专利名称：有效检测双链核酸的方法
技术领域：
本发明涉及检测核酸的方法，这种方法可通过使用嵌入剂以高灵敏度检测双链核酸。
背景技术：
检测通过聚合酶链式反应(PCR)等核酸扩增反应而获得的扩增产物，最通用的方法是将扩增后的溶液进行琼脂糖凝胶电泳并与溴化乙啶等荧光嵌入剂结合，然后观察特征荧光。如果没有可能被其它DNA污染，只是希望了解是否产生了扩增产物时，则可省略电泳步骤，向扩增反应后的溶液中加入荧光嵌入剂来观测荧光。然而荧光嵌入剂也与引物等单链DNA结合而发出荧光。检测到的荧光信号中可能包含显著性水平的背景干扰。
最近，本发明作者成功开发了新的核酸扩增方法-环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法(Notomi，T.等.，Nucleic Acids Res.28(12)，e63(2000)，WO00/28082)，它无需PCR方法中不可避免的复杂的温度控制。在LMAP方法中，模板多核苷酸的3’末端区自退火，互补链的合成于此开始，同时使用退火的引物与上述合成中形成的环组合。由此能够在等温条件下进行扩增反应，显著提高了核酸扩增的简便性。
使用荧光嵌入剂对核酸扩增产物进行实时监测的过程中，PCR方法中，伴随温度循环，核酸扩增产物由于热变性而反复解离和再聚合，荧光强度也随之会有显著的变化。而在LAMP方法中，由于在等温条件下进行反应，因而荧光强度并不变化。因而LAMP方法更适合核酸扩增产物的实时监测。只是在LAMP方法中所需的引物为PCR方法中约10倍的量。当用荧光嵌入剂检测由LAMP方法获得的核酸扩增产物时，由同样存在的单链引物引起的背景干扰水平增高。因此难以以高灵敏度只检测扩增的双链核酸。
本发明的目的在于提供检测核酸的方法，所述方法通过降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号，能够高灵敏度地使用嵌入剂检测双链核酸。
为了达到上述目的，本发明人进行了深入的研究。结果，通过向含有均与嵌入剂结合的双链核酸和单链核酸的混合物中加入与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物、或者与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物，成功地降低了来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。从而完成了本发明。
更具体地说，本发明涉及降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法，该方法通过将与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物加入到含有均与嵌入剂(例如溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)结合的双链和单链核酸的混合物中，由此降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于与双链核酸上结合的嵌入剂的化合物的例子有氧化剂如次氯酸钠、过氧化氢或高锰酸钾，还原剂如硼氢化钠或氰基硼氢钠。
本发明还涉及降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法，该方法通过将与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物加入到含有均与嵌入剂(例如溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)结合的双链和单链核酸的混合物中，由此降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物的例子有与上述嵌入剂不同的第二嵌入剂(例如亚甲基蓝、放线菌素D、SYBR Green II或OliGreen)。
本发明进一步涉及检测核酸扩增产物的方法，该方法包含下述步骤(a)通过核酸扩增反应来扩增核酸；(b)向核酸扩增反应后的反应溶液中加入嵌入剂；(c)采用上述任一种方法降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号；(d)测定反应溶液的荧光强度。
本发明还涉及检测核酸扩增产物的方法，该方法包含下述步骤(a)在嵌入剂存在下，通过核酸扩增反应来扩增核酸；(b)采用上述的任一种方法，降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号；以及(c)测定反应溶液的荧光强度。
本发明进一步涉及检测核酸扩增产物的方法，该方法包含下述步骤(a)在嵌入剂和与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物存在下，通过核酸扩增反应扩增核酸；以及(b)测定反应溶液的荧光强度。
上述核酸扩增反应可以通过以下步骤进行(a)从目标区3’末端向该多核苷酸链3’末端依次选取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c；从目标区5’末端向该多核苷酸链5’的末端依次选取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3；(b)制备下述引物包含与F2c互补的序列F2和在F2的5’侧与F1c相同的序列的引物；包含与F3c互补的序列F3的引物；包含与R2相同的序列和在该序列的5’侧与R1互补的序列R1c的引物；包含与R3相同的序列的引物；(c)在链置换型聚合酶和上述引物存在下，以上述核苷酸链为模板合成DNA。
上述核酸扩增反应可通过以下步骤实施(a)从目标区3’末端向该多核苷酸链3’末端依次选取第1任意序列F1c和第2任意序列F2c；从目标区5’末端向该多核苷酸链的5’末端依次选取第3任意序列R1和第4任意序列R2；(b)制备下述引物包含与F2c互补的序列F2和在F2的5’侧与F1c相同的序列的引物；包含与R2相同的序列和在该序列的5’侧与R1互补的序列R1c的引物；(c)在链置换型聚合酶、上述引物和解链温度调节剂(例如甜菜碱或三甲胺N-氧化物)存在下，以上述核苷酸链为扩增模板合成DNA。
