专利名称：具有至少一个电极的容器的制作方法
权利要求书(按照条约第19条的修改)1.用于接收水溶液，特别是细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的容器(20、30)，至少部分通过形成用于接收所述溶液的内腔(22、32)的外边界(21)形成，并包含施加电压时作为电极(25、26、33、34)和接着发生放电的至少一个区域，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由至少基于掺杂至少一种导电物质的塑料的导电合成材料制成，且所述塑料中所述掺杂物的总浓度为40-80％w/w。
2.根据权利要求1的容器，其特征是所述掺杂物由碳纤维、石墨、碳黑和/或碳纳米管组成。
3.根据权利要求1或2的容器，其特征是所述塑料中的所述掺杂物的总浓度为40-60％w/w，优选的50-60％w/w，特别是55-60％w/w。
4.根据权利要求1或2的容器，其特征是所述塑料中的所述掺杂物的总浓度为50-80％w/w，优选的60-80％w/w，最优选的70-80％w/w，特别是74-76％w/w。
5.根据权利要求1至4任何一个的容器，其特征是所述塑料是聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚酰胺、聚苯硫或这些聚合物的混合物，或至少基于一种或多种这些聚合物，和/或所述塑料是本身导电的合成材料。
6.根据权利要求5的容器，其特征是所述本身导电的合成材料是聚苯胺、多炔、对聚苯、对聚苯硫、聚吡咯、聚噻吩、聚丙烯或类似物，或至少基于一种或几种这些聚合物。
7.根据权利要求1至6任何一个的容器，其特征是所述外边界(21、31)由合成材料，优选的由透明塑料制成。
8.根据权利要求7的容器，其特征是所述外边界(21、31)由与所述至少一个电极(25、26、33、34)基于的塑料相同的塑料制成。
9.根据权利要求1至8任何一个的容器，其特征是所述至少一个电极(25、26、33、34)集成到所述外边界(21、31)中。
10.根据权利要求1至9的任何一个的容器，其特征是包含至少两个由相同材料制成的电极(25、26、33、34)。
11.根据权利要求1至10任何一个的容器，其特征是至少两个电极(25、26、33、34)由不同材料制成。
12.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂25-45％w/w，优选的30-40％w/w，特别是33-37％w/w碳纤维和15-35％w/w，优选的20-30％w/w，特别是23-27％w/w石墨的聚酰胺，特别是聚酰胺66或聚酰胺6制成。
13.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂30-50％w/w，优选的35-45％w/w，特别是39-41％w/w碳纤维和25-45％w/w，优选的30-40％w/w，特别是34-36％w/w石墨的聚酰胺，特别是聚酰胺66或聚酰胺6制成。
14.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂15-40％w/w碳纤维和1-40％w/w石墨的聚碳酸酯制成。
15.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂40-50％w/w碳纤维的聚醚醚酮制成。
16.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂40％w/w碳纤维的聚酰胺，优选的聚酰胺66制成。
17.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂40％w/w碳纤维的聚丙烯制成。
18.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂40-50％w/w碳纤维的聚苯硫制成。
19.根据权利要求1至18任何一个的容器，其特征是所述外边界(21、31)包含至少一个供给所述溶液的开口和至少一个排出所述溶液的开口。
20.包含至少两个，优选的6、12、24、48、96或更多个根据权利要求1至18的任何一个的容器(20、30)，其特征是并相互连接构成一个单元的容器组。
21.根据权利要求1至20任何一个的容器或容器组的制造方法，其特征是所述容器(20、30)或所述容器组通过双组分注模法制造，先注模留下一个凹陷窗的外边界(21、31)，接着将由掺杂的塑料制成的导电合成材料注模到所述至少一个窗中，或先用所述掺杂的塑料注模所述至少一个电极(25、26、33、34)，接着在所述至少一个电极(25、26、33、34)周围注模所述外边界(21、31)。
