专利名称：一种重组人纤溶酶原Kringle5突变体蛋白rhPK－5的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人纤溶酶原Kringle 5(rhPK-5)突变体的生产工艺。该工艺是利用基因工程技术构建rhPK-5突变体的原核表达载体和克隆载体、利用微生物发酵技术获得rhPK-5突变体的高效表达、利用蛋白质工程技术获得rhPK-5突变体纯品蛋白、利用鸡胚绒毛尿囊膜实验证实其具有野生活性，从而实现了用原核表达体系获得真核突变基因产物的一种新方法，应用该工艺可以大量制备rhPK-5突变体蛋白，经证实该突变体蛋白具有血管新生抑制的野生活性。
背景技术：
人类纤维蛋白溶解酶原(human Plasminogen，hPgn)是由氨基酸构成基本相同的五个Kringle环状结构域组成，每一个结构域均由约80个氨基酸组成，hPK-5因子是纤溶酶原的第五个结构域。1994年，O’Reilly(O’Reilly M.S.和Holmgren L.，Cell，1994S1，79(2)315-328)从荷瘤鼠血清和尿中提取出Angiostatin(hPK1-4)，可特异性地抑制血管内皮细胞增生的一种内生性蛋白。研究表明，hPK-5因子具有抑制内皮细胞增生的生物学活性，而且其抑制活性强于Angiostatin[Cao Y.和Ji R.W.，J.Biol.Chem.，1996，27129461-29467，Cao Y.和Chen A.，J.Biol.Chem.，1997，27222924-22928，以及O’Reilly M.S.和Holmgren L.，Cell，1994 S1，79(2)315-328]；hPK-5因子还具有抑制内皮细胞迁移的生物学活性(Ji W-R.和Barrientos L.G.，Biochem.Biophys.Rrs.Comm.，1998，247414-419以及Lu H.和Dhanabal M.，Biochem.Biophys.Rrs.Comm.，1999，285668-673)。正是由于hPK-5因子具有高活性、细胞型选择性、短氨基酸序列等特点，该因子一直被视为一种潜在的新生血管性疾病的治疗药物[Cao Y.和Chen A.，J.Biol.Chem.，1997，27222924-22928，以及Ji W-R.，和Barrientos L.G.，Biochem.Biophys.Rrs.Comm.，1998，247414-419]，特别是随着美国对新生血管抑制剂-Endostatin的成功开发，更使该因子的研究越显重要。
血管形成即形成新血管的过程，它是包括生殖、发育和伤口修复在内的正常机体活性所必需的。尽管没有完全了解该过程，但它可能包括调节内皮细胞(毛细血管的初级细胞)生长的分子复杂的相互作用。在正常条件下，这些分子似乎将微脉管系统保持在静止状态(即没有任何毛细血管生长)，其保持时间可以持续长达数周，在某些情况下长达数年。必要时(如在伤口修复期间)，这些分子可以在5天内经历快速增殖和转换(Folkman，J.和Shing，Y.The Journal of Biological Chemistry，267(16)10931-10934，以及Folkman，J.和Klagsbrum，M.，Science，1987(135)442-447)。
尽管血管生成在正常情况下为高度受调节的过程，但持久的非调节血管生成会引起许多疾病(以血管生成为主要特征)。另有报道，非调节的血管生成可以引起特定的疾病，也可以使现有的病情恶化。临床研究结果证实，糖尿病等患者眼盲的最常见原因是眼部新生血管的生成，该病因控制着大约20种眼病的发生。在关节炎的发展中，新生毛细血管侵入关节并破坏软骨将使病情恶化。
目前，正在开发用于治疗血管生成疾病的几种血管生成抑制剂(Gasparini，G.和Harris，A.L.，Clin，Oncol.，1995，13(3)765-782)，但这些化合物有一些相关的缺点，例如，苏拉明是一种有效的抑制剂。但在抗肿瘤活性所需的剂量下引起人严重的系统性毒性；Retinoid、干扰素和抗雌激素之类的化合物对于人类使用是安全的，但具有弱抗血管生成作用；其他的化合物可能难以制备或制备的成本较高。