本发明进一步涉及用于检测双链核酸的试剂盒，作为组成，所述试剂盒包含嵌入剂(例如溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1)、与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物和/或与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物。与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物的例子有氧化剂如次氯酸钠、过氧化氢或高锰酸钾；还原剂如硼氢化钠或氰基硼氢钠。与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物有与上述嵌入剂不同的第二嵌入剂(例如亚甲基蓝、放线菌素D、SYBRGreen 2或OliGreen)。
发明的公开以下详细说明本发明。
本发明涉及检测双链核酸的方法，本方法通过向含有均与嵌入剂结合的双链和单链核酸的混合物中添加与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物、或者与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物，降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号，从而可以以高灵敏度检测与双链核酸上结合的嵌入剂的信号。
因此，本方法特别适合在利用单链核酸引物的核酸扩增反应过程中或扩增后，该反应系统中除了扩增的双链核酸外还有显著量引物存在的情况下，选择性地检测扩增产物的场合。
在本发明中，术语“嵌入剂”是指插层剂，它是可插入(嵌入)到通过DNA核苷酸配对形成的相邻平面之间的化合物。术语“信号”是指作为特定物质或条件的标志功能的物质，例如来自核酸上结合的嵌入剂的荧光。
1.核酸扩增反应本发明特别用于检测利用单链核酸引物进行核酸扩增反应时所得的扩增产物(双链核酸)。核酸扩增反应的例子除了聚合酶链反应(PCR)外，还有上述LAMP法、链置换扩增(SDA)法(特公平7-114718号公报)以及基于核酸序列的扩增反应(nucleic acid sequence basedamplification，NASBA)方法(特许第2650159号)。更具体地说，由于在LAMP方法中使用比PCR法更大量的引物，因而扩增反应后残余单链引物的量也多。因此本发明的检测双链核酸的方法非常适合检测由LAMP法得到的扩增产物。
在LAMP方法中，核苷酸序列末端形成环结构进行扩增，在聚合酶作用下从环结构处开始延伸的同时，在环内的区杂交的引物一边通过链置换来延伸核酸链，一边将延伸产物解离成单链。由此生成的单链核酸在其末端具有自我互补区，因此在其末端形成环，并开始新的延伸。实际上LAMP方法是在等温条件下进行的，因此上述反应同时、平行进行。LAMP方法的特征除了在等温条件下进行的链置换型反应之外，还有扩增产物的量非常大。原因之一是LAMP法不包含使聚合酶失活的热变性过程。以下对LAMP法进行说明。
(1)LAMP法首先表示LAMP法的概要(
图1和图2)。在LAMP法中，首先制备作为扩增目标的模板多核苷酸。该模板多核苷酸(DNA或RNA)可以用化学合成的方法，或者依照传统的方法从生物材料如组织或细胞中制备。制备该模板多核苷酸，使扩增目标区两侧(5’侧和3’侧)存在适宜长度的序列(称为“两侧序列”)(图1A)。术语“两侧序列”是指包含从该目标区的5’末端到该多核苷酸链的5’末端的区的序列，以及包含从该目标区3’末端到该多核苷酸链的3’末端的区的序列(图1A中两箭头(←→)所指示的部分)。在目标区的5’侧和3’侧，两侧序列的长度为10-1,000个核苷酸，优选30-500个核苷酸。
从包含目标区和两侧序列的模板多核苷酸链(图1A)上的两侧序列中任意选取预先确定的区。具体地说，从目标区3’末端向该多核苷酸链的3’末端依次选取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c以及第3任意序列F3c(图1B)。同样地，从目标区5’末端向该多核苷酸链的5’末端依次选取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3(图1B)。当选择上述任意序列F1c和上述任意序列R1时，F1c和R1之间的距离可以是0个核苷酸，即两者相邻。另外也可以选择为F1c和R1部分重叠的形式。上述第1-第6区是依照制备的多核苷酸链的序列分别而且任意地选取的。优选选取的各区分别含有5-100个核苷酸，更优选10-50个核苷酸。通过选择核苷酸长度，便于下述引物的退火。
如图2L所示，各任意序列的选取优选使LAMP获得的扩增产物在序列F1c和序列F1、序列R1与序列R1c之间优先开始分子内退火形成末端环结构，而不是分子间退火。例如，为了优先启动分子内退火，在选取任意序列时考虑序列F1c和序列F2c之间的距离、序列R1和序列R1c之间的距离就非常的重要。更具体地说，优选两个序列的位置距离为0-500个核苷酸，优选0-100个核苷酸，最优选10-70个核苷酸。这些数值分别表示不包括序列F1c和F2c及序列R1与R2的核苷酸数。
接着，设计并合成被称为“FA引物”的引物，与F2c退火。术语“FA引物”是指包含与F2c区互补的序列F2和与F1c相同的另一个序列(为了方便，也称为“F1c”)。有关的例子包括具序列F1c的3’末端与F2的5’侧相连结构的引物(图1C)。术语“退火”是指通过沃森-克里克模式的核苷酸配对而形成双链结构的核苷酸链。使FA引物与模板多核苷酸链上的序列F2c退火后，DNA链的合成从FA引物上的F2处开始(图1D)。随后，包含与F3c互补的序列F3的引物(以下可称为“F3引物”)与模板多核苷酸链上的序列F3c退火(图1D)。DNA的链置换型合成从退火后的F3引物处开始(图1E)。当多核苷酸与用来合成互补链的模板杂交产生双链结构时，一边将该多核苷酸从模板上分离，一边从引物处开始合成互补链的反应，这个过程被称为“链置换型DNA合成”。具体例子包括在合成进行时由FA引物合成的链被由上述F3引物合成的链置换这一反应。也可以说是由FA引物合成的模板多核苷酸链的互补链可被从上述F3引物处开始延伸的链以互补链分离的方式置换。