22.通过电流处理细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的方法，特别是电穿孔或电熔化的方法，其特征是包括a)将所述细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡转移到至少一个根据权利要求1至19的任何一个的容器(20、30)或根据权利要求20的容器组的至少一个容器的内腔(22、32)中，其特征是所述容器(20、30)包含至少一个由掺杂的合成材料制成的电极(25、26、33、34)，和至少一个另外的电极(25、26、33、34)，和b)向所述电极(25、26、33、34)施加电压并在所述容器(20、30)的所述内腔(22、32)中产生电流。
23.根据权利要求22的方法，其特征是所述电流达到最高120A/cm2，优选的80A/cm2的电流密度。
24.根据权利要求22或23的方法，其特征是生物活性分子，特别是核酸，溶解在所述溶液中，并通过场强2-10kV*cm-1，宽度10-200μs的电压脉冲实现所述生物活性分子到活细胞中的转移。
25.根据权利要求24的方法，其特征是所述生物活性分子向所述细胞中的所述转移通过紧接所述电压脉冲的、电流密度为2-14 A*cm-2，优选5A*cm-2、宽度为1-100ms，优选的50ms的电流实现。
在合成材料的可注模性方面，如果塑料是聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚酰胺、聚苯硫或这些聚合物的混合物，或至少基于一种或几种这些聚合物，和/或其中所述塑料是本身导电的合成材料，已证明特别有益。在这方面，采用聚酰胺66或聚酰胺6尤其有益。
如果合成材料本身掺杂了本身导电的合成材料，就提供了一个有益的实施方案，其中本身导电的合成材料是聚苯胺、多炔、对聚苯、对聚苯硫、聚吡咯、聚噻吩、聚丙烯等，或至少基于一种或几种这些聚合物。
在本发明另一个有益的实施方案中，外边界由合成材料，优选的透明塑料制成，因为这样就能用注模法制造整个容器。如果外边界由至少一个电极基于该塑料的相同塑料制成，在这方面就是有益的。在该实施方案中，用双组分注模处理该合成材料是有益的。因此，一方面简化了制造，另一方面降低了制造成本。然而，对于特殊应用，外边界也可由其他材料构成。
在本发明的一个特别有益的实施方案中，将至少一个电极集成在所述外边界中，使该容器能在一个模具中注模。
在本发明一个优选的实施方案中，容器包含至少两个用相同材料制成的电极。大部分应用分别使用具有两个由相同材料构成的相对布置的平行电极的容器和比色杯。这两个电极以合适的方式接触，从而连接到适应各自要求的电压源上。然而，在特殊情况下，如果至少两个电极由不同材料制成也是有益的。在这些情况下，阴极或阳极可由掺杂的合成材料构成，而各自的反电极可由另一种材料，例如不锈钢或本身导电的合成材料构成。
包含由根据权利要求12至18任何一个的导电合成材料制成的电极的容器被证明对于活细胞的转染特别有益。这些容器具有与很容易加工的电极材料结合的高电导率。
在本发明一个作为选择的实施方案中，外边界包含供给溶液的至少一个开口和倒出溶液的至少一个开口。因此根据本发明的容器也能用作流过容器，其中溶液连续或断续地流过内腔。
根据本发明的容器也有益地适合于包含至少两个，优选的6、12、24、48、96或更多个连通容器的容器排列形式，以构成一个单元，即所谓的“多井”。本发明一个特别的优点是，根据本发明的容器或容器排列可用一种方法制造，其特征是容器或容器排列通过双组分注模法制造，首先注模法形成外边界，并留下一个凹陷窗，接着将由掺杂塑料制成的导电合成材料注模到该至少一个窗口中，或首先用掺杂塑料注模形成至少一个电极，接着围绕至少一个电极注模外边界。在具有由金属构成的电极的容器或比色杯的制造中，不得不在容器成型前或成型后将电极手动或自动置于模压框或模具中，相反，本发明提供了非常容易和低成本的制造方法。根据本发明的容器或容器排列可在两步法中在一个模具中注模，使其制造成本明显低于电穿孔或电熔化比色杯的常规制造成本。
有益的是，根据本发明的容器或容器排列特别适用于细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的借助电流的处理方法中，尤其是电穿孔或电熔化中，其特征是将细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡转移到至少一个容器或容器排列的至少一个容器的内腔中，所述容器包含至少一个由掺杂的合成材料制成的电极，和至少一个另一个电极，然后将电压施加到所述电极上，并在所述容器的内腔中产生电流。在该方法中，电流可达到最高120A/cm2，优选的80A/cm2的电流密度，且细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡可以悬浮液，或附着状态或以其他固定条件提供。
因此，除其他可能的应用外，根据本发明的容器或容器排列适合例如电穿孔，即用电流将生物活性分子引入活细胞中的方法，其特征是生物活性分子，特别是核酸，溶解在所述溶液中，并借助场强2-10kV*cm-1，持续时间10-200μs的电压脉冲实现所述生物活性分子到活细胞中的转移。接着可提供电流密度2-14A*cm2，优选的5A*cm-2，宽度1-100ms，优选的50ms的所述电压脉冲后面的不间断电流。在该方法中，可采用例如悬浮液中的或作为附着的细胞层的细胞。
