专利名称：具有实施生物技术工艺的增强能力的真菌微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有实施生物技术工艺的增强能力的真菌微生物。特别地，本发明涉及增强在从含戊糖的生物质制备有用产品的生物技术工艺中氧化还原辅因子的再生。
背景技术：
本申请涉及生物技术工艺的效率，所述生物技术工艺是指利用微生物，特别是酵母和其它真菌的新陈代谢反应从生物材料中为人类提供有用产品的工业工艺，所述生物材料包括农业产品和林业产品，城市废弃物和其它生物质来源。这类有用产品的实例为乙醇、乳酸、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)、氨基酸，脂肪、维生素、核苷酸和种类繁多的酶和药物。
某些新陈代谢反应偶联氧化还原辅因子对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide dinucleotide phosphate)/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide dinucleotide phosphate)(NADP/NADPH)，其它反应则偶联氧化还原辅因子对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamidedinucleotide)/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamidedinucleotide)(NAD/NADH)。一般而言，分解代谢反应主要涉及辅因子NAD/NADH，合成代谢反应主要涉及辅因子NADP/NADPH。通常，生物技术工艺的生成途径中产生过量的NADP。戊糖发酵就是一个实例。在戊糖发酵中，通过L-阿拉伯糖和D-木糖途径，某些分解代谢反应偶联NADP/NADPH辅因子(参见
图1)。
D-木糖发酵为乙醇(或乳酸)是氧化还原中性，但使用不同的氧化还原辅因子，其产生氧化还原辅因子失衡。木糖还原酶利用NADPH和产生NADP。其它氧化还原步骤为木糖醇脱氢酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶和醇脱氢酶，它们每个均利用NAD/NADH氧化还原辅因子对。作为该氧化还原辅因子失衡的结果，必须通过其它反应例如与CO2生成偶联的戊糖磷酸途径的氧化部分再生NADPH。CO2是不需要的产物，D-木糖转化为乙醇(或乳酸)不再为氧化还原中性(图2)。结果还产生了其它不需要的产物如木糖醇。
因此，能够再生NADP(H)辅因子将具有有益效果，特别是在真菌戊糖(D-木糖和L-阿拉伯糖醇(L-arabinitol))发酵中。由于降低了该工艺对严格氧控制的依赖，降低氧的需求或促进厌氧戊糖(D-木糖和L-阿拉伯糖)发酵，因此再生NADP(H)辅因子的有效方法具有生物技术上的有益效果。厌氧戊糖发酵极慢而且产生不需要的副产物；最佳发酵条件需要半-厌氧条件(Jeffries和Jin，2000)。这在实施时就需要控制通风即技术复杂的工艺。戊糖发酵的产物通常是廉价大批量产物(如乙醇)。这就需要廉价的生产工艺，如厌氧发酵。厌氧发酵技术上简单，而且可大规模实施。但是用现有的技术，厌氧D-木糖发酵主要产生不需要的副产物如木糖醇和CO2(Toivari等，2001)。从D-木糖生成木糖醇和CO2是氧化还原中性。氧化还原中性转化的化学计量为从11摩尔D-木糖生成10摩尔木糖醇和5摩尔CO2。很明显地，在D-木糖还原中产生的NADP在生成乙醇和CO2的优选反应中，被还原为CO2生成反应中的NADPH。如果以一种不与生成CO2直接偶联方式还原NADP，则可导致产物从木糖醇和CO2转向乙醇和CO2，因此其为一种具有环境有益效果的、更加经济(便宜)的工艺。
在专利申请WO 99/46363(Aristidou等)中，公开了具有更有效生产有用的产物如乙醇和氨基酸的改善性能的在生物技术中使用的生产微生物。用至少一种编码氧化还原酶的重组DNA分子转化微生物，从而使具有至少一种共同底物，但是对NAD/NADH和NADP/NADPH有不同辅酶特异性的氧化还原酶对能以氧化还原酶对的两个成员同时在同一亚细胞区室优选细胞质中表达的方式进行表达。这导致通过使用不同辅因子的环氧化和还原反应来引入转氢酶活性。
环氧化和还原反应使得下述反应发生，其易于平衡NAD/NADH和NADP/NADPH辅酶对(1)
(2)可期待进行反应(1)和(2)的同时操作直至NAD/NADH和NADP/NADPH比率几乎相同，这是因为这两对的氧化还原电位非常相似。
在专利公开US 5,830,716中，公开了一种使用微生物制备靶物质的方法。在该方法中，已经将微生物修饰以便增强其从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)来生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的能力，由此在培养基中增加生成大量的靶物质，如L-氨基酸。通过增加微生物的烟酰胺核苷酸转氢酶的活性而增强微生物由NADH生成NADPH的能力。