下述(i)和(ii)所示的两种核苷酸链可以通过上述合成反应获得。
(i)包含与模板多核苷酸链上的序列“(3’)F3c-F2c-F1c-目标区-R1-R2-R3(5’)”互补的序列“(5’)F3-F2-F1-目标区-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸链(图1F)。
(ii)通过置换(分离)方式形成的单链的核苷酸链，即包含“(5’)F1c-F2-F1-目标区-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸链，在其5’末端侧具有与F1c相同的序列(图1G)。
上述(ii)的核苷酸链中，F1与F1c是互补的，因此通过F1和F1c之间的链内氢键，两者杂交，形成发夹环(图1G)。F2包含在这个发夹环中。
随后，被称为“RA引物”的引物与上述(ii)的核苷酸链上的序列R2c退火。在上述RA引物中，与序列R1互补的序列R1c的3’侧与序列R2的5’侧连接。DNA链的合成从上述RA引物处开始(图1H)。当由RA引物处开始的延伸DNA的合成达到在F1和F1c之间形成的双链处时，F1c序列被该延伸的DNA以与图1E所示的置换方式相同的方式置换(图1I)。然后，包含与序列R3c互补的序列R3的引物(以下也可称为“R3引物”)与模板多核苷酸链上的R3c退火(图1I)。DNA的链置换型合成就从该退火的R3引物处开始(图2J)。根据上述合成方式，合成下述(iii)和(iv)两种核苷酸链。
(iii)与序列“(5’)F1c-F2-F1-目标区-R1c-R2c-R3c(3’)”互补的核苷酸链“(3’)F1-F2c-F1c-目标区-R1-R2-R3(5’)”(图2K)。
(iv)在其3’末端侧附近有F1，同时在其5’末端侧附近有R1c的核苷酸链“(3’)F1-F2c-F1-目标区-R1-R2-R1c(3’)”(图2L)。
上述(iv)序列通过在3’侧存在的序列F1与F1c之间以及5’侧存在的序列R1和R1c之间的链内氢键形成发夹环(图2L)。
随后，在上述(iv)核苷酸链中，上述FA引物的F2区与3’侧发夹环部分的F2c退火(图2M)。DNA链的合成通过链内氢键，从退火的F1处开始。在图1M中，从F1处开始合成的延伸链通过打开由R1-R2-R1c形成的发夹环而达到5’末端。另一方面，从F2开始的反应合成与“F1c-目标区-R1-R2-R1c”构成的链互补的链。在这种情况下，F1以及从F1开始合成的链“F1-目标区-R1c-R2c-R1”被从F2开始合成的链所置换。这样就得到了以“-目标序列-R1c-R2c-R1”所示的具有单链伸出结构的单链的双链DNA。所述单链伸出结构的部分通过单链伸出结构部分(“R1c-R2c-R1”)的R1c和R1之间形成链内氢键，从而形成发夹环(图2N)。该结构部分通过链内氢键从退火的R1处开始合成DNA链(图2N)。基于上述合成，得到下述(v)和(vi)两种核苷酸链。
(v)序列“(3’)R1-R2-R1c-目标区-F1-F2-F1c-目标区-R1-R2c-R1c-目标区-F1-F2c-F1c-目标区-R1-R2-R1c(5’)”(图2O)。
(vi)在3’末端侧附近有F1c、在5’末端侧附近有R1的序列“(3’)F1c-F2-F1-目标区-R1c-R2c-R1(3’)”(图2P)。
上述(v)与(vi)核苷酸链分别通过链内氢键形成发夹环，其中(v)具有R2c作为环部分，(vi)具有F2和R2c作为环部分。在两个序列中，上述RA引物与形成发夹环的R2c部分退火，即，如(v)和(vi)所述，从该引物处开始DNA合成，进而进行含有目标序列的核苷酸链(与(vi)所示序列互补的链)的合成。该互补链与图2L所示序列相同，因此之后重复图2L至图2P的反应。另一方面，从图1A开始的反应也能进行，因此，通过重复这一系列的合成，多核苷酸链的扩增就得以进行。
上述的扩增反应是用四种引物来进行的，即FA引物、RA引物、F3引物以及R3引物。另外，仅用FA引物和RA引物两种引物而不用F3引物和R3引物也可在等温条件下开始扩增反应。在这两种扩张反应中，在反应系统中需要有甜菜碱或三甲胺N-氧化物(TMANO)等解链温度(Tm)调节剂存在。
(2)反应条件在根据LAMP法的反应中，将下述成分加入到模板单链核酸中(i)四种寡核苷酸(FA、RA、外部引物F3和外部引物R3)；(ii)DNA聚合酶，用于互补链的链置换型合成；以及(iii)作为DNA聚合酶底物的核苷酸。
反应通过温育进行，温育温度可使构成FA或RA的核苷酸序列与互补核苷酸序列之间形成稳定的核苷酸配对，且可保持酶活性。温育温度为50-75℃，优选55-70℃。温育时间为1分钟-10小时，优选5分钟-4小时。
在上面介绍的两种LAMP方法中，所述FA引物和所述RA引物都是指“内部引物”，而所述引物F3和所述引物R3都称为“外部引物”。
从外部引物开始的核苷酸链的合成要在从内部引物开始的核苷酸链合成之后开始。为了满足这个条件，有使内部引物的浓度设定为比外部引物高的方法。更具体地说，可通过设定内部引物的浓度比外部引物的浓度高2-50倍，优选4-25倍。
催化互补链的链置换型合成的聚合酶(也称为“链置换型聚合酶”)包括Bst DNA聚合酶、Bca(exO-)DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段、Vent DNA聚合酶、Vent(ExO-)DNA聚合酶(从VentDNA聚合酶中除去外切核酸酶活性)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(ExO-)DNA聚合酶(从DeepVent DNA聚合酶中除去外切核酸酶活性)、φ29噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)以及KOD DNA聚合酶(toyobo Co.，Ltd.)。