根据本发明的容器或容器排列也适合于例如电熔化，例如用电流熔化细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的方法，其特征是细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡例如以适当密度悬浮在水溶液中，所述悬浮液接着转移到根据本发明的容器或容器排列中，最后向电极施加电压，产生通过溶液的电流。作为选择，例如，也可以熔化附着细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡，以及例如带有悬浮的细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的附着细胞。
以下参考附图详细描述本发明。
在附图中
图1表示用于说明本发明的试验组件的透视图。
图2表示采用根据本发明的电极的放电电流，该电极由包含20％碳纤维和15％石墨的聚碳酸酯(电极厚度为1.65mm的PC+CF+Gr)制成，与使用铝制电极比较，分别用两种不同的缓冲溶液(溶液A100mM磷酸钠，pH7.1，和25mM氯化钾；溶液B140mM磷酸钠，pH7.1；纵坐标电流，每格1A；横坐标时间，每格10ms)。
图3是通过插入铜导线改进图1的试验组件的透视图。
图4表示采用由包含20％碳纤维的聚碳酸酯(电极厚度2mm)制成的电极，并使用根据图1(a)和图3(b)的试验组件的放电电流，纵坐标电流，每格1A；横坐标时间，每格10ms。
图5表示采用与铝制电极不同的根据本发明由合成材料制成的电极对转染的CHO细胞(中国田鼠卵巢细胞)进行的流动-血细胞计数分析图表，a)每25000个细胞中转染细胞的数量，b)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的百分比，PC/CF/Gr＝具有1.65mm电极厚度的聚碳酸酯+20％碳纤维+15％石墨，PEEK/DF＝具有1mm电极厚度的聚醚醚酮+40％碳纤维。
图6表示采用与铝制电极不同的根据本发明由合成材料制成的电极对转染的HL-60细胞(人体淋巴细胞)进行的流动-血细胞计数分析图表，a)每15000个细胞中转染细胞的数量，b)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的百分比，PC/CF/Gr＝具有1.65mm电极厚度的聚碳酸酯+20％碳纤维+15％石墨，PEEK/DF＝具有1mm电极厚度的聚醚醚酮+40％碳纤维。
图7表示采用与铝制电极不同的根据本发明由合成材料制成的电极对转染的Jurkat细胞(人体T细胞线)进行的流动-血细胞计数分析图表，a)每25000个细胞中转染细胞的数量，b)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的百分比，PA/CF＝具有1mm电极厚度的聚酰胺66+30％碳纤维。
图8表示采用与铝制电极不同的根据本发明由合成材料制成的电极对转染的HUVEC细胞(人体脐状电缆静脉内皮细胞)进行的流动-血细胞计数分析图表，a)每15000个细胞中转染细胞的数量，b)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的百分比，PPS/CF＝聚苯硫+40％碳纤维。
图9是用a)铝制电极和b)聚苯硫+40％碳纤维制成的电极电穿孔两天后CHO细胞培养(CHO＝中国田鼠卵巢细胞)的显微照片。
图10表示在经不同处理的溶液中培育后HUVEC细胞(人体脐状电缆静脉内皮细胞)的流动-血细胞计数分析图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)沾染了羧基荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺基酯(CFDA-SE)的活细胞的数量，PA/CF＝具有1mm电极厚度的聚酰胺66+30％碳纤维，PC/CF/Gr＝具有1.65mm电极厚度的聚碳酸酯+20％碳纤维+15％石墨。
图11表示在经不同处理的溶液中培育后CHO细胞培养(中国田鼠卵巢细胞)的流动-血细胞计数分析图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)沾染了羧基荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺基酯(CFDA-SE)的活细胞的数量，PP/CF＝具有1mm电极厚度的聚丙烯+20％碳纤维，PPS/CF＝聚苯硫+40％碳纤维，PA/CF＝具有1mm电极厚度的聚酰胺66+30％碳纤维。
图12是根据本发明的容器的一个可能的实施方案的透视图表示。
图13是比色杯形式的根据本发明的容器的另一个实施方案的剖视图(a)和透视图(b)表示。
图14表示与铝制电极比较，用根据本发明的合成材料(PA6)制成的电极电穿孔后，HL-60细胞(人体淋巴细胞)的流动-血细胞计数分析图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)转染的活细胞的数量，未处理的＝分别不施加电压脉冲。
