专利名称：一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法
技术领域：
本发明涉及粘细菌固体发酵制备子实体的工艺方法，具体地说涉及一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。
粘细菌是典型的有机化能营养菌，严格好氧，其生长发育一般分为两个阶段第一个阶段是营养细胞生长期，细胞在适宜生长的培养基上经过一个潜伏期后能够以指数形式生长，也可分散生长，粘细菌的生长速率极慢，代时一般为4~12小时，而其中最具应用潜力的纤维堆囊菌的代时达16小时。营养细胞的生长停止后进入生活周期的第二阶段，即细胞发育期。细胞生长转换需要有三个条件1)营养成分的耗尽，2)细胞位于固体表面，3)高细胞密度。在此条件下，成千上万的细胞向中心聚集，并形成具有种属特异性的多细胞结构，即子实体。因此，高效制备子实体应充分考虑这三个条件。由于大多数种的粘细菌适于在较贫瘠的培养基上生长，而在常用的细菌学培养基上不生长或生长慢，并且粘细菌的子实体也需要营养贫瘠或营养耗尽。目前粘细菌的固体发酵仅是在玻璃培养器皿中的琼脂固体培养基上完成的，很难得到大量的子实体，而且因为工作量太大，不具有工业化生产的可能性。
经过文献和专利的检索，国内外针对上述不足的相关技术和方法至今未见文献或专利报道。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的，具体步骤顺序如下(1)发酵菌株的选择降解纤维素的粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384，ATCC25531，ATCC25569菌株之一。(2)粘细菌一级斜面种子的制备取上述菌株接种于固体斜面培养基上，30℃培养4～7天。培养基成分为大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L，琼脂粉13～17g/L。(3)粘细菌二级种子液的制备取上述一级种子，接种于液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养5～7天。液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20 g/L，CaCl2.2H2O0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L。(4)粘细菌子实体的培养制备将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)内，由滤纸片为碳源和固体介质，形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的粘细菌二级种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养10～15天。(5)子实体的分离待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持30-90分钟，搅拌，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，即得粘细菌子实体。
上述步骤(4)所述的滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸和/或灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸。
上述步骤(4)所述的固体发酵器是可灭菌和供养的大型容器。
上述步骤(4)所述的培养是指在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒pH为7.0～7.2的营养液5～10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。
上述营养液组成为KNO30.5～1.0g/L；Na2HPO40.25～0.5g/L；MgSO4·7H2O 1.0～2.0g/L；FeCl30.01～0.05g/L；琼脂0.5～2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)。
上述营养液pH在灭菌前用KOH或HCl调整。
上述步骤(5)所述的搅拌是指整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为3～10转/分。
上述步骤(5)所述的洗提过程可重复操作3～5遍。
本发明的创造性在于1)通过二级制种，用合理的培养基配方，提高了种子的细胞密度，从而提高了单位滤纸片上的接种量，使子实体形成培养避免了长时间的生长培养，避免长时间培养可能带来的污染合资实体形成能力下降。2)设计了专门用于粘细菌子实体形成的固体培养装置，可以灭菌和供氧，结构简单，操作方便，不采用常规的固体培养基，而是将作为碳源的滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器中形成粘细菌耗氧所需的孔隙支撑，以喷洒营养液的方法提供氮源、无机盐及微量元素，提高了器皿的空间利用效率。3)设计了专门用于子实体分离的洗提器，将生长有子实体的滤纸片放入洗提器中，热水中缓慢搅拌洗提，将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来。
利用本发明可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有产生菌子实体的生长量大，得率高，操作简便易行和价格低廉等特点，并且，开创了高效而经济的粘细菌固体发酵获得子实体的新技术，具备工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
实施例2本实施例提供了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。具体步骤如下(1)发酵菌株的选择能够降解纤维素的粘细菌——纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC25531菌株。(2)粘细菌一级斜面种子的制备取上述菌株接种固体斜面培养基上，30℃培养7天。培养基成分为大豆蛋白胨15g/L，马铃薯淀粉25g/L，CaCl2.2H2O 1.5g/L，MgSO4.7H2O 1.4g/L，Fe-EDTA 10mg/L，琼脂粉17g/L。(3)粘细菌二级种子的制备取一级种子，接种液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养7天。液体发酵培养基的成分包括地瓜淀粉35g/L，水解乳蛋白20g/L，CaCl2.2H2O 1.5g/L，MgSO4.7H2O1.4g/L，Fe-EDTA 10mg/L。(4)粘细菌子实体的培养制备以大滤纸片为碳源和固体介质，该滤纸片为灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸，将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)中形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养15天。在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒营养液10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。营养液的组成包括KNO31.0g/L；Na2HPO40.5g/L；MgSO4·7H2O2.0g/L；FeCl30.05g/L；琼脂2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)；灭菌前用KOH或HCl调pH为7.2。(5)子实体的分离待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持90分钟，整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为6转/分，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，重复操作4遍，即得粘细菌子实体。