反应是在例如使酶反应有适宜的pH的缓冲剂、保持酶的催化活性或退火所需的盐、酶保护剂以及根据需要添加的解链温度(Tm)调节剂存在下进行的。缓冲剂例如使用从弱碱性到中性范围内具缓冲作用的Tris-HCl。pH根据使用的聚合酶调节。作为盐，可适当添加MgCl2、KCl、NaCl、(NH4)2SO4等，以保持酶的活性和调节核酸的解链温度(Tm)。可使用牛血清白蛋白或糖类作为酶的保护剂。进一步使用甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)、三甲胺N-氧化物(TMANO)、二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺作为解链温度(Tm)调节剂。通过使用解链温度(Tm)调节剂，上述寡核苷酸的退火可以在限定的温度条件下调节。特别是甜菜碱和三甲胺N-氧化物(TMANO)通过其isostabilization作用可有效提高链置换的效率。通过向反应溶液中加入0.2-3.0M，优选0.5-1.5M左右的甜菜碱，可对本发明的核酸扩增反应起促进作用。因为这些解链温度调节剂有降低解链温度的作用，所以，必须考虑其它反应条件如盐浓度和反应温度，依据经验来确定具适当严格性和反应性的条件。
2.降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法下面的方法是降低含有均与嵌入剂结合的双链和单链核酸的混合物中单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法的例子。
(1)添加与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于与双链核酸结合的嵌入剂的化合物的方法(1)-1 氧化剂或还原剂的利用向含有均与嵌入剂结合的双链和单链核酸的混合物中加入与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物。这样能降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物的例子有氧化剂或还原剂。具体地说，向添加嵌入剂进行染色的双链核酸和单链核酸的混合溶液中进一步加入氧化剂或还原剂，在适当的温度下保持适当长的时间。与双链核酸上结合的嵌入剂相比，单链核酸上结合的嵌入剂优先被氧化或还原。这就降低了来自单链核酸上结合的嵌入剂的荧光强度。嵌入剂的例子包括溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1等。氧化剂的例子包括次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢(H2O2)和高锰酸钾(KMnO4)，还原剂的例子包括硼氢化钠(NaBH4)或氰基硼氢钠(NaBH3CN)。
当用这种方法检测核酸扩增产物时，荧光强度的测定通常是向核酸扩增反应后的反应溶液中加入嵌入剂，然后再加入氧化剂或还原剂来进行的。另外也可以向核酸扩增反应之前的反应溶液中加入嵌入剂，在嵌入剂存在下进行扩增反应，在反应后加入氧化剂或还原剂，测定荧光强度。
(1)-2 络合物形成体化合物的利用可以使用与嵌入剂形成络合物的化合物作为与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物。具体地说，向双链和单链核酸的混合溶液中加入嵌入剂和上述络合物形成体化合物，在适当的温度下保持适当长的时间。与双链核酸和嵌入剂之间的结合相比，单链核酸和嵌入剂之间弱的结合优先被该络合物形成反应抑制。这就降低了来自单链上结合的嵌入剂的荧光强度。嵌入剂与络合物形成体化合物组合的例子有亚甲基蓝(嵌入剂)和酸性橙7(络合物形成体化合物)的组合。
当用这种方法检测核酸扩增产物时，荧光强度的测定通常是通过同时或相继向核酸扩增反应后的反应溶液中加入嵌入剂和络合物形成体化合物来进行。另外也可以向核酸扩增之前的反应溶液中加入嵌入剂，扩增在该嵌入剂存在下进行，在反应后加入络合物形成体化合物，测定荧光强度。
利用形成络合物导致的吸收光谱的差别，可以测定吸光度来代替荧光强度。也就是说，由于嵌入剂的吸收光谱与它的络合物的吸收光谱不同，因此可只定量检测没有形成络合物的嵌入剂。
(2)添加与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物向含有均与嵌入剂结合的双链和单链核酸的混合物中加入与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物。这样能降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物的例子有与上述嵌入剂(以下称为“第一嵌入剂”)不同的第二嵌入剂。向因加入第一嵌入剂而染色的单链和双链核酸的混合物中加入与单链核酸的结合强度高于第一嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于第一嵌入剂、与第一嵌入剂不同的第二嵌入剂，在适当的温度下保持适当长的时间。因此，与双链核苷酸上结合的第一嵌入剂相比，单链核酸上结合的第一嵌入剂优先被第二嵌入剂置换。这降低了来自单链核酸上结合的第一嵌入剂的荧光强度。先加入到双链和单链核酸混合物中的第一嵌入剂的例子包括溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1。为了优先置换单链核酸上结合的第一嵌入剂而添加的与第一嵌入剂不同的第二嵌入剂的例子有亚甲基蓝、放线菌素D、SYBR Green II和OliGreen。