为改进多种从底物到产物的主要代谢途径生成净余NADP的生物技术工艺，仍然需要能更有效再生NADPH的系统。这类工艺包括戊糖发酵为乙醇，乳酸和其它产物和从糖中生产聚链烷酸酯，某些氨基酸和脂类。
发明概述本发明的目的是提供一种具有实施生物技术工艺的增强能力的真菌微生物。根据本发明，通过用编码NADP-连接的甘油醛3-磷酸脱氢酶(NADP-GAPDH；EC1.2.1.13)的基因来转化真菌而实现上述目的。基因产物NADPH在对戊糖发酵或其它工艺有益的分解代谢反应中再生。
优选地，NADP-GAPDH是真菌源性，编码其的DNA序列包括SEQ IDNo.1或其功能性变体。本发明提供了用编码NADP-连接的GAPDH的DNA序列转化的工业微生物，从而该转化的微生物具有新方式再生还原型NADPH，形成NADP/NADPH辅酶对。在酵母和其它真菌和大多数其它微生物中，GAPDH是将糖转化为丙酮酸，并向前转化为细胞材料和发酵终产物的主要代谢途径上的步骤。本发明的转化的微生物具有两种GAPDH酶，一个与NAD作用，另一个与NADP作用。转化的有机体自动校正通过这两个酶的相对通量，以便再生其它代谢步骤所需的NADPH和NADH。
使用遗传工程技术，还能够调整编码NADP和NAD-连接的GAPDH酶的基因的相对表达水平，从而，例如在用于产品形成的条件下，降低或事实上去除NAD-连接的酶的水平，从而导致GAPDH反应中NADP使用的增加。本发明的转化的微生物导致在所需发应(例如，戊糖转化为乙醇或乳酸，糖转化为脂类或氨基酸或聚羟基链烷酸酯)为NADPH的净消耗者的情况下更有效的生物技术工艺，因为在转化的微生物中，通过引入NADP-连接的GAPDH，其为所需工艺自身使用的主要代谢途径中的步骤，NADPH可被再生，因此降低或消除了对通过消耗碳物质或具有局限能力，或二者兼有的副反应(例如戊糖磷酸途径的氧化支路)而再生NADPH的需求。表述“更有效的生物技术工艺”包括在底物基础上所需产品的更高产率，更大容量生产力(以每单位时间每单位反应器体积的产品质量计算)，更高特异率(以每单位时间每单位生产微生物质量的产品质量计算)，能够生产更少量不需要的副产物，能更廉价的实施，例如可在更简易的发酵罐或需要较小通风，或具有两个或多个这些有益效果的工业工艺。
本发明提供了一种编码来自乳糖克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的NADP-连接的GAPDH的DNA序列，该DNA序列可用于实施本发明。本发明还提供了发现其它编码具有NADP-连接的GAPDH活性的蛋白的DNA序列的方法，该DNA序列可用于实施本发明。另外，公开了NADP-连接的GAPDH的氨基酸序列的特定特征，这能使本领域普通技术人员识别编码具有NADP-连接的GAPDH活性的蛋白的，且能用于实施本发明的DNA序列，或能够方便地操作来自编码具有NADP-连接的GAPDH活性的蛋白DNA序列的这类DNA序列。
本发明提供了一种能用于驱动NADP-连接的GAPDH的表达以实现本发明目的的适用的组成型启动子。但是，其它启动子可以使用，设想对某些宿主和生物工艺来说，从可诱导或可抑制的启动子表达NADP-连接的GAPDH可能是有利的。
现在通过参考附图和实施例详细描述本发明。这些实施例仅用来说明某些实施方案而并非意图限制本发明的范围。
附图简述图1L-阿拉伯糖和D-木糖的真菌途径。L-阿拉伯糖经过包含2个还原反应和2个氧化反应步骤的途径转化为5磷酸D-木酮糖。还原反应步骤与NADPH氧化，对NAD的还原反应的氧化步骤相偶联。D-木糖通过包括1个还原反应和1个氧化反应的相似的方式进行分解。此处的还原反应也与NADPH氧化和对NAD的还原的氧化相偶联。
图2.D-木糖发酵中的氧化还原辅因子。将3摩尔D-木糖发酵为5摩尔乙醇和5摩尔CO2为氧化还原中性。但使用不同的氧化还原辅因子，即NADP和NADH不能充分再生，造成氧化还原辅因子失衡。例如通过戊糖磷酸途径的氧化部分，NADP可被再生。这将导致额外的CO2生成因此整个工艺不再是氧化还原中性。
图3.存在NADP-GAPDH时D-木糖发酵中的氧化还原辅因子。转化3摩尔D-木糖为3摩尔D-木酮糖导致生成3摩尔NADP和3摩尔NADH。从3摩尔D-木酮糖，可以生成5摩尔甘油醛3-磷酸(GAP)。3摩尔GAP能够将3摩尔NADP再循环回NADPH。其它2摩尔GAP用于还原2摩尔NAD为NADH。总共生成了5摩尔NADH，其可通过醇脱氢酶再生而生成乙醇。5摩尔乙醇和5摩尔CO2的生成目前为辅因子中性的。
图4.在过表达NADP-GAPDH的菌株(实心标记)和相应没有NADP-GAPDH活性(空心标记)的对照菌株中厌氧D-木糖发酵期间乙醇和木糖醇的生成。浓度以mM每克干重给出。
图5.在过表达NADP-GAPDH(实心标记)的菌株和相应没有NADP-GAPDH活性(空心标记)的对照菌株中厌氧D-木糖发酵期间乙醇的生成和D-木糖消耗。浓度以mM每克干重给出。
图6.具有组氨酸标记的纯化的NADP-GAPDH的SDS PAGE。
图7.在具有ZWF1缺失和过表达NADP-GAPDH的菌株(三角形)中厌氧D-木糖发酵期间乙醇和木糖醇的生成。实施例5中给出详细描述。为进行对比，图4中的乙醇和木糖醇的生产被包括进来。实心标记代表乙醇生成，空心标记代表木糖醇的生成。方块是对照株，圆形为实施例3中描述的过表达NADP-GAPDH的菌株。