从血管生成抑制剂研究现状来看，开发高活性、低毒性(高安全性)的血管生成抑制剂是目前临床治疗血管增生类疾病所急需的一类药物。
本发明所述的重组人纤溶酶原Kringle 5突变体蛋白(rhPK-5)是通过选择性地抑制新生血管内皮细胞的增殖，同时对正常机体细胞无或者低毒性，对病理状态表现出选择性毒性，而且该化合物容易大量制备，为其临床应用奠定了基础。
发明内容
在本发明的设施方案中，提供了rhPK-5的基因序列、氨基酸序列，构建其表达载体的方法，获得表达rhPK-5的工程菌株制备方法及其高效表达条件的优化，rhPK-5的分离方法、纯化方法、复性方法以及测定其抑制血管新生的实验方法。
本文所述Kringle 5是指哺乳动物血浆中纤维蛋白溶解酶原(简称纤溶酶原，Plasminogen)的第五个环状结构域，其空间结构象一种丹麦的蛋糕Kringle，所以该蛋白被称为Kringle 5(图3)。本发明利用基因工程重组技术制备的该蛋白因子，维持Kringle的空间构象的是位于Cys460-Cys510、Cys482-Cys523、Cys511-Cys535的三个二硫键(图4)。
本发明所述rhPK-5是以人体血浆中纤溶酶原的基因序列为模板，经过多种方式的基因改造后，在原核细胞(大肠杆菌等)中表达、制备的以图1所示序列为基础的蛋白，如实施例1所述。
本发明所述的rhPK-5表达载体是指将rhPK-5基因或经过改造后的基因克隆于pBV220等表达载体后获得的重组质粒表达载体。
本发明所述的工程细胞株是指利用氯化钙转化法等方法将rhPK-5表达载体转入原核细胞(如大肠杆菌)体内获得的体内含有rhPK-5表达载体的原核细胞株，该原核细胞株在特定的条件下可以表达出rhPK-5蛋白或突变蛋白。
本发明所述的表达条件是指工程细胞株表达rhPK-5蛋白或突变蛋白的优化外部条件，包括工程细胞培养条件(pH、溶解氧、培养时间等)、工程细胞诱导条件(诱导温度、诱导持续时间等)。
本发明所述的突变体制备工艺是指将rhPK-5蛋白或突变蛋白从获得rhPK-5蛋白或突变蛋白表达后的工程细胞株中分离、纯化的制备工艺，具体包括工程细胞株的破碎、杂质蛋白的去除、rhPK-5蛋白或突变蛋白的分离以及纯化。
本发明所述的抑制血管新生的生物学活性测定是指以本发明工艺制备的rhPK-5蛋白或突变蛋白为实验材料，用鸡胚绒毛尿囊膜实验等测定本发明工艺制备的rhPK-5蛋白或突变蛋白的抑制血管新生的生物学活性。
实施例1pBV220/hPK-5重组质粒表达载体的制备PCR引物设计根据图2所示的hPK-5因子的基因序列，设计如下引物引物1为5′-GCGAATTCCATGGACTGTATGTTT GGG-3′，引物2为5′-GCGGATCCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCACACTGAGGGAC-3′。其中，GAATTC和GGAT CC为限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点；ATG为起始密码子；TAATAG为终止密码子；GTGGTGGTGGT GGTGGTG4为6个组氨酸序列；5′GC为保护序列；GACTGTAT GTTTGGG和GGC ACACTGAGGGAC为外源基因序列。
PCR扩增hPK-5因子基因反应体系为hPK-5 DNA模板5ul，4×dNTPs 2ul，引物1 1ul，引物2 1ul，10×Buffer 2ul，Taq酶1ul，dH2O 8ul；反应条件为95℃ 10min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环后72℃、1min。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析(图5)。
hPK-5基因EcoRI/BamHI双酶切反应体系酶切底物5ul，10×Buffer 2ul，BSA 0.5ul，dH2O 11.5ul，EcoRI 1ul。混匀，略离心，置37℃水浴2h，无水乙醇沉淀1h，1,2000r/min离心5min，弃上清，蒸发残余乙醇，再加入10×Buffer 2ul，BSA 0.5ul，dH2O 11.5ul，BamHI 1ul，混匀，略离心，置37℃水浴2h，酶切反应产物全部进行2％琼脂糖凝胶(低溶点)电泳。