通过这种方法检测核酸扩增产物时，荧光强度的测定通常通过向核酸扩增后的反应溶液中加入嵌入剂，接着再加入与该嵌入剂不同的第二嵌入剂，检测荧光强度。另外，也可以向核酸扩增反应之前的反应溶液中加入嵌入剂，在该嵌入剂存在下进行扩增反应，反应后再加入与上述嵌入剂不同的第二嵌入剂，检测荧光强度。其他也可以向核酸扩增反应之前的反应溶液中预先加入上述两种嵌入剂，在这两种嵌入剂存在下进行扩增反应，在反应后检测荧光强度。
3.双链核酸的检测本发明中，双链核酸的检测是在实施上述2的处理后，使用荧光光度计测定与核酸结合的嵌入剂发出的荧光来进行。例如，当检测上述1的反应得到的扩增产物时，以不加入模板DNA的扩增反应系统(对照系统1)或不加入DNA聚合酶的反应系统(对照系统2)作为对照。对上述对照系统以及加入模板DNA和DNA聚合酶的通常的扩增反应系统(测试系统)进行上述2的处理，检查对照系统与测试系统荧光强度的差异。由此通过反应可以确定反应溶液中是否生成扩增产物。更具体地说，当测试系统的荧光强度比对照系统1或2的荧光强度大时，就可以判定在该测试系统中检测到了扩增产物。
可用来测定荧光强度的荧光光度计的例子有ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Applied BiOsystems)。当检测荧光强度时，激发波长和测定波长根据用于核酸染色的嵌入剂的种类适当确定。在本发明中，对扩增反应启动后的反应溶液实施上述2的处理后，并测定其荧光强度随时间的变化。由此可以监测反应产物随反应时间的变化情况。
4.用于检测或监测双链核酸的试剂盒根据上述3的检测或监测核酸扩增产物的方法，可以将所需的试剂进行包装，作为试剂盒提供。具体的例子包括含有以下组成的试剂盒。
(1)嵌入剂(例如溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1和YO-PRO-1)；(2)化合物，其与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂(例如氧化剂如次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢(H2O2)或高锰酸钾(KMnO4)；还原剂如硼氢化钠或氰基硼氢钠)；以及(3)化合物，其与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂(例如与先加入到双链和单链核酸的混合溶液中的嵌入剂不同的第二嵌入剂如亚甲基蓝、放线菌素D、SYBR Green2或OliGreen)。
通过加入如下组成，这种试剂盒也可以用于基于LAMP法的目标核酸的扩增和检测。
(a)当从构成所检测的核酸的目标区的3’末端向该多核苷酸链的3’末端依次选取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c，从目标区的5’末端向该多核苷酸链的5’末端依次选取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3时，包含与上述F2c互补的序列F2和在F2的5’侧与F1c相同的序列的引物、包含与F3c互补的序列F3的引物；包含与R2相同的序列和该序列的5’侧与R1互补的序列R1c的引物；以及包含与上述R3相同的序列的引物；(b)催化互补链的链置换型合成反应的聚合酶；(c)作为互补链合成反应底物的核苷酸。
上述试剂盒中的这些组成可以根据所使用的LAMP方法的实施形式变化。具体地说，包含与任意序列F3c互补的序列F3的引物、包含与任意序列R3相同的序列的引物都可以选择性的从上述组成中去除。这种情况下，优选加入解链温度调节剂(例如甜菜碱或三甲胺N-氧化物)。还可以选择性加入为酶反应提供适宜条件的缓冲液以及检测合成反应产物所需的试剂。根据本发明的优选实施形式，可以将一次反应所需的试剂以分开的状态装入反应容器。
附图简述图1表示LAMP方法扩增的概要。
图2表示LAMP方法扩增的概要。
图3表示当在溴化乙锭存在下进行LAMP反应，然后加入还原剂或氧化剂时各反应溶液的荧光强度。
图4表示当在吖啶橙存在下进行LAMP反应，然后加入还原剂或氧化剂时各反应溶液的荧光强度。
图5表示除加入溴化乙锭外还加入第二嵌入剂进行LAMP反应时各反应溶液的荧光强度。
图6表示向吖啶橙外中加入第二嵌入剂进行LAMP反应时各反应溶液的荧光强度。
图7表示除加入YO-PRO-1外还加入亚甲基蓝作为第二嵌入剂进行LAMP反应时各反应溶液的荧光强度。
图8表示加入亚甲基蓝和酸性橙-7进行LAMP反应时各反应溶液的吸光度。
本说明书包含特愿2001-183716说明书所披露的内容的部分或全部，它是本申请的优先权文件。
实施发明的最佳形式参考下述实施例更具体地说明本发明，当然本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
氧化剂或还原剂在使用溴化乙锭检测LAMP反应产物中的效果(1)LAMP方法进行核酸扩增反应表1反应溶液组成反应溶液组成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO40.1％吐温200.4mM dNTP8U Bst DNA聚合酶(NEB)1.6μM FA引物
1.6μM RA引物0.4μM F3引物0.4μM R3引物作为LAMP反应模板，将6×10-20mol前列腺特异性抗原(PSA)DNA加入到上述反应溶液中，再加入用于检测扩增产物的溴化乙锭(EtBr，0.5μ/ml)。然后在65℃扩增30分钟。如上所述，加入模板DNA的反应溶液被确定为阳性反应溶液，而没有加入模板DNA的反应溶液作为阴性反应溶液。在该扩增反应中，模板中包含的如下序列(SEQ ID NO.1)是我们感兴趣的多核苷酸。
5′-TGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3′(SEQ ID NO1)上述反应溶液中的内部引物(FA引物和RA引物)和外部引物(F3引物和R3引物)依照SEQ ID NO.1所示核苷酸序列设计如下。