图8.在用实施例5中描述的菌株厌氧D-木糖发酵期间乙醇的生成图9.在用实施例5中描述的菌株厌氧D-木糖发酵期间木糖醇的生成。
图10.在用实施例5中描述的菌株厌氧D-木糖发酵期间D-木糖的消耗。
发明详述为寻找能够再生分解代谢反应如戊糖发酵中氧化还原辅因子NADP/NADPH的可能蛋白及其相应的基因，可以使用下述发现NADP/NADPH连接的蛋白及其相应基因的筛选方法。在这一筛选方法中，我们使用缺失了编码磷酸葡糖异构酶的基因PGI1的酿酒酵母株(Saccharomyces cerevisiae)。该缺失使啤酒酵母不能在葡萄糖上生长(Boles等，1993)。认为该导致葡萄糖致死表现型的缺失与戊糖磷酸途径的氧化部分中NADPH的过量生成有关系(Boles等，1993)。但是缺失了磷酸葡糖异构酶基因的乳酸克鲁维酵母却能够在葡萄糖上生长，即其能够应对NADPH的过量生成(Gonzales Siso等，1996)。因此我们用获自乳酸克鲁维酵母的基因文库转化磷酸葡糖异构酶基因缺失的啤酒酵母株，并在葡萄糖上进行生长筛选。在该筛选中，我们发现包含几个开放阅读框的DNA片段。转座子被随机插入DNA片段中，分析了那些未能恢复在葡萄糖上生长的转座子插入。使用这一技术，我们鉴定了能够恢复在葡萄糖上生长的开放阅读框。该开放阅读框与NAD-GAPDH高度同源。我们进一步研究了该开放阅读框。为了这一目的，我们将其过表达，并分析酶活性，发现其具有NADP活性。我们还在加入组氨酸标记后，纯化了该酶，发现开放阅读框编码一种蛋白质，其偏爱NADP超过NAD，即，其不是NAD-GAPDH(EC1.2.1.12)而是NADP-GAPDH(EC1.2.1.13)。因为在关于在植物以外的真核生物中的NADP-GAPDH的文献从未报道过它们存在于光合作用中，不被酵母实施的反应，因此这是令人惊讶的。NADP-GAPDH由包含SEQ ID No.1的DNA序列编码。
已知，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为非磷酸化酶(GAPN，EC1.2.1.8)和磷酸化酶。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性酶(NAD-GAPDH，EC1.2.1.12)和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP)依赖性酶(NADP-GAPDH，EC1.2.1.13)是已知的磷酸化酶。NAD-GAPDH是一种在原核生物和真核生物中高度保守的糖酵解酶。NADP-GAPDH已知存在于细菌中(例如Koksharova等，1998，Fillinger等，2000)。对于植物，已知了NADP-GAPDH，其与光合作用的CO2同化作用有关并定位于叶绿体中(Cerff，1982)。叶绿体的NADP-GAPDH具有两个亚基A和B(Shih等，1991，Baalmann等，1996)。其它真核生物的NADP-GAPDH尚未知。
本发明中，我们已经获得了两种具有相同底物但辅酶特性相反的氧化还原酶，即NAD-GAPDH(EC1.2.1.12)和NADP-GAPDH(1.2.1.13)。但是这还不能必然地导致环氧化-还原反应。如图3中关于D-木糖发酵所示，用于3摩尔D-木糖还原反应的3摩尔NADPH，可通过NADP-GAPDH再生。被木糖醇脱氢酶利用的NAD和NAD-GAPDH通过醇脱氢酶再生。没有环转氢酶反应，进行3摩尔D-木糖发酵为5摩尔乙醇和5摩尔CO2的发酵，这使得本发明与发明公开US 5,830,716和公开WO 99/46363不同。
NADP-GAPDH对不需要含有与CO2生产偶联的NADP至NADPH的还原反应的工艺是有利的。一个实例为己糖发酵。因为微生物在发酵期间生长，她产生过量的NADH和NADP(Oura，1972)。乙醇的生成伴随需要再氧化过量NADH的甘油的生成，还伴随超过1摩尔CO2/每摩尔乙醇的生成，其需要还原过量的NADP。这些反应降低了可发酵糖的乙醇产量。使用NADP-GAPDH时，NADP可被还原而没有额外的CO2生成，而且通过使用甘油醛3-磷酸池来还原NADP，较少的NADH通过NAD-GAPDH而生成，最终生成较少量的甘油，即引入NADP-GAPDH能增加己糖发酵中的乙醇产量而降低不需要的副产物，甘油和CO2的生成。这样本发明使得从己糖类中获得有益于环境的燃料醇的生成仍更有效而且更低污染。
NADP-GAPDH还有利于戊糖发酵。通过本发明，D-木糖和L-阿拉伯糖以氧化还原中性的方式而被发酵为乙醇，而不需建立氧化还原辅因子失衡。在实施例3和5中，我们显示了D-木糖能被更有效地发酵为乙醇。从D-木糖高产量地生产乙醇，而生产更少的不需要的副产物如木糖醇和CO2。
在实施例3中，我们显示了NADP-GAPDH对厌氧木糖发酵的影响。过表达NADP-GAPDH的菌株生成，按克分子比，大约30％的较少木糖醇和大约40％的较少CO2。结果，乙醇以更高产量产出，即从相同量的D-木糖产出了大约30％多的乙醇。
除产量增加和副产物生成减少以外，重组株实施生物技术工艺的能力也增加了，这表现在产物生成率的增加，在工艺条件中代谢活性延长或降低了对氧气的需求，所用这些因素都能增加工艺的效率。
