25℃下生长4-6周的烟草无菌苗幼嫩叶片剪成1平方厘米大小，在土壤农杆菌稀释液中浸泡5分钟后取出用无菌滤纸吸去多余菌液。将这些叶片放置到含1mg/l 6BA的MS固体培养基上于25℃下暗培养两天，然后转移到含有500mg/l羧苄青霉素和10mg/l PPT的固体MS培养基上，于25℃下按14小时白天，14小时黑夜的光周期培养。约3周以后，将生长至1厘米以上的小苗转移到含有500mg/l羧苄青霉素和5mg/l PPT的固体MS培养基中诱导生根，约两周后可见根的形成。从而得到完整的再生植株。将生长至5厘米左右的完整植株从培养瓶中取出，洗去残留的MS培养基，移栽到花盆中在温室中继续生长。取温室中生长的再生烟草叶片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取总DNA。取2μl总DNA，分别用引物3(SEQ ID NO3)和引物4(SEQ ID NO4)，引物5(SEQ ID NO5)和引物6(SEQ ID NO6)，引物7(SEQ ID NO7)和引物8(SEQ ID NO8)进行PCR反应。结果扩增到1.0kb，0.4kb，0.9kb的分别特异于Cre，bar和Bt基因的片段。取上述提取的总DNA 10μl，用Bt基因片段做探针，用BoehringerMannheim的非放射性标记和检测试剂盒进行Southern印记检测，证明已经得到所需的转基因植物。实施例7 含35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的土壤农杆菌转化烟草取实施例5中所述的pBLF转化的土壤农杆菌LBA4404菌种，接种到含有200mg/l链霉素，50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的20ml的液体YEB培养基中，于28℃振荡培养20-24个小时。用此培养物按Horsch的方法(Science，2271229-1231)进行烟草的叶盘法转化。取上述土壤农杆菌培养物1ml按1∶20的比例稀释到20ml液体MS培养基中。把在25℃下生长4-6周的烟草无菌苗幼嫩叶片剪成1平方厘米大小，在土壤农杆菌稀释液中浸泡5分钟后取出用无菌滤纸吸去多余菌液。将这些叶片放置到含1mg/l 6BA的MS固体培养基上于25℃下暗培养两天，然后转移到含有500mg/l羧苄青霉素和25mg/l潮霉素的固体MS培养基上，于25℃下按14小时白天，14小时黑夜的光周期培养。约3周以后，将生长至1厘米以上的小苗转移到含有500mg/l羧苄青霉素和15mg/l潮霉素的固体MS培养基中诱导生根，约两周后可见根的形成。从而得到完整的再生植株。将生长至5厘米左右的完整植株从培养瓶中取出，洗去残留的MS培养基，移栽到花盆中在温室中继续生长。取温室中生长的再生烟草叶片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取总DNA。取2μl总DNA，分别用引物1(SEQ ID NO1)和引物2(SEQ ID NO2)，引物7(SEQ ID NO7)和引物8(SEQ ID NO8)，进行PCR反应。结果扩增到1.2kb和0.9kb的分别特异于FLP和Bt基因的片段。取上述提取的总DNA 10μl，用Bt基因片段做探针，用Boehringer Mannheim的非放射性标记和检测试剂盒进行Southern印记检测，证明已经得到所需的转基因植物。实施例8 转基因植株子代中Bt基因的删除将实施例6中所述的含有35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT结构的转基因植株和实施例7中所述的含有35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP结构的转基因植株分别作为父本和母本进行杂交，杂交种子再生得到的子代植株。取温室中生长的子代植株烟草叶片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取总DNA。取2μl总DNA，分别用引物1(SEQ ID NO1)和引物2(SEQ ID NO2)，引物3(SEQID NO3)和引物4(SEQ ID NO4)，引物5(SEQ ID NO5)和引物6(SEQ ID NO6)，进行PCR反应。结果扩增到1.2kb，1.0kb，0.4kb的分别特异于FLP，Cre和bar基因的片段。取上述提取的总DNA，分别用Cre基因和FLP基因片段做探针，用Boehringer Mannheim的非放射性标记和检测试剂盒进行Southern印记检测，证明已经得到所需的杂交子代植株。取上述温室中生长的烟草叶片提取总RNA取总RNA10ug，分别用Cre和FLP基因片段做探针用BoehringerMannheim的非放射性标记和检测试剂盒进行Northern印记分析，证明两种重组酶在子代植株中具有组成型转录活性。通过设计不同的PCR引物组合，可以证明Cre/loxP和FLP/FRT系统都在子代杂交植株中发挥作用，两个loxP或两个FRT之间的35S/Bt基因结构已经被删除掉。
表1 酵母YEPD培养基成分 每升含量(克)酵母提取物 5.0蛋白胨 10.0葡萄糖 10.0琼脂(固体培养基用) 10.0表2 农杆菌YEB培养基成分 每升含量(克)牛肉膏提取物5.0酵母提取物 1.0蛋白胨 5.0蔗糖5.0MgSO4.7H2O0.5琼脂(固体培养基用) 10表3 烟草组织培养用MS培养基成分 每升含量(分化培养基)10x MS大量元素母液 100ml100xMS微量元素母液 10ml100x铁盐母液10ml100x维生素母液 10ml1mg/ml 6-苄基腺嘌呤1.0ml1mg/ml 萘乙酸 0.1ml琼脂9克PH5.8(生根培养基)10x MS大量元素母液 100ml100xMS微量元素母液 10ml100x铁盐母液10ml100x维生素母液 10ml琼脂9克PH5.8
此专利涉及的两个菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠杆菌(E.coli DH5α)，保藏代号分别为pBFC、pBLF，保藏编号分别为CGMCC NO.0430、CGMCC NO.0431，保藏日期为1999年12月14日。
(1) 一般信息(I) 申请人林忠平(II) 发明名称采用两套重组系统删除特定外源基因的方法(III)序列数11(IV) 通讯地址(1)联系人林忠平(2)街道海淀区颐和园路5号(3)城市北京(4)国家中华人民共和国(5)邮政编码100871(V) 计算机可读形式(1)介体类型3.5英寸软盘(2)计算机IBM Pentium II(3)操作系统Windows 98(4)软件Word 97(VI) 电讯信息(1)电话86-10-62753062(2)传真86-10-62751843(2)SEQ ID NO1的信息(I) 序列特征(1)长度28个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列GAG AAG ATC TAA GCA TGC CAC AAT TTG G(3)SEQ ID NO2的信息(I) 序列特征(1)长度27个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II) 分子类型DNA(IV)序列GAG GTC ACC GCG TAC TTA TAT GCG TCT(4)SEQ ID NO3的信息(I) 序列特征