·FA引物5′-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3′(SEQ IDNO2)·RA引物5′-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3′(SEQID NO3)[外部引物]·F3引物5′-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3′(SEQ ID NO4)·R3引物5′-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3′(SEQ ID NO5)
(2)氧化反应或还原反应将扩增反应后的上述阳性和阴性反应溶液进行氧化反应或还原反应。具体地说，氧化反应是通过向上述两种反应溶液中加入次氯酸钠(NaClO)，使其浓度为2.8％，在室温下保持2小时来进行。还原反应是通过向两种反应溶液中加入4mM硼氢化钠(NaBH4)和0.4mM的氢氧化钠(NaOH)，在冰上保持10分钟来进行。反应后，用ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Applied BiOsystems)，在488nm激发波长、605nm测定波长测定各反应溶液的荧光强度。
测定结果见图3。在反应溶液没有进行氧化或还原反应(图3中EtBr)的情况下，阳性反应溶液的荧光强度为3,012，而阴性反应溶液为2,695。也就是说，由于双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差为317。与之相对，在反应溶液用次氯酸钠进行氧化反应的情况下(图3中EtBr+NaClO)，阳性反应溶液的荧光强度为1,784，而阴性反应溶液648。这就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达1,136。在反应溶液用硼氢化钠进行还原反应的情况下(图3中EtBr+NaBH4)，阳性反应溶液的荧光强度为1,051，而阴性反应溶液为218，也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达833。
由上可知使用溴化乙锭检测双链核酸扩增产物时，通过氧化或还原溴化乙锭染色的扩增产物可提高检测灵敏度。
氧化剂或还原剂在使用吖啶橙检测LAMP反应产物中的效果在实施例1的核酸扩增反应中，除添加吖啶橙代替溴化乙锭、测定波长改为575nm以外，在与实施例1相同的试验条件下检查氧化剂或还原剂在LAMP反应产物检测效率中的效果。测定结果见图4。在反应溶液没有进行氧化或还原反应的情况下(图4中AO)，阳性反应溶液的荧光强度为7,053，而阴性反应溶液为6,155。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差为898。与之相对，在反应溶液用次氯酸钠进行氧化反应的情况下(图4中AO+NaClO)，阳性反应溶液的荧光强度为5,521，而阴性反应溶液为201。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达5,320。在反应溶液用硼氢化钠进行还原反应的情况下(图4中AO+NaBH4)，阳性反应溶液的荧光强度为6,214，而阴性反应溶液为596。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达5,618。
以上可知使用吖啶橙检测双链核酸扩增产物时，可以通过氧化或还原被吖啶橙染色的扩增产物来提高检测的灵敏度。
其他嵌入剂在使用溴化乙锭检测LAMP反应产物中的效果LAMP反应的条件与实例1中的反应条件相同，只是除了添加溴化乙锭外，还加入20μM亚甲基蓝、1μg/ml放线菌素D或稀释100,000倍的SYBR Green 2(Molecular Probes)作为第二嵌入剂。检查上述各种第二嵌入剂在LAMP反应产物检测效率中的效果。测定结果见图5。在反应溶液中除溴化乙锭外不添加第二嵌入剂的情况下(图5中EtBr)，阳性反应溶液的荧光强度为3,085，而阴性反应溶液为2,701。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差为384。与之相对，在反应溶液中加入了亚甲基蓝的情况下(图5中EtBr+MB)，阳性反应溶液的荧光强度为860，而阴性反应溶液为116，也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达744。在反应溶液中加入了放线菌素D的情况下(图5中EtBr+AD)，阳性反应溶液的荧光强度为3,158，而阴性反应溶液为2,322，也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达836。在反应溶液中加入了SYBR Green 2的情况下(图5中EtBr+SYBR-G)，阳性反应溶液的荧光强度为2,822，而阴性反应溶液为2,268。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达554。
以上可知用溴化乙锭检测双链核酸扩增产物时，使LAMP反应在第二嵌入剂和溴化乙锭共同存在下进行，可以提高检测灵敏度。
其他嵌入剂在使用吖啶橙检测LAMP反应产物中的效果LAMP反应条件与实施例1的反应条件相同，除加入吖啶橙代替溴化乙锭，还加入20μM亚甲基蓝、1μg/ml放线菌素D或稀释100,000倍的SYBR Green 2(Molecular Probes)作为第二嵌入剂，测定波长设为575nm。检查各嵌入剂在LAMP反应产物的检测效率中的效果。结果见图6。在反应溶液中除吖啶橙外没有加入第二嵌入剂的情况下(图6中AO)，阳性反应溶液的荧光强度为7,121，而阴性反应溶液为6,195。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差为926。与之相对，在反应溶液中加入亚甲基蓝的情况下(图6中AO+MB)，阳性反应溶液的荧光强度为3,500，而阴性反应溶液为350。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达3,150。在反应溶液中加入放线菌素D的情况下(图6中AO+AD)，阳性反应溶液的荧光强度为7,368，而阴性反应溶液为4,762。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达2,606。在反应溶液中加入SYBRGreen 2的情况下(图6中AO+SYBR-G)，阳性反应溶液的荧光强度为9,435，而阴性反应溶液为4,721。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达4,714。