图15表示采用根据本发明的合成材料(PA6)制成的电极，与铝制电极比较，电穿孔后CD3+T细胞的流动-血细胞计数分析的图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)转染的活细胞的数量，分别带有或不带有媒介物pH2-Kk。
图16表示采用根据本发明的合成材料(PA6)制成的电极，与铝制电极比较，电穿孔后HUVEC细胞(人体脐状电缆静脉内皮细胞)的流动-血细胞计数分析图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)转染的活细胞的数量，未处理的＝分别不施加电压脉冲，和图17表示采用根据本发明的合成材料(PA66和PA6)制成的电极，与铝制电极比较，电穿孔24和96小时后HL-60细胞(人体淋巴细胞)的流动-血细胞计数分析的图表，a)沾染了碘化丙啶的死亡细胞的数量，b)转染的活细胞的数量，未处理的＝分别不施加电压脉冲。
图1表示分别说明本发明和测试根据本发明的容器的试验组件1的透视图。试验组件1相当于根据本发明的容器的结构，并包含分离板2和压在分离板2两面上的两个电极3、4。分离板2是由厚度2mm的特富龙制成的板，具有U形凹槽5。电极3、4由搀杂至少一种导电物质的合成材料构成。该合成材料可以是例如聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚酰胺、聚苯硫或这些聚合物的混合物和/或本身导电的合成材料。包括分离板2和两个电极3、4的三层由铜板6、7象三明治一样压在一起。为此，铜板6、7通过虎钳状装置的螺纹部件8、9(未示出)相向移动。当上述层压在一起时，就在凹槽5的范围内形成内空10，从而分别具有了接收溶液和细胞的能力。在所述模型中，内空10可接收100ml容积。通过分离板2的内边11的底部和两侧，以及电极3、4的两个剩下的边，进一步形成内空10。铜板6、7通过两根导线与常用的电穿孔装置，即电压源的弹簧接头电接触。电极3、4本身通过其整个外表面与铜板直接接触，以保证最佳的电接触。这样，采用所示的试验组件1，如果向铜板6、7施加电压脉冲，电极3、4之间的电流就分别穿过充满了溶液和细胞悬浮液的内空10。
图2表示与采用铝制电极比较，采用根据本发明的由聚碳酸酯与20％碳纤维和15％石墨(PC+CF+Gr)制成的电极放电的电流。在该方法中，测量通过两种不同缓冲溶液(溶液A100mM磷酸钠，pH7.1和25mM氯化钾；溶液B140mM磷酸钠，pH7.1)的电流。1000V和40μs宽度的第一个电压脉冲后一般紧接着90V起始电压(U起始)和75mC电荷的第二个脉冲。第二个脉冲相应的电流示于该图表中。令人吃惊的是，它证明了如果采用由根据本发明的合成材料制成的电极，在相同条件下，可实现与用常用的铝制电极实现的类似大小的电流(比较a和c)。因此搀杂合成材料特别适合于在短时间内传导高的电流密度。与采用含有氯化物的磷酸盐缓冲液(溶液A)比较，采用不含氯化物的磷酸盐缓冲液(溶液B)，在放电期间，在铝制电极表面越发产生了非常高的电阻，导致在相同初始电流下的电流急剧减小(b)。这种负面影响在采用搀杂的合成材料时并没有发生(d)，使得与常用的比色杯相反，根据本发明的容器或电极也适用于不含氯化物的磷酸盐缓冲液。因此，采用根据本发明的容器没有象采用传统容器那样对缓冲溶液选择的限制。
图3表示与根据图1的试验组件比较有所改进的试验组件12的透视图。根据图1的试验组件1表示电极3、4通过铜板6、7用较高压力大面积接触的排列方式。由于电极外侧与例如传统的电穿孔装置的接触往往不以如此高的压力在如此大的表面上进行，因此在该试验组件12中，接触电极的表面设计得很小。因此，该组件更相当于通过弹簧接触方式接触，从而更等价于实际的真实条件。为此，将直径约1.5mm的环形或V形弯曲铜导线13、14置于电极3、4与各自相邻排列的铜板6、7之间。以下图4表示采用根据图1和图3的试验组件时的电流比较。
图4表示将由包括20％碳纤维的聚碳酸酯制成的电极用于根据图1的试验组件(a)，以及用于根据图3的试验组件(b)时的放电电流。通常表示第二脉冲的电流(1、脉冲100V，40μs；2、脉冲U起始＝90V，75mC)。这种恒定结果明显表明，电位很容易分布在电极内侧上，因此其接触面并不是导电率方面的限制因素。
图5表示转染的CHO细胞的流动-血细胞计数分析图表。转染试验用图1中描述的试验布置进行，以便从生物学上测定根据本发明容器的功能。为此，将CHO细胞悬浮在100μl合适的缓冲溶液，例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)中，加入5μg表达质粒pH-2Kk(对老鼠MHC的1类蛋白质的重链进行编码的DNA媒介物)，然后转移到试验组件的内部空间中。然后通过施加两个脉冲(1、脉冲1000V，100μs；2、脉冲U起始＝108V，100mC)对细胞进行电穿孔。随后除去细胞悬浮液，转移到合适介质，例如RPMI介质中，并在37℃和5％CO2下培育20小时后收获。用PBS清洗，并用PBS中的0.1％胰蛋白酶+2mM亚乙基二胺四乙酸酯除去附着的CHO细胞。表达式H-2Kk用抗体着色(PBS中的1∶100抗-H-2Kk(Becton Dickinson)+1∶50 beriglobine(Aventis Behring)，室温下10分钟)揭示。死亡细胞用0.25μg/ml的碘化丙啶着色。分析在流动-血细胞计数计(FACScalibur，Becton Dickinson)中进行。图表a)和b)显示，采用搀杂合成材料电极(PC/CF/Gr＝聚碳酸酯+20％碳纤维+15％石墨，PEEK/DF＝聚醚醚酮+40％碳纤维)，至少可获得在转染效率方面与采用铝制电极类似的结果。如果采用根据本发明的电极，由于显著降低的死亡率，因为转染效率与死亡率的比值更好，实现了与采用传统电极比较很明显的优点。