为进一步增加乙醇产量，降低CO2和木糖醇的产量，可以使用另外的改进策略。这些包括(1)用本发明的NADP-连接的GAPDH降低对NADP竞争的反应，和(2)增加NADP-GAPDH对NADP容量或亲和力。
1)降低竞争反应通过NADP-GAPDH再生NADPH不是NADPH再生的唯一途径。其它途径如通过戊糖磷酸途径的氧化部分与NADP竞争。该NADPH再生与CO2生成偶联。其对抑制或缺失该途径或相似途径具有更多有利作用。我们在实施例5中显示了葡萄糖6-磷酸脱氢酶与NADP竞争，相应的基因ZWF1的缺失与NADP-GAPDH的过表达一起对乙醇生产具有更有益的作用，即在耗费不需要的副产物如木糖醇或CO2的情况下，以更产量生成乙醇。
在实施例5中，我们证明了降低与NADP的竞争反应，我们还能进一步降低不需要副产物的生成，并由此增加乙醇产量。通过缺失葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因，与NADP竞争的反应，和同时过表达NADP-GAPDH，我们能另外降低不需要的木糖醇20％。其它与NADP竞争的反应包括NADP依赖性乙醛脱氢酶ALD6和异柠檬酸脱氢酶IDP1-3。
可用多种方法来抑制这些和其它与NADP竞争的反应。可缺失编码催化反应的酶的基因，如实施例5中关于葡萄糖6-磷酸脱氢酶的描述。还可以断裂所述基因，从而使其不能再生成功能性脱氢酶。还可以改变该基因的启动子(例如，通过缺失开放阅读框上游的部分序列)从而降低酶的表达水平，但并不停止其表达。如果催化的反应对微生物是有益的，这将是有利的，从而，例如完全抑制阻止微生物的生长。实际上，只需很少的实验即可，因为如果完全抑制阻止生长，就可使用具有多种优势的、效果立即明确的和更温和的方法。同样地，可在竞争酶的活性位点引入突变，从而使其催化效率降低，但不消失。例如，增加NADP竞争酶的Km值的突变就是适用的，但不需表征所述突变的动力学效果。脱氢酶的活性位点序列可被熟悉本领域的那些人识别。
2)增加NADP-GAPDH的容量为增加NADP-GAPDH的容量或亲和性，可以增加表达水平或者可以使用对NADPH具有更高亲和性的NADP-GAPDH。
降低竞争反应或增加NADP-GAPDH的容量不仅对戊糖发酵有益，而且对其它NADP-GAPDH具有正向效果的实例也是有利的。
我们此处描述了将来自乳酸克鲁维酵母的NADP-GAPDH引入到包含D-木糖途径的啤酒酵母株中。对本领域技术人员而言，从其它真菌或其它真核生物来源中发现相似的酶是很容易的。引入NADP-GAPDH的有益效果可不依赖于其来源，无论其是来自细菌，真菌或来自其它真核生物。
来自细菌和植物的NADP-GAPDH是已知的。在本发明中，我们描述了来自真菌的NADP-GAPDH。NADP-GAPDH可通过如修饰NAD-GAPDH氨基酸序列来产生。
例如，将此处公开的NADP-GAPDH的序列和其它已知NAD和NADP特异性和相当程度氨基酸同一性的脱氢酶的序列相比较，和在已知三维结构的那些的最佳情形中，允许本领域技术人员能够预测出蛋白序列中负责辅因子特异性的氨基酸。根据这一认识并使用定点诱变，可改变辅因子的特异性，即可从NAD-GAPDH通过定点诱变获得NADP-GAPDH。在难以表达异源NADP-GAPDH的情况下，通过诱变来建立NADP-GAPDH是有益的。还可用随机方法进行需要的改变。
下面是如何发现对酶的辅因子特异性具有重要性的氨基酸序列的一个实例。将NADP-GAPDH的氨基酸序列与那些来自不同生物的具有不同特异性的甘油醛3-磷酸脱氢酶对比，并将这与已知的结构信息相比较，提示46位氨基酸天冬酰胺可以是重要的(同样参见Fillinger等，2000)。在所有的NAD-GAPDH中，相应的氨基酸是带负电的天冬氨酸。从可用的结构信息中，可以预料当NADP结合到活性位点时，NADP的带负电的磷酸就在这一区域，即由于在负电荷之间不利的相互作用，故NAD-GAPDH不利用NADP。通过将带负电的天冬氨酸改变为中性残基，如本文公开的针对乳酸克鲁维酵母的NADP-GAPDH的天冬酰胺，或改变为带正电的氨基酸，可以改变NAD-GAPDH的特异性，从而也可以利用NADP。
NADP-GAPDH还在L-阿拉伯糖发酵中是有利的，由于L-阿拉伯糖途径产生与D-木糖途径相似的辅因子的失衡。
聚羟基链烷酸酯(PHA)可商业化生产以制备可生物降解塑料，但广泛应用的价格太昂贵，除立法强制性使用的地区外(例如德国)。因此，增加微生物生成PHA过程的效率的理想的。在PHA的生物合成中，葡萄糖代谢为乙酰-CoA，产生2个NADH分子/乙酰-CoA分子，随后乙酰-CoA凝聚为乙酰乙酰-CoA，再由NADPH还原为3-羟丁酰CoA。因此合成每分子3-羟丁酰CoA产生4分子NADH和需要1分子NADPH。然后3-羟丁酰CoA聚合为聚羟基丁酸酯(PHB)或与其它乙酰-CoA如丙酰-CoA共聚合形成混合的PHAs。生成每单体单位需要一个NADPH分子以及产生4个NADH分子意味着合成PHA的微生物需要通过反应如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或异柠檬酸脱氢酶转移它们的部分碳流以生成NADPH，结果出现CO2过量生成和碳源浪费，如前面解释。同时，NADH必需被再氧化，这或者造成更多的碳丢失，或者增加氧的需求，或二者兼有。通过使用根据本发明转化的生产微生物，即可以提供新的消耗NADH而产生NADPH的机制(关于综述，参见如Anderson和Dawes；Poirier等，)。生物质废弃物如CO2降低，需要氧气因此也降低，结果降低了通风成本。