酶切片段的挖块回收与纯化质粒pBV220用EcoRI/BamHI双酶切形成开环pBV220、软胶回收基因片段，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，(图6)。
hPK-5基因酶切片段与开环pBV220的连接反应体系为10×T4连接Buffer 5ul，pBV220开环2ul，hPK-5酶切基因片段1ul，T4DNA连接酶1ul，dH2O 6ul，混匀后略离心，4℃过夜。
软胶回收重组质粒基因片段将回收获取的重组质粒基因片段命名为pBV220/hPK-5(图7)。
实施例2制备多种原核细胞株的感受态细胞，以大肠杆菌的一种菌株JM109为例。
将JM109菌株在琼脂培养基平板上划线，37℃、230r/min过夜；从平板中取出1个2-3mm大小的单菌落移至含50ml LB培养液的试管中，37℃、230rpm、3h至OD600＝0.2-0.4(对数生长期)；置冰上20min，转入离心管中，4000r/min离心10min；弃上清，倒置离心管1min流尽剩余液体，然后加入10ml用冰预冷的0.1MCaCl2致敏液悬浮细胞，冰上15min；4000r/min离心10min，回收细胞，弃上清，倒置1min；2ml冰上预冷的0.1M CaCl2悬浮细胞；按照200ul/Eppendorf分装；每管加入80％的甘油29ul至终浓度10％，标注，置-70℃冻存；若在24h内转化pBV220/hPK-5可以留出2管置于4℃冰箱中保存。
实施例3将表达质粒载体pBV220/hPK-5转化上述制备的感受态细胞株取JM109感受态菌各两管，其中一管加重组质粒(1μg/μL)1μL，另管加空质粒pBV220(2μg/μL)1μL作对照，轻轻指弹，使之混匀，在冰浴上放置30min；42℃水浴静置90s；每管加LB培养基800μL，混匀，37℃水浴放置1h；将各管分别取200μL，平铺于含氨苄青霉素(60μg/mL)LB琼脂板表面，平放置20min后，倒置培养12h以上，待菌落形成后取出，4℃保存。
实施例4培养、诱导工程细胞株，表达重组hPK-5蛋白或重组hPK-5突变体蛋白。
用接种环从含有hPK-5因子表达载体的工程菌JM109的LB培养板上挑取单菌落，接种于含有Amp(100mg/L)的5mL LB培养基的试管中，在37℃摇床上，以230r/min振荡过夜；以1∶50的比例将上述菌分别转入含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，30℃培养4小时，升高培养温度至42℃，继续培养4小时；取培养液离心后用STE洗涤，1mL TE重悬，取20μL，加等体积2×上样缓冲液(100mmol/L Tris-Cl，200mmol/L DTT，4％ SDS，0.2％溴酚兰，20％甘油，pH6.8)混匀，沸水浴中煮沸3min，上样20μL，进行15％ SDS-PAGE电泳(图8)(电泳缓冲液25mmol/LTris-Cl，250mmol/L甘氨酸，0.1％ SDS，pH8.3)。电泳条件110V，约6h，加冷水循环。
实施例5表达产物的免疫学鉴定按文献(J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，金冬雁黎孟枫译，分子克隆实验指南[M]，北京科学出版社，1999，第二版681-683)所示安装转膜装置(转移缓冲液25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇)，转膜条件9mA，1-2h；去离子水洗膜2次，每次10min；将硝酸纤维素膜放在平皿中，加封闭液(10mmol/L Tris-Cl，100mmol/L NaCl，pH8.0，5％脱脂奶粉)浸膜，室温摇荡2h；与第一抗体结合多克隆第一抗体(His-Tag Monoclonal Antibody，购于美国Novagen公司)按1∶1000的比例稀释，按每平方厘米加0.1mL比例加入一抗液体，室温摇荡2h；洗涤用TBST(10mmol/L