(1)长度26个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列AAA TGT CCA ATT TAC TGA CCG TAC AC(5)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(1)长度20个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列GGC TAA TCG CCA TCT TCC AG(6)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(1)长度24个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA(7)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(1)长度22个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列CTG AAG TCC AGC TGC CAG AAA C(8)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(1)长度21个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列TGC TTG AGT AAC CCA GAA GTT(9)SEQ ID NO8的信息
(I)序列特征(1)长度21个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列GCT GAA TCC AAC TGG AGA GGC(10)SEQ ID NO9的信息(I)序列特征(1)长度16个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列AGC TCG AAG GGG TTC G(11)SEQ ID NO10的信息(I)序列特征(1)长度12个碱基(2)类型核酸(3)链型单链(4)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列CGA ACC CCT TCG
权利要求
1.获得能在杂交后代中特异地删除外源基因的转基因植物的制备方法。包括从以下两个不同的重组DNA序列稳定地转化植物细胞。其中所述的第一个重组DNA序列包括两端接有第一种能被特异性识别和剪接序列的编码一种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第一个重组DNA序列还包括编码能识别第二个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列。其中所述的第二个重组DNA序列包括两端接有第二种能被特异性识别和剪接序列的编码与第一个重组DNA序列中相同或者不同种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第二个重组DNA序列还包括编码能识别第一个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列。并由此植物细胞再生得到的完整植株。
2.根据权利要求1的方法。其中所说的第一个重组DNA序列中的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白质编码序列，并且还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列以及下游3’端的终止子序列。
3.根据权利要求2的方法。其中所说的第二种位点特异性重组酶选自于包含Cre，FLP，R编码的位点特异性重组酶中的一种。
4.根据权利要求2的方法。其中所说的第二种位点特异性重组酶的编码序列上游的启动子序列包括但并不仅限于35S启动子序列。
5.根据权利要求1的方法。其中所说的第一种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列选自于包含能分别被Cre，FLP，R所识别并剪接的特异性DNA序列中的一种。它们分别为loxP，FRT和Rs。
6.根据权利要求5的方法。其中所说的第一种能被特异性识别和剪接的核苷酸序列不能被第一个重组DNA序列中编码的第二种位点特异性重组酶所识别并剪接。
7.根据权利要求1的方法。其中所说的一种能改善植物某种形状的蛋白质可以是一种与抗虫，抗除草剂或者可以抵抗各种不良环境等有关的的蛋白质。包括但并不仅限于来源于苏云金杆菌的Bt抗虫基因。
8.根据权利要求7的方法。其中所说的一种能改善植物某种形状的蛋白质的核苷酸序列不但包括该蛋白质的编码序列，还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列和一些起表达调控功能的序列，以及下游3’端非编码区的表达调控元件。
9.根据权利要求8的方法。其中所说的启动子序列包括但并不仅限于35S启动子序列，所说的起表达调控功能的序列包括但并不仅限于Ω序列和Kozark序列。
10.根据权利要求1的方法。其中所说的第二个重组DNA序列中的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白质编码序列，并且还包括其编码序列上游5’端非编码区的启动子序列以及下游3’端的终止子序列。
全文摘要
本发明提供一种利用两套位点特异性重组系统的协同作用获得能在后代中特异地删除外源基因的转基因植物的制备方法。包括，从以下两个不同的重组DNA序列稳定地转化植物细胞并由此再生得到的完整植株。其中所述的第一个重组DNA序列包括两端接有第一种能被特异性识别和剪接序列的编码一种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第一个重组DNA序列还包括编码能识别第二个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第二种位点特异性重组酶的核苷酸序列。其中所述的第二个重组DNA序列包括两端接有第二种能被特异性识别和剪接序列的编码与第一个重组DNA序列中相同或者不同种能改善植物某种性状的蛋白质的核苷酸序列，而且所述的第二个重组DNA序列还包括编码能识别第一个重组DNA序列中能被特异性识别和剪接的第一种位点特异性重组酶的核苷酸序列。
文档编号C12N15/82GK1392260SQ0211969
公开日2003年1月22日 申请日期2002年5月16日 优先权日2002年5月16日
发明者林忠平, 陈杨坚, 倪挺, 胡鸢雷, 丁伟, 高音 申请人:林忠平