实施例3本实施例提供了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。具体步骤如下(1)发酵菌株的选择能够降解纤维素的粘细菌——纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC25569菌株。
(2)粘细菌一级斜面种子的制备取上述菌株接种固体斜面培养基上，30℃培养6天。培养基成分为大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O1.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L。
(3)粘细菌二级种子的制备取一级种子，接种液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养6天。液体发酵培养基的成分包括地瓜淀粉25g/L，水解乳蛋白15g/L，CaCl2.2H2O1.0g/L，MgSO4.7H2O1.0g/L，Fe-EDTA 8mg/L。
(4)粘细菌子实体的培养制备以大滤纸片为碳源和固体介质，该滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸，将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)中形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养12天。在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒营养液7毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。营养液的组成包括KNO30.8g/L；Na2HPO40.4g/L；MgSO4·7H2O 1.5g/L；FeCl30.03g/L；琼脂0.8g/L；微量元素液1.0(V/V)；灭菌前用KOH或HCl调pH为7.2。
(5)子实体的分离待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持60分钟，整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为10转/分，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，重复操作5遍，即得粘细菌子实体。
权利要求
1.一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，实施步骤顺序如下(1)发酵菌株的选择降解纤维素的粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCCl5384，ATCC25531，ATCC25569菌株之一。(2)粘细菌一级斜面种子的制备取上述菌株接种于固体斜面培养基上，30℃培养4～7天。培养基成分为大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA5～10mg/L，琼脂粉13～17g/L。(3)粘细菌二级种子液的制备取上述一级种子，接种于液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养5～7天。液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20 g/L，CaCl2.2H2O0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L。(4)粘细菌子实体的培养制备将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器内，由滤纸片为碳源和固体介质，形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的粘细菌二级种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养10～15天。(5)子实体的分离待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器中，升温至80℃保持30-90分钟，搅拌，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，即得粘细菌子实体。
2.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于步骤(4)所述的滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸和/或灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸。
3.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于步骤(4)所述的固体发酵器是可灭菌和供养的大型容器。
4.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于步骤(4)所述的培养是指在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒pH为7.0～7.2的营养液5～10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。
5.如权利要求4所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于所述的营养液组成为KNO30.5～1.0g/L；Na2HPO40.25～0.5g/L；MgSO4·7H2O1.0～2.0g/L；FeCl30.01～0.05g/L；琼脂0.5～2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)。
6.如权利要求4所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于所述的营养液pH在灭菌前用KOH或HCl调整。
7.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于步骤(5)所述的搅拌是指整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为3～10转/分。
8.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于步骤(5)所述的洗提过程可重复操作3～5遍。
全文摘要
本发明公开了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，它主要是通过粘细菌液体菌种的制备、专用固体培养装置发酵培养、子实体洗提装置水洗提取等工艺环节来大量获得粘细菌子实体。该工艺方法降低了成本，提高了效率，大大提高了工业化生产的可行性和可放大性。
文档编号C12M1/00GK1434117SQ03111900
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者李越中, 韩冠君, 刘新利, 胡玮, 扈锡涛 申请人:山东大学