专利名称：纤溶酶原的酵母表达系统及其纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及Kringle5的表达系统及其纯化工艺。
目前基因重组生产K5多数是利用大肠杆菌为宿主，由于下游纯化工艺相当复杂，成本较高，此外，因原核生物不能进行重组蛋白翻译后的蛋白质折叠加工过程，产品生物活性难以保证。毕赤酵母是近年来发展起来的高效真核表达系统，由于目的基因是整合到酵母染色体上，因而能稳定表达外源蛋白(崔蕴霞，明文玉等，人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达，微生物学报，41(2)244-246，2001)。
在国外已有了K5这方面的专利(http//www.patentpending.com/AMERICANPATENT and TRADEMARK LAW CENTER&http//www.uspto.gov/United StatesPatent and Trademark Office Home Page)。国内也有关研究(陶亦敏，张颉等，人纤溶酶原Kringle5在酵母中的表达及其活性研究，生物技术通讯，13(2)112，2002)，但所得重组K5含有非天然成分，含组氨酸尾，有引起体内免疫反应的可能；由于毕赤酵母转化子之间表达量差异很大，目前还没筛选到高表达菌株，难以满足纤溶酶原Kringle5工业生产的要求。
a)根据K5序列设计引物，通过PCR扩增目的基因。
b)将上述PCR产物与载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌，通过PCR检测，最后测序确认。
c)将构建正确的质粒酶切线性化后转入毕赤酵母(Pichia pastoris)，依次经过营养缺陷初筛和抗性筛选，最后PCR鉴定重组转化子。
d)将重组抗性的转化子接种到液体培养基中，培养后，将菌液离心，再将菌体转接至诱导培养基中进行表达，根据表达量的量化，确认为高效表达Kringle5蛋白的菌株。
该高效表达纤溶酶原Kringle5菌株分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，菌名为GS115，并于2003年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0930。
2)人纤溶酶原Kringle5纯化工艺经过筛选得到的转化子接种到液体培养基上培养，然后将培养得到的菌液转接到诱导培养基上进行诱导表达，最后纯化目的蛋白。
本发明所用到的Taq酶、dNTP、T4DNA连接酶、EcoRI、XhoI、SalI均购自New England Biolabs公司，PCR引物等由上海生物工程有限公司合成，酵母基因组提取试剂盒由杭州维特洁生化公司提供，含目的基因的PET22(b)由马建新(Jian-xing Ma，Department of Ophthalmology，Medical University of South Carolina，Charleston，South Carolina 29403)提供。
以含目的基因的PET22(b)为模板，根据目的基因序列，设计以下引物(即目的基因引物)上游引物序列表中SEQ ID NO.1，下游引物序列表中SEQ ID NO.2。
进行的目的基因扩增，其反应条件为94℃，30s，55℃，45s，72℃，45s，循环30次。在Primer 1引入了Xho I酶切位点(C|TCGAG)，在Primer2引入了EcoRI酶切位点(G|AATTC)。实施例2 重组质粒的构建和大肠杆菌的转化Xho I和EcoR I双酶切扩增的目的基因和PPIC9K载体，并将其连接16℃，过夜连接(10μl目的片断，10μl空载，3μl 10XT4DNA Ligase Buffer，1μl T4DNALigase，6μl无菌水)。连接产物转化E-Coli.DH5a，给布于含氨基的LB平板。分别以目的基因引物，5’和3’AOX引物进行PCR得到270bp和750bp产物，酶切鉴定，最后用测序验证测序。结果表明载体构建正确。其中5’和3’AOX引物分别如序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。实施例3、重组酵母菌的转化、筛选及鉴定将构建正确的重组质粒用SalI线性化后，用电击法转入GS115中，涂布于MD平板上，30℃培养2-3天后，用含不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml)G418 YPD平板筛选高拷贝数的转化子。提取转化子基因组，所用酵母基因组提取试剂盒来自杭州维特洁生化公司。以目的基因为引物PCR后经核酸电泳鉴定，得到预期的270bp条带。表明目的基因已整合到酵母染色体上。实施例4重组蛋白的诱导表达1)将含G418抗性的转化子接种到BMGY液体培养基中，培养至OD值6左右，离心(4000r/min，5min)，将菌体转接至诱导培养基BMMY中进行表达。每隔24h取样并补加甲醇至1％，培养5天后，离心(4000r/min，5min)，收集培养上清。取不同量的培养液上清和溶菌酶进行SDS-DAGE电泳结果表明，目的基因获得高效表达，每升培养液含目的蛋白约200mg经过疏水层分析和分子筛层析，得到目的蛋白一条带，序列见序列表中的SEQ ID NO.5所示。实施例5 重组蛋白的分离纯化将实施例4中所收集到的上清用95％(NH4)2SO4沉淀，沉淀物用0.02M PBS溶解，然后上样到Pheny Sepharose 6 Fast Flow柱(Pharmacia Biotech)上，用0.02MPBS+1.7M(NH4)2SO4到0.02M PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰，浓缩后上Sephadex G-50柱，以0.02M PBS为洗脱液，收集目的组份，冻干。