Tris-Cl，100mmol/L NaCl，pH8.0，0.1％ Tween-20)洗3次，每次10min；与第二抗体结合将膜转入第二抗体(山羊抗小鼠Ig-G-Ap，购于宝生物工程(大连)有限公司)溶液(1∶200倍比稀释第二抗体于封闭液)中，4℃摇荡5h，取出后，用TBST洗3次，每次10min；碱性磷酸酶显色取0.5g NBT(氮蓝四唑nitroblue terazolium)溶于10ml 70％的二甲基甲酰胺中，取0.5g BCIP(5’-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate)溶于10ml 70％的二甲基甲酰胺中，于10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mM NaCl、5mM MgCl2、100mM Tris·Cl)中加入BCIP 4ul、NBT 4ul，待条带达所需深度时，立刻用水洗膜，(图9)。
实施例6采用超声法进行细胞破碎细胞培养液在4℃，12,000r/min×20min离心弃上清；菌体沉淀以1∶10比例重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)中，冰浴超声破菌，250W，3秒/次，间隔3秒，超声200次。
实施例7从总蛋白中分离rhPK-5蛋白或其突变体蛋白细胞培养液在4℃，12,000r/min×20min离心弃上清；菌体沉淀以1∶10比例重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)中，冰浴超声破菌，250W，3秒/次，间隔3秒，超声200次。
用微量离心机于4℃，12,000r/min×20min离心；将包涵体沉淀重悬于9倍体积含0.5％Triton X-100和10mM EDTA(pH8.0)的裂解缓冲液中，室温静止5min；用微量离心机10000r/min×20min离心；重复二次，制备包涵体沉淀用于以下实验。沉淀样品取一支依次加入5M的尿素溶液各1ml，悬浮、静止10min；4℃，10,000r/min×15min离心，重复1-3次。
上步包涵体沉淀样品加入1-3％的脱氧胆酸钠溶液各1ml，悬浮、静止10min；4℃，10,000r/min×15min，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品，(图10)。
实施例8用组氨酸亲和层析法对目的蛋白进行纯化使用该制备技术获得的rhPK-5蛋白或突变体蛋白在其氨基酸序列的羧基端有3-10个组氨酸组成的氨基酸链。根据此特征可以采用组氨酸亲和层析法对目的蛋白进行纯化。His-tag colum(280nm监测，液体流速均为0.5ml/min)用Buffer A(1M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、pH8.0)平衡至基线平稳后，将包涵体溶解上清直接上样，蛋白浓度约1mg/ml，上样体积为1ml/次；用Buffer B(1M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、pH6.3)洗脱非特异结合蛋白，直至基线再次平稳；用Buffer C(1M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、pH5.9)洗脱结合在Ni2+上的rhPK-5因子，分部收集洗脱峰；用Buffer D(Buffer C、250mM咪唑)继续洗脱，分部收集洗脱峰；用Buffer E(1M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl、pH4.5)继续洗脱，直至无基线平稳。