引入NADP-GAPDH不仅对啤酒酵母产生有益效果，而且对其它真菌，如天然利用戊糖的酵母物种也能产生有益效果。在任何真菌物种中，其对D-木糖发酵和L-阿拉伯糖发酵或任何氧化还原辅因子失衡造成其妨害的生物技术工艺是有益的。发酵产物可以是乙醇、乳酸盐/乳酸或其它产物。
酶的氨基酸序列可被有意或无意的(例如在PCR克隆中)改变(例如部分缺失或添加或引入氨基酸改变)以便使改变的酶仍能催化与原始酶相同的反应，这是本领域普通技术人员众所周知的。还可以使用编码所述NADP-GAPDH的“功能活性”变体的重组DNA序列来实施本发明。
本发明还可通过用具有与实施例中使用的启动子不同的启动子的重组DNA分子来转化微生物而得以实施。转化的DNA分子不需要包含编码完整功能酶的核苷酸序列。例如，用修饰了天然启动子的并由此导致NADP-GAPDH的增加的表达水平的DNA分子转化NADP-GAPDH的天然宿主可以获得有益效果。
任何现有技术中已知的用于将基因转导或转化到宿主的方法是适于本发明的，并且可以使用各种类型的载体，包括自主复制的质粒载体或人工染色体。现有技术中记载的能够将单个或多个拷贝的转化基因以功能性、表达的形式整合到染色体中的方法也适用于本发明。
设想在本发明中，在某些转化基因仅在特定培养条件下表达的情况下是有利的。例如，首先使生物生长到一定细胞密度，然后表达转化的基因，这样的方法是有用的。已知启动子的引入可通过改变温度或pH、通过特定碳源或氮源或通过培养基中存在或不存在特定有机或无机物质如磷酸盐或铜来诱导。
通过下述实施例进一步举例说明本发明，但实施例应理解为仅用于说明，而不应理解为对本发明任何形式上的限制。如果没有特别指出，所有生物技术程序采用本领域惯用的方法来实施。
实施例实施例1-筛选适用的氧化还原酶我们使用基于缺失啤酒酵母中磷酸葡糖异构酶的适用于NADP(H)相关的氧化还原酶的筛选系统。存在所述缺失的菌株(Δpgi1)不能在葡萄糖中生长，这与NADPH致死性过量生长有关(Boles等，1993)。在乳酸克鲁维酵母中，所述缺失未导致相似的表现型(Gonzales Siso等，1996)。我们使用缺失了磷酸葡糖异构酶的啤酒酵母并筛选在葡萄糖中生长的乳酸克鲁维酵母来寻找能够使Δpgi1突变株在葡萄糖中生长的乳酸克鲁维酵母基因。我们发现了NADP连接的GAPDH的基因，如上述。因此，该筛选方法提供了适用于实施本发明的基因。
构建用于文库筛选的宿主菌株；在啤酒酵母中缺失PGI1基因缺失啤酒酵母单倍株CEN.PK2的PGI1基因。通过使用引物为3645和3646的PCR获得啤酒酵母的PGI1片段。引物3646(5’-CGACCGGTCGACTACCAGCCTAAAAATGTC-3’)含有SalI酶切位点(下滑线标出的)以便于克隆，引物3645(5’-GGCACGCTGCAGAGAGCGATTTGTTCACAT-3’)含有PstI酶切位点。用SalI和PstI酶切PGI1片段，并连接到pBluescript SK-载体(Stratagene)中。获得的质粒(B1186)用EcoRI和BstBI酶切以便从PGI1基因的中间去除715bp的片段。
通过DrdI酶切从酵母表达载体pRS423获得HIS3基因。HIS3片段用T4 DNA聚合酶补平并连接到pBluescript SK-EcoRV位点。用EcoRI和ClaI酶切该质粒(B1185)，将带有HIS3基因的1,5kb的片段连接到EcoRI和BstBI酶切的B1186质粒中。最终得到的质粒命名为B1187。
用SalI和MunI酶切从质粒B1187中释放出PGI1+HIS3片段，用该片段转化啤酒酵母菌株CEN.PK2。使用醋酸锂法(Hill等，1991；Giez等，1992)转化酵母。通过使用来自啤酒酵母PGI1基因的片段作为探针的DNA印迹分析确定酵母转化子。获得的菌株CEN.PK2 Δpgi1然后用于筛选。
构建和筛选乳酸克鲁维酵母基因组文库如Brummer等，2001中的描述，将乳酸克鲁维酵母基因组文库构建至携带LEU2标记基因的酵母多拷贝载体。用文库转化CEN.PK2 Δpgi1酵母菌株。转化子接种于含有SD-leu+2％果糖+0.1％葡萄糖的培养基上。培养2日后，来自培养板的1.3×106转化子汇于0.9％NaCl中。
为了进行酵母文库的筛选，将来自文库的6000个独立克隆接种于含有SD-leu+2％果糖+0.1％葡萄糖的培养基上。培养3日后，将培养板上的克隆复制到SD-leu+0.1％葡萄糖的培养板上。复制板培养9日。将72个缓慢生长的克隆划线接种至SC-leu+0.1％葡萄糖的平板上。
采用PCR分析来确定是否携带编码磷酸葡糖异构酶的乳酸克鲁维酵母RAG2基因的克隆在葡萄糖中生长。采用乳酸克鲁维酵母RAG2的特异性引物4719和4720进行PCR。5’-引物4719为从ATG开始的320bp下游(5’-CACTGAAGGACGTGCTGTGT-3’)，3’-引物4720为从ATG开始的1150bp下游(5’-AGCTGGGAATCTGTGCAAGT-3’).