以上可知用吖啶橙检测双链核酸扩增产物时，使LAMP反应在第二嵌入剂和吖啶橙共同存在下进行，可以提高检测灵敏度。
亚甲基蓝在用YO-PRO-1检测LAMP反应产物中的效果除加入1μg/ml YO-PRO-1和10μM亚甲基蓝作为第二嵌入剂来代替溴化乙锭外，LAMP反应条件与实施例3的反应条件相同。检查亚甲基蓝在使用YO-PRO-1检测LAMP反应产物的效率中的效果。使用20μL扩增后的反应溶液和读板仪(Polarion，Tecan)，以485nm激发波长、535nm测定波长、25℃下检测其荧光强度。测定结果见图7。
在反应溶液中没有加入亚甲基蓝的情况下(图7中YO-PRO-1)，阳性反应溶液的荧光强度为39,194，而阴性反应溶液为34,047。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差为5,147。
与之相对，在反应溶液中加入了亚甲基蓝的情况下(图7中YO-PRO-1+MB)，阳性反应溶液的荧光强度为33,596，而阴性反应溶液为13,592。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的荧光强度差高达20,004。
以上可知在用YO-PRO-1检测双链核酸扩增产物时，使LAMP反应在第二嵌入剂亚甲基蓝与YO-PRO-1同时存在下进行，可以提高检测灵敏度。
络合物形成体化合物在使用亚甲基蓝检测LAMP反应产物中的效果将亚甲基蓝和酸性橙7在水溶液中混合。形成络合物。一形成络合物，亚甲基蓝和酸性橙7(AdO)的吸收光谱均发生了变化。因此，通过测定吸收光谱可以确定是否形成了络合物。
将500μM亚甲基蓝或者亚甲基蓝和AdO的混合液(各500μM；亚甲基蓝与AdO形成络合物)分别加入到LAMP反应溶液中，然后与实施例1同样的方式进行核酸扩增反应。用岛津UV-2200分光光度计(使用10mm比色皿)、680nm测定波长测定扩增后反应溶液的吸光度。测定结果见图8。在反应溶液中没有加入AdO的情况下(图8中MB)，阳性反应溶液的吸光度为0.75，而阴性反应溶液为0.71。也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的吸光度差为0.04。与之相对，在反应溶液中加入了AdO的情况下(图8中MB+AdO)，阳性反应溶液的吸光度为0.46，而阴性反应溶液为0.38，也就是说，由双链核酸扩增产物的发生所引起的吸光度差为0.08。
这表明，AdO可以调节亚甲基蓝向DNA的插入。更具体地说，由于亚甲基蓝插入单链DNA的牢固程度较弱，因此被AdO抑制。相反的，亚甲基蓝插入双链DNA牢固，因此不能被AdO抑制，因此可认为亚甲基蓝从络合物中游离出来。
由此可知，嵌入剂与单链核酸之间的键合可以优先被络合物形成反应抑制，就如通过氧化或还原的方法一样。因此，可以提高双链核酸扩增产物检测的灵敏度。
本说明说中援引的所有公开出版物、专利和专利申请都直接作为参考，成为本说明书的一部分。
产业可利用性本发明提供有效检测双链核酸扩增产物的方法。尤其是将本发明应用于通过LAMP法检测核酸扩增产物时，LAMP法与PCR相比，可通过使用大量的引物，有效降低来自单链核酸的背景干扰。
序列表独立文本SEQ ID NO.1；合成DNASEQ ID NO.2；合成DNASEQ ID NO.3；合成DNASEQ ID NO.4；合成DNASEQ ID NO.5；合成DNA
序列表序列表<110>荣研化学株式会社(EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA)<120>有效检测双链核酸的方法<130>PH-1583-PCT<150>JP 2001-183716<151>2001-06-18<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>178<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>1tgcttgtggc ctctcgtggc agggcagtct gcggcggtgt tctggtgcac ccccagtggg 60tcctcacagc tgcccactgc atcaggaaca aaagcgtgat cttgctgggt cggcacagcc 120tgtttcatcc tgaagacaca ggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttc acacaccc178<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>2tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210>3<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4tgcttgtggc ctctcgtg 18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>5gggtgtgtga agctgtg 171/权利要求