图6表示转染的HL-60细胞(人体淋巴细胞)的流动-血细胞计数分析图表。该方法的实现和条件与图5中描述的相当，不同的是修改了电穿孔期间的电压脉冲(此处1、脉冲1000V，70μs；2、脉冲U起始＝81V，22mC)。在该方法中，用搀杂的合成材料制成的电极可获得至少与采用铝制电极类似的结果。
图7表示采用根据本发明由搀杂了30％碳纤维的聚酰胺66制成的电极对转染的Jurkat细胞(人体T细胞线)进行的流动-血细胞计数分析的图表。电穿孔在含有5μg质粒pEGFP-C1、不含酚红的100μl RPMI介质中，通过150V和5μs的脉冲，然后通过起始电压108V和电荷80mC的脉冲进行。该分析在4小时后进行。同样在该实施例中，与采用传统的铝制电极比较，通过使用根据本发明的搀杂的合成材料制成的容器或电极，能显著提高转染效率以及存活率。因此，图5-7中表示的结果清楚地证明，与传统的比色杯比较，如果采用根据本发明的容器，能显著提高电穿孔中的转染效率，并显著降低死亡率。令人吃惊的是，这一点主要可通过这样的事实解释，即采用根据本发明的电极能保证类似的电流，但能避免由于从电极释放金属离子，从而对细胞产生中毒作用的公知的缺点。
图8表示与传统的铝制电极比较，采用根据本发明由含有40％碳纤维的聚苯硫制成的电极，对转染的HUVEC细胞(人体脐状电缆静脉内皮细胞)进行的流动-血细胞计数分析图表。转染在包括5μg/100μl质粒DNA的细胞特定介质中进行，其特征是在该方法中，施加各种电压脉冲，以补偿搀杂的合成材料稍微降低了的导电率(用于PPS/CF的脉冲1000V，100μs；用于铝的脉冲500V，100μs)。培育60小时后，对细胞进行流动-血细胞计数测试，用于荧光蛋白质的表达。在该方法中还用0.25μg/ml碘化丙啶沾染死亡细胞。结果表明根据本发明的容器通常也适合于主要的人体细胞。同样在该方法中，转染效率与死亡率的比值优于采用传统铝制电极。这种影响可通过提高施加电压，以有效增大搀杂的合成材料的电阻的补偿而进一步增强。通过这种测量，如果采用搀杂合成材料制成的电极，可适应细胞悬浮液中的电条件，并进一步提高转染效率。
图9是通常在用铝制电极(a)和包含40％碳纤维的聚苯硫制成的电极(b)电穿孔两天后，CHO细胞培养的显微照片。同样在该方法中，通过提高第一和第二电压脉冲(PPS/CF1000V，100μs和U起始＝108V，100mC；铝500V，100μs和U起始＝76V，60mC)，可补偿搀杂合成材料制成的电极略低的导电率。当采用铝制电极时可清楚地看见沉淀，某些沉淀用a)中的插入箭头标明。这些颗粒沉淀在细胞上。但如果采用搀杂合成材料制成的电极，就看不见那些颗粒，从而通过使用根据本发明的容器可明显避免颗粒的沉积。这一事实对细胞的成活率有积极的影响，也有利于细胞的进一步处理。因此也增强了电穿孔产物的医学相容性，使得例如转染的原始细胞对于体外基因疗法的可能应用变得特别有益。
图10和11各表示在不同处理溶液中培育的细胞的流动-血细胞计数分析(图10HUVEC细胞，图11CHO细胞)图表。将根据本发明的容器充满诸如PBS的不含细胞的单一缓冲溶液，并连续三次暴露在高压脉冲下(铝500V，100μs和U起始＝115V，100mC；搀杂的合成材料1000V，100μs和U起始＝95V，112mC)，以便分析放电期间能从搀杂合成材料制成的各种电极和铝制电极释放出的可能的细胞损坏成分的影响，以及除它们直接的影响外，揭示刚施加脉冲后对细胞培养的其他影响。然后将100μl通过各种电极施加了脉冲的溶液加入400μl培养介质(EGM-2 BulletKit/Clonetics)中。HUVEC细胞(18小时后的值5×101个细胞，96小时后的值2.5×104个细胞)和CHO细胞(20小时后的值105个细胞，72小时后的值2×104个细胞)分别转移到这些介质中的24井板中。在37℃和5％CO2下培养不同时间后，分别进行流动-血细胞计数测定死亡细胞和活细胞的数量。用PBS中的1mM乙烯基二胺四乙酸酯中的1μg/ml胰蛋白酶除去细胞，并除去这些细胞与培养液上层清液的混合物后，加入0.25μl/ml碘化丙啶，测定死亡细胞。为了粘染活细胞，加入PBS+0.5％血牛清清蛋白中的0.2μM羧基荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺基酯(CFDA-SE)，并在流动-血细胞计数分析前在室温下培养2分钟。为了测量一个探针中细胞的总数，加入确定量的流量计数氟球珠(Beckman Coulter)，它能在FACS中从细胞区分开。可以这种方式从细胞的计数值推断出一个井中的总容积。图10和11中所示结果表示，采用搀杂合成材料制成的电极与铝制电极比较略显优势。特别是在4天后，用合成材料制成的电极脉冲的溶液在CHO细胞的存活和生长方面更有益。对于HUVEC细胞，24小时后已经能观察到采用塑料电极比传统铝制电极产生的积极影响。这样，这些结果表明搀杂合成材料制成的电极在细胞损害成分的释放方面具有更好的相容性，其中电流过后的负面影响已在该方法中进行了研究。由于避免了有毒金属离子的释放，根据本发明的容器又额外实现了更好的生物学相容性。因此，这些主要是关于转染细胞的更多用途，例如变换的主要细胞在体外基因疗法中的用途，比传统容器或比色杯明显更有益。