针对18个克隆进行PCR分析。根据PCR分析发现了6个没有携带乳酸克鲁维酵母RAG2基因的克隆。从这6个克隆中提取质粒-DNA并转化至大肠杆菌以进一步分析。
质粒再转化至CEN.PK2 Δpgi1酵母菌株，测定转化子在葡萄糖中的生长。2个克隆能在葡萄糖中恢复生长。插入片段的部分测序显示了这两个克隆是相同的。其中一个质粒命名为B1513。
确定筛选产物回收的质粒含有大约10kb的插入片段。经“模板产生系统(templategeneration system)”(Finnzymes)，将转座子随机地插入到质粒内。选出10个不同的插入转座子(如通过用来自转座子和载体的引物的PCR来判断)。然后将它们再转化到CEN.PK2 Δpgi1菌株，在0.1％D-葡萄糖中进行生长测试。从能够在2％D-果糖+0.05％D-葡萄糖中维持生长，而在0.1％D-葡萄糖中不显示生长的菌株中回收质粒，用转座子序列的引物进行测序。不能在D-葡萄糖中恢复生长的质粒含有插入到与甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)具有高度同源性的开放阅读框的转座子。SEQ DI No.2显示了稍后转变为NAPD-GAPDH的酶的氨基酸序列。这是一个有356个氨基酸的蛋白，其分子量为39030 Da。它由处于核苷酸序列SEQ ID No.1的384-1451位核苷酸之间的核苷酸序列中的开放阅读框所编码。
实施例2-克隆和表达GAPDH同系物，测定NAPDH-GAPDH活性克隆乳酸克鲁维酵母GAPDH同系物至酵母表达载体pYES2从实施例1中的质粒B1513通过PCR扩增GAPDH同系物，使用下述引物GAPBAMHAAGGATCCAAGCGTCTCCTTAAACACCAGC和GAPHINDATAAAGCTTAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTC。PCR的退火温度为65℃。用BamHI和HindIII酶切PCR产物并连接到pYES2载体(Invitrogen)的多克隆位点的相应位点。pYES2是一种酵母表达载体，该载体在可用半乳糖诱导的启动子和终止子之间有多克隆位点。获得的载体命名为B1612。
在啤酒酵母中表达乳酸克鲁维酵母GAPDH同系物上述质粒B1612和作为对照的质粒pYES2转化啤酒酵母菌株CEN.PK2。获得的菌株在20g/l D-葡萄糖和20g/l D-半乳糖的选择性培养基中生长。光学密度为1时收获细胞，并制备细胞提取物。通过涡旋0.5g细胞(湿重)500mg玻璃珠(直径0.4mm)和1ml缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7.0加蛋白酶抑制剂)来制备细胞提取物。然后将提取物用于酶活性检测。在含有500mM三乙醇胺pH 7.8，1mM ATP，2mM MgCl2，0.2mM NADPH，3-磷酸甘油酸激酶的缓冲液中检测NAPD-GAPDH酶活性。加入甘油3-磷酸至终浓度为5mM来起动反应。从340nm吸收的NADPH的降低来计算活性。我们发现每mg的提取蛋白的NAPDH-GAPDH活性为0.05nkat。在转化空白pYES2质粒的对照组中，我们发现每mg为0.006nkat。
实施例3-乳酸克鲁维酵母GAPDH同系物对啤酒酵母菌株中D-木糖发酵的影响为发酵D-木糖，将NAPD-GAPDH基因连接到具有ADH1启动子的酵母表达载体。因此，除用下述引物外，如实施例2所描述通过PCR来扩增NAPD-GAPDH，所用引物的每一个包含BamHI限制位点(BamHI位点用下划线标出)AAGGATCCAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTC和AAGGATCCAAGCGTCTCCTTAAACACCAGC。然后将PCR产物克隆到TOPO载体(Invitrogen)，并将来自得到的载体的1kb BamHI片段连接到pVT102U的BamHI位点上(Vernet等，1987)。然后用得到的载体(B1731)转化啤酒酵母菌株(H2217，Aristidou等1999)，其过度表达木糖途径的酶，即木糖还原酶(XR)，木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)被整合到基因组中。我们使用除缺乏NADP-GAPDH外均相同的菌株作为对照。代替它含有空白载体pVT1O2U。在厌氧条件下用这两种菌株发酵纯D-木糖。首先在含有酵母氮基(Difco)和除尿嘧啶外全部氨基酸以及30g/l D-葡萄糖作为碳源的培养基中，在体积为1.61，30℃，pH 5.0空气流率为2l/mm的条件下使细胞生长。48小时后，当加入0.41的D-木糖溶液以便使D-木糖终浓度为50g/l时，生物质为3至4g/l而乙醇浓度为0.5～1g/l。气流变换为氮气，流率为0.1l/mm。取液体样品，分析干重并用HPLC分析乙醇、木糖和木糖醇以及其它组分。出口的气体用质谱进行分析。图3和4中显示了结果。所述发酵的主要产物为木糖醇、乙醇和CO2。当引入NADP-GAPDH时，生成的乙醇与木糖醇的克分子比升高。无NADP-GAPDH时，木糖醇和乙醇的克分子浓度是相似的。引入NADP-GAPDH时，木糖醇生成降低了大约30％(图4)。D-木糖的乙醇产量也受到影响。最大理论产量为每摩尔D-木糖生成1.67摩尔乙醇。在对照组中，我们发现生成的乙醇与消耗D-木糖的克分子比为0.44，是理论产量的26％，存在NADP-GAPDH时，消耗的D-木糖与生成的乙醇的克分子比为0.57，是理论产量的34％(图4)。CO2产量也受影响。我们分析了从30至大约90小时这一期间CO2的产量，并将其与同一时间段内的乙醇产量相比较。存在NADP-GAPDH时，CO2与乙醇的克分子比为1.15而对照组中为1.91。