实施例9rhPK-5蛋白或突变蛋白抑制血管新生的生物学活性测定参照姜志刚、鄂征(姜志刚，鄂征，解剖学杂志，1989，12142-143)的方法以0.5％甲基纤维素膜制备，实验组分为粗样品组、rhPK-5因子纯品未复性组、rhPK-5因子纯品复性组，设PBS组和包涵体溶解、稀释液组为阴性对照组。鸡胚孵育用0.1％的新洁而灭将新鲜鸡胚清洗后，将鸡蛋放入38-40℃、60％相对湿度的孵箱内常规孵育，气室朝上，鸡蛋长轴与蛋托呈80度角。每天翻蛋2-3次。至第7天，选择成活的鸡胚，在尿囊膜两条主要的血管交叉点而又离胚体有一定距离处确定开窗位置。开窗先在气室顶端开一个小孔减压，然后在确定的位置消毒后开一约0.5×0.5cm的小窗，小心掀起壳膜，暴露其下方的尿囊膜及其血管。施加测试物将已制备的甲基纤维素膜置于测试区，用透明胶带封闭小窗。继续孵育至10天。每个剂量组至少保证成活8只鸡胚。取膜及拍照加测试膜后第3天，去掉CAM平面以上的卵壳膜，加入1∶1的甲醇/丙酮固定液1.5ml/只，室温固定15min后，待血液凝固剪下尿囊膜，放入水中展开。将尿囊膜铺在玻璃板上，上面再用另一玻璃板压平，在解剖显微镜下观察并拍照。结果观察用解剖显微镜观察、计数与载体盘边缘接触的总、大、中、小血管数目，根据管径将血管分为三类(王蕾，张树成，吴志奎，等，中国药理与临床，2000，16(6)46-47)①＞0.1mm为大血管；0.1mm＞①＞0.05mm为中血管；①＜0.05mm为小血管。从主干分枝出的血管称为一级血管，自一级再分枝为二级血管，依次类推为三级、四级……，记录血管分级状况。以被检物膜为中心，周围血管放射状朝向被检物的生长状态称为血管辐辏；主干血管向载物膜的弯曲和靠近称之为血管的吸引。观察载物膜周围1cm范围内与远离(大于1cm)位置的血管密度，计数出现血管增生或抑制的鸡胚数目，数据进行方差分析(表1)、(表2)、(图11)。
表1 rhPK-5对一级血管，二级血管数的抑制作用组别N一级血管数 二级血管数PBS 82.46±0.23 11.78±3.56包涵体溶解、稀释液组82.51±0.68 10.69±4.27rhPK-5粗品 25 2.09±0.47 12.76±4.58rhPK-5纯品 30 1.15±0.24* 7.21±2.53**P＜0.05以药物载体膜为中心，计数与其边缘相接的一级、二级血管数，进行比较发现rhPK-5粗品组与对照组(PBS组、包涵体溶解稀释液组)比较无显著性差异，rhPK-5纯品组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。说明复性后的rhPK-5因子抑制血管新生的效果显著。
表2 rhPK-5对大、中、小血管数抑制作用组别 N 大血管中血管小血管PBS 8 5.80±2.205.50±2.1881.00±11.56包涵体溶解、稀释液组 8 5.63±2.315.38±2.5479.26±10.89hPK-5粗品 254.95±3.244.14±3.2668.81±12.53hPK-5纯品 305.61±1.102.02±1.35* 38.68±10.52**P＜0.05对照组中、小血管数明显较多，与实验组(rhPK-5纯品组)比较有显著性差异，而大血管数无显著性差异，说明rhPK-5因子主要抑制中、小血管的发生，rhPK-5粗品组与对照组比较无统计学意义。
实施例10rhPK-5突变体蛋白的制备以图1所示的Kringle 5为基本系列，按实施例1的实验方法，可在其氨基端设计有任意氨基酸系列的A，或在羧基端设计有任意氨基酸系列的B，以图12所示的氨基酸序列(1)、图13所示的碱基序列为例(2)，构建rhPK-5突变体蛋白。
(1)A-Kringle 5-B-H1(2)C-Kringle 5-D-H2式(1)中Kringle 5是指图1所示的氨基酸序列；A和B均为0-20个任意序列的氨基酸序列；H1为3-10个组氨酸组成的氨基酸链。A可以不存在，B可以不存在，或A和B均不存在，或A和B均存在。
