专利名称：微生物源河豚毒素的制备方法
技术领域：
本发明属于生物制剂制备技术领域，特别涉及微生物源河豚毒素的制备方法。
背景技术：
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的海洋生物活性物质，为非蛋白类神经毒素。该毒素能选择性地与神经和肌肉细胞膜表面的Na+通道上的蛋白质结合，阻断Na+通过，从而影响神经肌肉间兴奋性的传导。在临床上，TTX对头痛、关节炎、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘、等多种病症均有疗效，尤其是TTX还可用于晚期癌症止痛和戒毒，用量少，持效时间长且具有用后不成瘾的优点，因而具有很大的开发价值。
但是，目前国内外所用TTX都是从河豚卵巢等内脏中提取的，而且人工养殖河豚含TTX量极低或无毒，这就存在着原料不足、提取不便等缺点。近年来研究者从多种河豚、毒蟹、毛颚动物等体内、体表分离到可产生TTX的细菌、放线菌，迄今发现能产生TTX细菌种类有弧菌属(Vibrio)、假单孢菌属(Pseudomonas)、发光菌属(Photobacterium)、气单孢菌属(Aeromonas)、邻单孢菌属(Plesionmana)、微球菌属(Micrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Actinobacter)等，放线菌主要是链霉菌属(Streptomyces)，但因产量甚微，很难实现产业化生产。若从自然界或通过遗传工程构建微生物发酵产生TTX的高效表达体系，直接从细菌或放线菌培养物中提取TTX，则可大大提高产量，简化提取程序，实现工业化生产，从而使TTX在临床上的广泛应用成为可能，这将成为国际上研究开发TTX的一条主要途径和发展趋势。国内用海洋微生物发酵产生TTX尚无报导；但从河豚鱼卵巢中提取TTX及TTX检测方法和相关药物开发方面有着良好的基础。近几年，有关TTX的新检测方法报道较多，如高效毛细管区带电泳法、酶联免疫吸附法、反相HPLC(高效液相色谱)法等。在TTX提取工艺及药物开发方面也有相应专利授权，如1991年南开大学研究开发出生物试剂级TTX提取工艺，产品收率高，纯度大于99％；1995年河北省水产研究所开发出TTX半封闭式提取技术，提高效率2-3倍，上柱成功率达100％，回收率77.19％，1999年他们以TTX为主要有效成分研制出一种可作针剂或片剂使用的戒毒药物，有效率达98％；2001年王维国等以TTX为主要成分研制出一种用于戒毒、镇痛的药剂，该制剂用于晚期癌症镇痛有效率达94.2％，用于戒毒脱瘾率达95-100％，无成瘾性和毒副作用。国外也有相关专利授权，1998年美国Brigham妇婴医院与儿童医疗中心联合开发一种局部麻醉剂，制剂中的TTX可显著延长麻醉时间，且安全性好，特异性强。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物源河豚毒素的制备方法，其特征在于利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中提取、纯化河豚毒素，实现微生物源河豚毒素的制备工艺为1).种子液培养将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上25～35℃下活化20～30h，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养20～30h作为种子液；2).发酵将种子液以7％的接种量接种于发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在40～55h，以发酵液pH值达到7.4为发酵指示终点；3).分离、去沉淀立即将合并的发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；4).过滤上清液超滤，去除分子量大于3000 dalton的杂质；浓缩后，冻干；5).成品收集冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后，再经HPLC精制得高纯度TTX。
所述种子培养基的组成为葡萄糖2％，蛋白胨0.6％，酵母粉0.3％，NaCl，0.5％。
本发明的有益效果1.以海洋微生物发酵法产生河豚毒素，成本低，不受季节和原料的限制，不破坏生态平衡；2.通过产毒培养基及产毒条件的优化，提高海洋微生物发酵产河豚毒素的量。3.采用工艺易控制的离心、超滤、柱层析及HPLC等技术，得到高纯度的河豚毒素。
具体实施例方式
本发明为一种微生物源河豚毒素的制备方法。利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中提取、纯化河豚毒素，实现微生物源河豚毒素的制备方法为1).种子液培养将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上25～35℃下活化20～30h，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养20～30h作为种子液；所述种子培养基的组成为葡萄糖2％，蛋白胨0.6％，酵母粉0.3％，NaCl，0.5％。
2).发酵将种子液以7％的接种量接种于发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在40～55h，以发酵液pH值达到7.4为发酵指示终点。