实施例4-纯化的NADP-GAPDH为了纯化NADPH-GAPDH，我们在酵母中过量表达在蛋白N末端具有6位组氨酸的额外标记的NADP-GAPDH。用与实施例2和3相似的PCR将其克隆。基因起始引物为AAGGATCCAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTC，其含有BamHI限制位点和基因末端的引物AAGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAACACCAGCTTCGAAGTCCTTTTGAGCC，引入6个组氨酸和用下划线标出的BamHI限制位点。PCR产物首先克隆至TOPO载体(Invitrogen)，然后将来自TOPO载体的BamHI片段连接到具有PGKl启动子的酵母表达载体(B1181)的BglII位点。通过用HindIII消化酵母表达载体pMA91(Mellor等，1983)和将包含具有BglII克隆位点的PGKl启动子/终止子的得到的1.8kb片段连接到YEplac 195载体(Gietz和Sugino，1988)的HindIII的位点从而得到该酵母表达载体。然后将该质粒转化到具有磷酸葡糖异构酶基因突变的酵母菌株。质粒在葡萄糖中恢复生长显示了组氨酸标记不影响酶活性。然后用NiNTA柱(Qiagen)纯化组氨酸标记的蛋白。然后将如此纯化的蛋白用于SDS-PAGE，如图6中所示。酶几乎是纯的。SDS-PAGE中大概80～90％的蛋白为大约40kDa的单一条带。用200μM NADPH或200μM NADH按照实施例2中的描述测定活性。存在NADPH时，我们发现活性为140nkat/mg，存在NADH时，活性为47nkat/mg。
实施例5-存在NADP-GAPDH时缺失葡糖6-磷酸脱氢酶对D-木糖发酵的影响构建Δzwf1缺失株采用以啤酒酵母基因组DNA作为模板的PCR获得编码葡糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的ZWF1基因。使用特异性引物3994(5’-GCTATCGGATCCAAGCTTAGGCAAGATGAGTGAAGGTT-3’)和4006(5’-GCTATCGGATCCAAGCTTAGTGACTTAGCCGATAAATG-3’)。所述引物均含有BamHI和HindIII位点以便于克隆。限制位点用下划线标出。获自PCR的ZWF1片段用BamHI进行酶切并连接到pBluescript SK-质粒(Stratagene)。用BglII酶切得到的质粒B1768。在酶切过程，从ZWF1基因的中间释放出1063bp片段。消化的载体用绿豆核酸酶(Mung BeanNuclease)平端化。用BsmBI和DraIII酶切pRS423质粒(Christianson等，1992)得到HIS3标记基因。包含HIS3基因的1591bp片段用绿豆核酸酶平端化并连接到用BglII消化并平端化的载体B1768载体。得到的质粒命名为B1769。用BamHI酶切B1769质粒释放出ZWF1缺失盒，通过醋酸锂法将该片段转化到啤酒酵母菌株H2217(参见实施例3)。通过PCR分析、DNA印迹分析和通过G6PDH酶活性检测来确定ZWF1基因的缺失。
通过使用玻璃珠在10mM磷酸钠，pH 7.0的缓冲液中破碎酵母细胞，来制备用于G6PDH酶活性检测的细胞提取物。在提取缓冲液中加入蛋白酶抑制剂PMSF(终浓度1mM)和胃酶抑制剂A(0.01mg/ml)。用CobasMira分析仪(Roche)检测活性。在包含10mM磷酸钠，pH 7.0的缓冲液中检测活性，用1mM NADP和10mM G6PDH作为起始剂。在Δzwf1缺失株中未发现G6PDH活性。
在啤酒酵母菌株中缺失编码葡糖6-磷酸脱氢酶的ZWF1基因，所述啤酒酵母菌株中在基因组中整合了木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，如实施例3中所述。
然后用具有在PGK1启动子之下的NADP-GAPDH的多拷贝表达载体转化得到的菌株。为制备该表达载体，将如实施例3所述具有NADP-GAPDH的1kb BamHI片段连接到如实施例4所述的B1181载体的BglII位点。在zwf1缺失株中使用空白载体B1181制备对照株。四种菌株被比较，菌株1GDP 1，表达GAPDH基因的菌株；菌株2对照，具有空白载体的菌株；菌株3GDP1 Δzwf1，在zwf1缺失背景中表达GAPDH基因的菌株和菌株4Δzwf1，含有zwf1缺失和空白质粒的菌株。全部菌株都还含有整合到基因组中的D-木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因。然后将这些菌株用于在厌氧条件下的D-木糖发酵中，如实施例3所述。表1和2以及图8、9和10中总结了结果。