1.一种降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法，其中是将与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物加入到均与嵌入剂结合的双链和单链核酸的混合物中，从而降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号。
2.权利要求1的方法，其中所述嵌入剂是溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1、YO-PRO-1或亚甲基蓝中的任一种。
3.权利要求1或2的方法，其中与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于与双链核酸上结合的嵌入剂的化合物是氧化剂或还原剂。
4.权利要求3的方法，其中所述氧化剂是次氯酸钠、过氧化氢或高锰酸钾中的任意一种。
5.权利要求3的方法，其中所述还原剂是硼氢化钠或氰基硼氢钠。
6.一种降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号的方法，其中是将与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物加入到含有双链和单链核酸的混合物中。
7.权利要求6的方法，其中所述嵌入剂为溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1、YO-PRO-1或亚甲基蓝中的任一种。
8.权利要求6或7的方法，其中与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物是与上述嵌入剂不同的第二嵌入剂。
9.权利要求8的方法，其中所述第二嵌入剂是亚甲基蓝、放线菌素D、SYBR Green II或OliGreen中的任意一种。
10.一种检测核酸扩增反应产物的方法，该方法包含以下步骤(a)通过核酸扩增反应扩增核酸；(b)向核酸扩增反应后的反应溶液中加入嵌入剂；(c)根据权利要求1-9的任一种方法降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号；以及(d)测定反应溶液的荧光强度。
11.一种检测核酸扩增反应产物的方法，该方法包含以下步骤(a)在嵌入剂存在下通过核酸扩增反应扩增核酸；(b)根据权利要求1-9的任一种方法降低来自单链核酸上结合的嵌入剂的信号；以及(c)测定反应溶液的荧光强度。
12.一种检测核酸扩增反应产物的方法，该方法包含以下步骤(a)在嵌入剂以及与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物存在下，通过核酸扩增反应扩增核酸；以及(b)测定反应溶液的荧光强度。
13.权利要求10-12中任一项的检测方法，其中所述核酸扩增反应通过以下步骤进行(a)从目标区3’末端向该多核苷酸链3’末端依次选取第1任意序列F1c、第2任意序列F2c和第3任意序列F3c；从目标区的5’末端向该核苷酸链的5’末端依次选取第4任意序列R1、第5任意序列R2和第6任意序列R3；(b)制备下述引物包含与F2c互补的序列F2和在F2的5’侧与F1c相同的序列的引物；包含与F3c互补的序列F3的引物；包含与R2相同的序列和在该序列的5’侧与R1互补的序列R1c的引物；包含与R3相同的序列的引物；以及(c)以上述核苷酸链作为模板，在链置换型聚合酶和上述引物存在下合成DNA。
14.权利要求10-12中任一项的检测方法，其中所述核酸扩增反应通过以下步骤进行(a)从目标区3’末端向该多核苷酸链3’末端依次选取第1任意序列F1c和第2任意序列F2c；从目标区5’末端向该核苷酸链的5’末端依次选取第3任意序列R1和第4任意序列R2；(b)制备下述引物包含与F2c互补的序列F2和在F2的5’侧与F1c相同的序列的引物；包含与R2相同的序列和在该序列的5’侧与R1互补的序列R1c的引物；以及(c)以上述核苷酸链作为扩增反应模板，在链置换型聚合酶、上述引物和解链温度调节剂存在下合成DNA。
15.权利要求14的检测方法，其中所述解链温度调节剂为甜菜碱或三甲胺N-氧化物
16.一种用于检测双链核酸的试剂盒，该试剂盒包含下述化合物作为组成嵌入剂；与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物和/或与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述嵌入剂是溴化乙锭、吖啶橙、TO-PRO-1或YO-PRO-1中的任意一种。
18.权利要求17的试剂盒，其中与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂的化合物是氧化剂或还原剂。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述氧化剂是次氯酸钠、过氧化氢或高锰酸钾中的任意一种。
20.权利要求18的试剂盒，其中所述还原剂是硼氢化钠或氰基硼氢钠。
21.权利要求16的试剂盒，其中与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂的化合物是与上述嵌入剂不同的第二嵌入剂。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述第二嵌入剂是亚甲基蓝、放线菌素D、SYBR Green II或OliGreen中的任意一种。
全文摘要
一种有效检测双链核酸的方法。即降低单链核酸上结合的嵌入剂发出的信号的方法，其特征在于包括均与嵌入剂结合的双链核酸与单链核酸的混合物中，加入与单链核酸上结合的嵌入剂的反应优先于双链核酸上结合的嵌入剂、或者与单链核酸的结合强度高于嵌入剂但与双链核酸的结合强度低于嵌入剂，从而降低单链核酸上结合嵌入剂发出的信号。
文档编号C12Q1/68GK1543509SQ0281599
公开日2004年11月3日 申请日期2002年6月10日 优先权日2001年6月18日
发明者富田宪弘, 森安义 申请人:荣研化学株式会社