图12表示根据本发明的容器的一种可能的实施方式的透视图。所示容器20通常形成类似传统的比色杯。该容器由构成内腔22的外边界21形成，该内腔22具有接收水溶液的能力。例如，细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡能悬浮在该水溶液中。除水溶液或悬浮液外，该容器也可包含例如附着细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡。在外边界21的两个平行相对排列的侧壁23、24中布置了两个平行电极25、26。两个电极25、26都由根据本发明搀杂了至少一种导电物质的合成材料制成。搀杂物可由例如碳纤维、石墨、炭黑、碳纳米管或本身导电的合成材料，或一种或几种这些同样的物质的结合组成。外边界21由不导电的透明塑料构成。由于所有成分都具有可注模性，因此根据本发明的容器20可用双成分注模法制造。此时，首先用不导电塑料注模外边界21。将同样可注模的搀杂合成材料通过注模通道27、28注模到凹陷窗(看不见)中。因此，能非常简单和低成本地制造根据本发明的容器20。如果将这种类似比色杯的容器20用于传统装置中，基本上是有益的。然而，根据应用类型不同，根据本发明的容器包含无论如何都讲得通的所有可能实施方式。
图13表示根据本发明的容器可能的实施方式的透视图(b)，以及该容器的纵剖面图(a)。所示容器30也类似比色杯形成。该容器通过构成内腔32的外边界31形成，所述内腔32起到接收水溶液的作用。在外边界31的两个平行相对排列的侧壁35、36中布置了两个平行电极33、34。两个电极33、34都由根据本发明搀杂了至少一种导电物质的例如聚酰胺66或聚酰胺6的合成材料构成。在本发明一个有益的实施方式中，搀杂物可以是例如碳纤维与石墨的混合物。外边界31由不导电的透明塑料构成。因为所有成分的可注模性，根据本发明的容器30可用双成分注模法制造。因此，首先可用不导电塑料注模外边界31。同样可注模的搀杂合成材料可随后通过注模通道37、38注模到凹陷窗中。因此，能以这种方式非常简单和低成本地制造根据本发明的容器30。在容器30下半部分设置了倾斜部分39，它使该容器能与所用装置对应的接收元件，即电穿孔器的几何形状匹配。此外，电极33、34之间的距离可通过倾斜部分39的不同设计改变，从而可改变正向电阻。
图14至16表示采用具有根据本发明的、相互间距离为1.5mm的电极的根据图13的比色杯的转染细胞的流动-血细胞计数分析图表。这些容器与具有电极间距离为2mm的铝制电极的比色杯比较直接进行测试。由于电极间的距离减小了25％，搀杂塑料相当于铝更高的电阻得到补偿，以便有效地实现单位截面积上相同的导电率。采用聚合物比色杯的试验过程与用铝的过程对应，其中采用有黄铜制弹簧触点的电穿孔器(NucleofectorTMI，amaxa GmbH，Cologne)。常用细胞特定套件NucleofectorTM(amaxa GmbH，Cologne)作为接收细胞的溶液。根据本发明的比色杯通常含有由搀杂约38-42％w/w碳纤维和约33-37％w/w石墨(搀杂物的总体浓度约70-80％w/w)的聚酰胺(PA6或PA66)组成的电极。
图14表示与铝制电极比较，采用根据本发明的聚合物电极(PA6)电穿孔后，HL-60细胞(人体淋巴细胞)的流动-血细胞计数分析图表。将2μgpEGFP-C1 DNA(Clontech)加入每个包括106HL-60细胞(ATCC)的100μl溶液探针中。向含有这些探针的不同比色杯施加两个电压脉冲(1000V，100μs和U起始＝90V，75mC)，然后立即在37℃/5％CO2的恒温箱中，在含有L-谷氨酰胺和20％胎儿小牛血清(Gibco)的Iscove改性的Dulbecco介质中培养。24小时后收获细胞，并向每个探针加入碘化丙啶和25000 APC标记的微珠(BectonDickinson)。这样就能在流动-血细胞计数计(FASCalibur，Becton Dickinson)中测定基于每个探针中细胞的绝对数量的碘化丙啶粘染的细胞和转染的细胞。由此可知，与带有铝制电极的传统比色杯比较，通过采用根据本发明的比色杯，能明显提高转染效率，并能略微降低死亡率。