式(2)中Kringle 5是指图1所示的碱基序列；C和D均为0-60个分别编码A和B的碱基序列；H2为编码连续3-10个组氨酸链的硷基序列。C可以不存在，D可以不存在，或C和D均不存在，或A和B均存在。本实施例中A与B序列相同，C与D序列相同，在突变体蛋白的羧基端设计有6个组氨酸链，方案如下PCR引物设计根据图12所示的hPK-5因子的基因序列，设计如下引物引物1为5′-GCGAATTCCATGACCGGTCATGC TAGCG-3′，引物2为5′-GCGGATCCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTTGAGCTAGCGAAGC-3′。其中，GAATTC和GGATCC为限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点；ATG为起始密码子；TAATAG为终止密码子；GTGGTGGTGGT GGTGGTG4为6个组氨酸序列；5′GC为保护序列；GACTGTAT GTTTGGG和GGC ACACTGAGGGAC为外源基因序列。
PCR扩增hPK-5因子突变体基因反应体系为纤溶酶原DNA模板(或含有Kringle 5 DNA序列的其它基因序列)5ul，4×dNTPs2ul，引物1 1ul，引物2 1ul，10×Buffer 2ul，Taq酶1ul，dH2O 8ul；反应条件为95℃ 10min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环后72℃、1min。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
hPK-5基因EcoRI/BamHI双酶切反应体系酶切底物5ul，10×Buffer 2ul，BSA 0.5ul，dH2O 11.5ul，EcoRI 1ul。混匀，略离心，置37℃水浴2h，无水乙醇沉淀1h，1,2000r/min离心5min，弃上清，蒸发残余乙醇，再加入10×Buffer 2ul，BSA 0.5ul，dH2O 11.5ul，BamHI 1ul，混匀，略离心，置37℃水浴2h，酶切反应产物全部进行2％琼脂糖凝胶(低溶点)电泳。
酶切片段的挖块回收与纯化质粒pBV220用EcoRI/BamHI双酶切形成开环pBV220、软胶回收基因片段，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。
hPK-5基因酶切片段与开环pBV220的连接反应体系为10×T4连接Buffer 5ul，pBV220开环2ul，hPK-5酶切基因片段1ul，T4DNA连接酶1ul，dH2O 6ul，混匀后略离心，4℃过夜。
软胶回收重组质粒基因片段将回收获取的重组质粒基因片段命名为pBV220/hPK-5突变体表达质粒。
获得表达rhPK-5突变体蛋白的工程细胞株如实施例2所述，获得rhPK-5突变体蛋白的方法如实施例3、4、5、6、7、8所述，部分实验方法可以根据rhPK-5突变体蛋白的特征有所改进。
发明效果本发明的优点在于确立了一种比较简便的能大量制备有生物活性的重组人纤溶酶原Kringle 5(rhPK-5)及其突变体的制备工艺，它是利用基因工程技术在保持Kringle 5天然空间构象的基础上，构建了在原核表达体系、优化了表达条件，建立了目的产物分离、纯化及复性的方法，并证实该方法制备的rhPK-5具有抑制血管新生的活性。
图1 Kringle 5的基本氨基酸序列；图2 编码Kringle 5的基本氨基酸序列的碱基序列；图3 Kringle 5在哺乳动物血浆中纤维蛋白溶解酶原的第五个环状结构域；图4在纤溶酶原氨基酸序列和Kringle氨基酸序列中，位于Cys460-Cys510、Cys482-Cys523、Cys511-Cys535的三个二硫键；图5 PCR扩增hPK-5因子基因后，PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，其中1、2为PCR扩增产物，M为DL-2000分子量标准；图6质粒pBV220经双酶切后片段的挖块回收与纯化，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中，1为pBV220经EcoRI、BamHI双酶切产物，M为DL-2000分子量标准；图7了构建表达重组质粒pBV220/hPK-5的技术路线；图8表达重组质粒pBV220/rhPK-5在JM109表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，其中，M为蛋白质分子量标准，1、6为诱导表达5小时的菌体总蛋白，2、5为诱导表达4小时的菌体总蛋白，3、4为诱导表达前的菌体总蛋白；图9显示重组质粒pBV220/rhPK-5在JM109表达的免疫学鉴定结果，其中，1、3为诱导表达前菌体总蛋白与His-Tag抗体反应的结果，2为诱导表达后菌体总蛋白与His-Tag抗体反应的结果；图10 