序列表SEQ ID NO.1序列特征(A)长度27bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述CTTCC TCGAG AAAAG AGATG TAGAG ACSEQ ID NO.2序列特征(A)长度28bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述TAGCG AATTC TTATC AGGCA CACTG AGGSEQ ID NO.3序列特征(A)长度21bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述GACTG GTTCC AATTG ACAAG CSEQ ID NO.4序列特征(A)长度21bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述GCAAA TGGCA TTCTGACATC CSEQ ID NO.5序列特征(A)长度84个氨基酸；(B)类型氨基酸；(C)拓补结构线性分子类型多肽序列描述DCMFGNGKGY RGKRVTTVTG TPCQDWAAQE PHRHSIFTPE TNPRAGLEKNYCRNPDGDVG GPWCYTTNPR KLYDYCDVPQ CAAP
权利要求
1.一种毕赤酵母菌株，其特征是能高效表达纤溶酶原Kringle5。
2.如权利1所述的毕赤酵母菌株，其特征是所述的纤溶酶原Kringle5为人源纤溶酶原Kringle5。
3.如权利1所述的毕赤酵母菌株，其特征是所述的纤溶酶原Kringle5其序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
4.如权利3所述的毕赤酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No.0930。
5.一种筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是该方法包括以下步骤a)根据Kringle5序列设计引物，通过PCR扩增Kringle5基因；b)将上述PCR产物与载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌；c)将构建正确的质粒转入毕赤酵母，经过营养缺陷初筛，然后经过抗性筛选，最后鉴定重组转化子；d)将重组的抗性转化子接种到液体培养基中培养，然后将菌液离心，再将菌体转接至诱导培养基中表达。
6.如权利5所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤a)中PCR所用的模板为含Kringle5蛋白基因的PET22(b)质粒，上游引物和下游引物分别为SEQ NO1和SEQ NO2。
7.如权利5所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤d)液体培养基为BMGY，诱导培养基为BMMY。
8.如权利5所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤b)中离心条件为4000r/min，离心时间5min。
9.一种从高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株中的纯化纤溶酶原Kringle5工艺，其特征是包括如下步骤将诱导表达的菌液离心，取上清；(NH4)2SO4沉淀；PBS溶解；一次过柱；梯度洗脱缓冲液洗脱；收集目的蛋白峰；浓缩，二次过柱；再洗脱；收集目的组分，冻干。
10.如权利9所述的纯化纤溶酶原Kringle5工艺，其中所述离心条件为4000r/min，5min；所述(NH4)2SO4浓度为0.02M；一次过柱柱子为Sepharose6 Fast Flow；梯度洗脱缓冲液为0.02M PBS+1.7M(NH4)2SO4到0.02M PBS；二次过柱所用柱子为Sephadex G-50；洗脱液为0.02M PBS。
全文摘要
本发明提供一种高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株及其获得方法，并提供了纤溶酶原Kringle5纯化工艺。本发明通过PCR扩增、连接、转化、抗性筛选等步骤，最终获得高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株。本发明所提供的纤溶酶原Kringle5纯化工艺包括离心、沉淀、过柱等步骤，其特点是操作简单、产率高。本发明所获得的产物纤溶酶原Kringle5蛋白不含非天然成分，应用时一般不会引起免疫反应。
文档编号C12N15/58GK1456662SQ0313740
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者顾军, 邹宇飞, 郑权 申请人:北京大学