图15表示与铝制电极比较，用根据本发明的聚合物电极(PA6)电穿孔后，CD3+T细胞的流动-血细胞计数分析图表。向每个含有5×106新鲜分离的PBMC的100μl溶液探针中加入2μg的pH-2KK(老鼠MHC I重链)。向含有这些探针的不同比色杯连续施加两个电压脉冲(1000V，100μs和U起始＝96V，56mC)，然后直接置于37℃/5％CO2恒温箱中含有10％胎儿小牛血清(Gibco)的AIM-V介质中培养。24小时后收获细胞，并向每个探针加入碘化丙啶和25000 APC标记的微珠(Becton Dickinson)。另外，用荧光素-异硫代氰酸酯粘染的抗-H-2Kk抗体(Becton Dickinson)，和与APC(Becton Dickinson)偶合的抗人体T细胞特定的CD3抗原的抗体粘染细胞。这样就能在流动-血细胞计数计(FASCalibur，Becton Dickinson)中测定基于每个探针中细胞绝对数量的碘化丙啶粘染的细胞和转染的T细胞。由此可实现近乎类似的结果。
图16表示与铝制电极比较，用根据本发明的聚合物电极(PA6)电穿孔后，人体脐状电缆静脉内皮细胞(HUVEC)的流动-血细胞计数分析图表。向每个含有6.8×10°HUVEC细胞的100μl溶液探针中加入2μg的pEGFP-C1 DNA(Clontech)。向含有这些探针的不同比色杯连续施加电压脉冲(1000V，100μs)，然后直接置于37℃/5％CO2恒温箱中用于内皮细胞的EGM-2(Clonetics)介质中培养。24小时后收获细胞，并向每个探针加入碘化丙啶和25000 APC标记的微珠(Becton Dickinson)。这样就能在流动-血细胞计数计(FASCalibur，Becton Dickinson)中测定基于每个探针中细胞绝对数量的碘化丙啶粘染的细胞和转染的T细胞。由此可知，用根据本发明的比色杯代替带有铝制电极的传统比色杯，能提高转染效率，并降低死亡率。
图17表示与铝制电极比较，采用根据本发明的聚合物电极(PA66和PA6)电穿孔24和96小时后，HL-60细胞(人体淋巴细胞)的流动-血细胞计数分析图表。分析条件和方法通常与图14中描述的一致，不同的是铝制比色杯以及根据本发明的比色杯的电极间距为2mm。此处所用比色杯还分别具有由搀杂了约33-37％w/w碳纤维和约23-27％w/w石墨的聚酰胺(搀杂物的总浓度约55-65％w/w)制成的电极。为了补偿聚合物电极较高的电阻，此处采用不同的脉冲参数(合成材料1000V，100μs和U起始＝102V，75mC和铝800V，100μs和U起始＝90V，75mC)。同样在该方法中，通过采用根据本发明的聚合物电极，可稍微提高转染效率，并能略微降低死亡率。
所用缩写列表A 安培C 库仑CHO中国田鼠卵巢cm 厘米DNA脱氧核糖核酸
Gew.-％重量百分比h 小时HL-60 人体淋巴瘤60HUVEC 人体脐状电缆静脉内皮细胞kV 千伏mC 毫库仑mM 毫摩尔ms 毫秒PA 聚酰胺PBMC 球形血液单核细胞PBS磷酸盐缓冲的盐水pH 氢离子浓度的负对数PJ 碘化丙啶RNA核糖核酸RPMI 罗斯维尔公园纪念研究院μg微克μl微升μs微秒U 电压UAnfang电压起始V 伏参考号列表1 试验组件
2 分离板3 电极4 电极5 凹槽6 铜板7 铜板8 螺纹部件9 螺纹部件10 内空11 内边12 试验组件13 铜导线14 铜导线20 容器21 外边界22 内腔23 侧壁24 侧壁25 电极26 电极27 注模通道28 注模通道30 容器
31 外边界32 内腔33 电极34 电极35 侧壁36 侧壁37 注模通道38 注模通道39 倾斜部分
权利要求
1.接收水溶液，特别是细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡的容器(20、30)，至少部分通过形成用于接收所述溶液的内腔(22、32)的外边界(21)形成，并包含施加电压时作为电极(25、26、33、34)和接着发生放电的至少一个区域，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由至少基于掺杂至少一种导电物质的塑料的导电合成材料制成。
2.根据权利要求1的容器，其特征是所述掺杂物由碳纤维、石墨、碳黑、碳纳米管和/或本身导电的合成材料组成。
3.根据权利要求1或2的容器，其特征是所述塑料中的所述掺杂物的总浓度为10-80％w/w，优选的20-60％w/w，更优选的40-60％w/w，最优选的50-60％w/w，特别是55-60％w/w。
4.根据权利要求1、2或3的容器，其特征是所述塑料中的所述掺杂物的总浓度为40-80％w/w，优选的50-80％w/w，更优选的60-80％w/w，最优选的70-80％w/w，特别是74-76％w/w。
5.根据权利要求1至4任何一个的容器，其特征是所述塑料是聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚酰胺、聚苯硫或这些聚合物的混合物，或至少基于一种或多种这些聚合物，和/或其特征是所述塑料是本身导电的合成材料。
6.根据权利要求2至5任何一个的容器，其特征是所述本身导电的合成材料是聚苯胺、多炔、对聚苯、对聚苯硫、聚吡咯、聚噻吩、聚丙烯或类似物，或至少基于一种或几种这些聚合物。
7.根据权利要求1至6任何一个的容器，其特征是所述外边界(21、31)由合成材料，优选的由透明塑料制成。