rhPK-5蛋白或其突变体蛋白纯化过程的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，其中，1、4、7为第一步“超声、裂解缓冲液洗涤两次；第二步5M尿素洗涤两次；第三步3％脱氧胆酸纳洗涤一次”的方法洗涤包涵体结果；2、5、8为采用“超声、裂解缓冲液洗涤两次；第二步5M尿素洗涤三次；第三步3％脱氧胆酸纳洗涤一次”的方法洗涤包涵体结果；3、6、9为采用“第一步超声+裂解缓冲液洗涤一次；第二步3％脱氧胆酸纳洗涤一次；第三步5M尿素洗涤三次”的方法洗涤包涵体结果；图11采用鸡胚绒毛尿囊膜实验测定rhPK-5蛋白或其突变体蛋白抑制血管新生的生物学活性；其中A为PBS组；B为包涵体溶解、稀释液组；C为rhPK-5粗样品组；D为rhPK-5纯品组；图12 rhPK突变体任意氨基酸序列；图13 rhPK突变体任意氨基酸序列对应的碱基序列。
权利要求
1.一种重组人纤溶酶原Kringle-5(rhPK-5)突变体蛋白的制备方法，其特征是以Kringle-5为基本氨基酸序列构建其突变体，通过组建重组质粒表达载体，转化大肠杆菌获得原核表达细胞株，高效表达rhPK-5突变体，并进行rhPK-5突变体的分离与纯化。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的突变体具有式(1)特征的氨基酸序列或具有式(2)特征的碱基序列A-Kringle-5-B-H1(1)C-Kringle-5-D-H2(2)式(1)中Kringle-5是指含有82个氨基酸的基本氨基酸序列；A、B均为0-20个任意序列的氨基酸序列；H1为3-10个组氨酸组成的氨基酸链；A可以不存在，B可以不存在，或A和B均不存在，或A和B均存在；式(2)中Kringle-5是指含有246个碱基的基本碱基序列；C和D均为0-60个分别编码A和B的碱基序列；H2为编码连续3-10个组氨酸链的碱基序列；C可以不存在，D可以不存在，或C和D均不存在，或C和D均存在；通过PCR反应，获得hPK-5因子突变体基因。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是将hPK-5突变体基因通过合适的酶切位点如EcoRI和BamHI与原核质粒表达载体如pBV220连接，获得rhPK-5重组质粒表达载体。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是rhPK-5突变体原核表达细胞株的获得，是将rhPK-5重组质粒表达载体转化原核细胞如大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是将rhPK-5突变体原核表达细胞株进行培养并经温控诱导，获得rhPK-5突变体蛋白的高效表达。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是采用超声破菌，裂解，尿素及脱氧胆酸钠洗涤包涵体，再用组氨酸亲和层析进行rhPK-5突变体蛋白的纯化。
全文摘要
本发明涉及一种重组人纤溶酶原Kringle 5(rhPK－5)及其突变体的制备工艺，该工艺是利用基因工程技术和蛋白质工程技术对rhPK－5的基因进行设计，构建原核表达载体pBV220/rhPK－5，然后分别转化四种大肠杆菌后获得表达，优化了rhPK－5高效表达条件，建立了rhPK－5包涵体分离、纯化、蛋白复性的技术体系，建立了一条体外获得大量rhPK－5的新途径，并证明所制备的rhPK－5具有血管新生抑制的生物活性。
文档编号C12N7/00GK1420126SQ0212392
公开日2003年5月28日 申请日期2002年7月10日 优先权日2002年7月10日
发明者牛勃, 陈显久, 杨椅, 杨涛, 常冰梅, 张东昌, 李乐工, 韩锐, 阎占清, 郭勇 申请人:牛勃