3).分离、去沉淀立即将合并的发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；4).过滤上清液超滤，去除分子量大于3000dalton的杂质；浓缩后，冻干；5).成品收集冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后，再经HPLC精制得高纯度TTX。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明实施例1首先将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上28℃下活化24小时，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养24小时，作为种子液；将种子液以7％的接种量接种于5L发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在48h。发酵结束后，将发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；上清液超滤，去除分子量大于3000 dalton的杂质；浓缩后，冻干得823mg干粉；冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后得62mg粗品，经HPLC精制并冻干后得高纯度TTX 34mg。
取高纯度TTX，以0.1％醋酸溶解，配成浓度为1mg/L的TTX溶液，分别以0.25ml的注射量注射每只昆明鼠(18-20g/只)，共3组，每组12只。注射后小鼠全部死亡，平均死亡时间为16.4分钟，中毒症状与标准TTX相同。
实施例2首先将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上32℃下活化20小时，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养24小时，作为种子液；将种子液以7％的接种量接种于5L发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在45h。发酵结束后，将发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；上清液超滤，去除分子量大于3000dalton的杂质；浓缩后，冻干得796mg干粉；冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后得57mg粗品，经HPLC精制并冻干后得高纯度TTX 37mg。
取高纯度TTX，以0.1％醋酸溶解，配成浓度为1mg/L的TTX溶液，分别以0.25ml的注射量注射每只昆明鼠(18-20g/只)，共3组，每组12只。注射后小鼠全部死亡，平均死亡时间为18.2分钟，中毒症状与标准TTX相同。
实施例3首先将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上25℃下活化30小时，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养24小时，作为种子液；将种子液以7％的接种量接种于10L发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在51h。发酵结束后，将发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；上清液超滤，去除分子量大于3000dalton的杂质；吸液浓缩后，冻干得1,542mg干粉；冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后得113mg粗品，经HPLC精制并冻干后得高纯度TTX 58mg。
取高纯度TTX，以0.1％醋酸溶解，配成浓度为1mg/L的TTX溶液，分别以0.25ml的注射量注射每只昆明鼠(18-20g/只)，共3组，每组12只。注射后小鼠全部死亡，平均死亡时间为20.6分钟，中毒症状与标准TTX相同。
权利要求
1.一种微生物源河豚毒素的制备方法，其特征在于利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中提取、纯化河豚毒素，实现微生物源河豚毒素的制备工艺为1).种子液培养将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上25～35℃下活化20～30h，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养20～30h，作为种子液；2).发酵将种子液以7％的接种量接种于发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在40～55h，以发酵液pH值达到7.4为发酵指示终点；3).分离、去沉淀立即将合并的发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；4).过滤上清液超滤，去除分子量大于3000 dalton的杂质；吸液浓缩后，冻干；5).成品收集冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后，再经HPLC精制得高纯度TTX。
2.根据权利要求1所述微生物源河豚毒素的制备方法，其特征在于所述种子培养基和发酵培养基的组成为葡萄糖2％，蛋白胨0.6％，酵母粉0.3％，NaCl，0.5％。
全文摘要
本发明公开了属于生物制剂制备技术领域的微生物源河豚毒素的制备方法。利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中超滤、离子交换柱层析及HPLC相结合的技术提取，得到高纯度的河豚毒素。以海洋微生物发酵法产生河豚毒素，原料来源广、成本低，不受季节和原料的限制，不破坏生态平衡；工艺易控制，产品纯度高。河豚毒素纯度达99％以上，生物检测法检测其毒性约为4MU/1mg。
文档编号C12N1/20GK1460721SQ03137618
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者张荣庆, 谢莉萍, 刘全永, 王书锦, 胡江春, 马原栋 申请人:清华大学, 中国科学院沈阳应用生态研究所