8.根据权利要求7的容器，其特征是所述外边界(21、31)由与所述至少一个电极(25、26、33、34)所基于的塑料相同的塑料制成。
9.根据权利要求1至8任何一个的容器，其特征是所述至少一个电极(25、26、33、34)集成到所述外边界(21、31)中。
10.根据权利要求1至9任何一个的容器，其特征是包含至少两个由相同材料制成的电极(25、26、33、34)。
11.根据权利要求1至10任何一个的容器，其特征是至少两个电极(25、26、33、34)由不同材料制成。
12.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂25-45％w/w，优选的30-40％w/w，特别是33-37％w/w碳纤维和15-35％w/w，优选的20-30％w/w，特别是23-27％w/w石墨的聚酰胺，特别是聚酰胺66或聚酰胺6制成。
13.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂30-50％w/w，优选的35-45％w/w，特别是39-41％w/w碳纤维和25-45％w/w，优选的30-40％w/w，特别是34-36％w/w石墨的聚酰胺，特别是聚酰胺66或聚酰胺6制成。
14.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂15-40％w/w，优选的20％w/w碳纤维和1-40％w/w，优选的15％w/w石墨的聚碳酸酯制成。
15.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂30-50％w/w，优选的40％w/w碳纤维的聚醚醚酮制成。
16.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂20-40％w/w，优选的30％w/w碳纤维的聚酰胺，优选的聚酰胺66制成。
17.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂15-40％w/w，优选的20％w/w碳纤维的聚丙烯制成。
18.根据权利要求1至11任何一个的容器，其特征是至少一个电极(25、26、33、34)由掺杂30-50％w/w，优选的40％w/w碳纤维的聚苯硫制成。
19.根据权利要求1至18任何一个的容器，其特征是所述外边界(21、31)包含至少一个供给所述溶液的开口和至少一个排出所述溶液的开口。
20.包含至少两个，优选的6、12、24、48、96或更多个根据权利要求1至18任何一个的容器(20、30)，并相互连接构成一个单元的容器排列。
21.根据权利要求1至20任何一个的容器或容器组的制造方法，其特征是所述容器(20、30)或所述容器组通过双组分注模法制造，先注模留下一个凹陷窗的外边界(21、31)，接着将由掺杂的塑料制成的导电合成材料注模到所述至少一个窗中，或先用所述掺杂的塑料注模所述至少一个电极(25、26、33、34)，接着在所述至少一个电极(25、26、33、34)周围注模所述外边界(21、31)。
22.通过电流处理细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡，特别是电穿孔或电熔化的方法，其特征是包括a)将所述细胞、细胞的衍生物、亚细胞颗粒和/或泡转移到至少一个根据权利要求1至19任何一个的容器(20、30)或根据权利要求20的容器组的至少一个容器的内腔(22、32)中，其特征是所述容器(20、30)包含至少一个由掺杂的合成材料制成的电极(25、26、33、34)，和至少一个另外的电极(25、26、33、34)，和b)向所述电极(25、26、33、34)施加电压并在所述容器(20、30)的所述内腔(22、32)中产生电流。
23.根据权利要求22的方法，其特征是所述电流达到最高120A/cm2，优选的80A/cm2的电流密度。
24.根据权利要求22或23的方法，其特征是生物活性分子，特别是核酸，溶解在所述溶液中，并通过场强2-10kV*cm-1，宽度10-200μs的电压脉冲实现所述生物活性分子到活细胞中的转移。
25.根据权利要求24的方法，其特征是所述生物活性分子向所述活细胞中的所述转移通过紧接所述电压脉冲的、电流密度为2-14A*cm-2，优选的5A*cm2、宽度为1-100ms，优选的50ms的电流实现。
全文摘要
本发明涉及接收水溶液的容器20、30，它们至少部分通过形成接收溶液的内腔22、32的外边界21形成，且包含作为电极25、26、33、34的至少一个区域，当施加电压时，接着发生放电，其特征是至少一个电极25、26、33、34由至少基于用至少一种导电物质掺杂的塑料的导电合成材料制成。上述类型的容器20、30以简单和经济的制造方式产生，还能例如借助电穿孔或有效的电熔化来有效转染活细胞。
文档编号C12M1/42GK1643132SQ03805811
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月20日 优先权日2002年2月20日
发明者米勒－哈特曼 赫伯特, 哈彼希 米歇尔, 霍夫曼 彼特, 西本哥特 格雷哥尔 申请人:阿马克沙有限责任公司