表1实施例5中所述发酵的总结。在120小时厌氧发酵期间，D-木糖的消耗量与同一时间段内乙醇、木糖醇和CO2的生成量的比较
表2实施例5发酵的120小时后乙醇/木糖醇，乙醇/使用的D-木糖和CO2/乙醇的克分子比
实施例6用14C-标记的D-木糖厌氧震动瓶培养D-葡萄糖D-木糖混合物。起始生物质干重为0.365g/l。在水封以保住厌氧的100ml erlenmeyer中用磁力搅拌器30℃下搅拌在如所示D-葡萄糖、D-木糖混合物中的100ml酵母悬液。发酵75小时。发酵后，乙醇从50ml培养基中馏出，并注满至50ml容积。然后通过用Anton-Paar DMA58密度表来检测馏出物的密度来测定总乙醇。根据馏出物的放射性来估计获自D-木糖的乙醇。
所有菌株都来自用XR、XDH和XK整合的菌株，而且均描述于前述参考文献Aristidou，A.，Londesborough，J.，Penttil，M.，Richard，P.，Ruohonen，L.，Sderlund，H.，Teleman，A.and Toivari，M.，Transformed microorganisms withimproved properties PCT/FI 199/00185.WO 99/46363 (1999)。
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195 200 205Gly Lys Asp Trp Arg Gly Gly Arg Ser Cys Gln Gly Asn Ile Ile Pro210 215 220Ser Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Ile Leu Pro Glu Leu225 230 235 240Asn Gly Lys Ile Thr Gly Met Ser Ile Arg Val Pro Thr Ile Asn Ile245 250 255Ser Leu Val Asp Leu Thr phe Arg Thr Ala Lys Lys Thr Ser Tyr Asp260 265 270Asp Ile Met Lys Ala Leu Glu Gln Arg Ser Arg Ser Asp Met Lys Gly275 280 285Val Leu Gly Val Thr Lys Asp Ala Val Val Ser Ser Asp Phe Thr Ser290 295 300Asp Ser Arg Ser Ser Ile Val Asp Ala Lys Ala Gly Ile Glu Leu Asn305 310 315 320Asp His phe Phe Lys Val Leu Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Tyr Gly Tyr325 330 335Ser Ser Arg Val Val Asp Leu Ser Ile Phe Met Ala Gln Lys Asp Phe340 345 350Glu Ala Gly Val35权利要求
1.一种具有增强的实施生物技术工艺的能力的真菌微生物，其特征在于用编码NADP-连接的甘油醛3-磷酸脱氢酶的DNA序列来转化它。
2.根据权利要求1的真菌微生物，其特征在于所述NADP-甘油醛3-磷酸脱氢酶为真菌源性。
3.根据权利要求1或2的真菌微生物，其特征在于所述DNA序列包含SEQ ID No.1或其功能性变体。
4.根据权利要求1-3中任一项的真菌微生物，其特征在于所述生物技术工艺包括L-阿拉伯糖和D-木糖作为碳源。
5.根据权利要求1-4中任一项的真菌微生物，其特征在于所述生物还被处理以抑制其它NADP/NADPH偶联的反应。
6.一种从碳源制备有用工业产品的方法，其特征在于通过根据权利要求1-5中任一项的真菌微生物从所述碳源制备所述有用产品。。
7.根据权利要求6的从碳源制备有用工业产品的方法，其特征在于所述碳源包含戊糖。
8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于所述有用工业产品为乙醇。
9.一种从包含葡萄糖的碳源中制备多羟基丁酸酯的方法，其特征在于使用根据权利要求1-5中任一项的真菌微生物。
全文摘要
本发明涉及具有增强的实施生物技术工艺的能力的真菌微生物。特别地，本发明涉及增强在从含戊糖的生物质制备有用产品的生物技术工艺中氧化还原辅因子的再生。根据本发明，用编码NADP－连接的甘油醛3－磷酸脱氢酶的DNA序列来转化微生物。本发明可用于从生物材料中为人类提供有用产品，所述生物材料包括如农业和林业产品，城市废弃物。这类有用产品的实例为乙醇，乳酸，聚羟基链烷酸酯，氨基酸，脂肪、维生素、核苷酸和种类繁多的酶和药物。
文档编号C12N1/14GK1578831SQ02821762
公开日2005年2月9日 申请日期2002年10月29日 优先权日2001年10月29日
发明者彼得·理查德, 里特娃·韦尔霍, 约翰·隆德斯伯勒, 梅里亚·彭蒂莱 申请人:国家技术研究中心