工程杆状病毒及其用途的制作方法

专利名称：工程杆状病毒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及工程杆状病毒及其用途，特别是杆状病毒提供的文库和肽展示。
背景技术：
在过去几年，许多生物的基因组已经完全测序。完整人类基因组的草图序列已经公布。然而，这样的序列信息无法解释所有基因都在做什么、细胞如何工作、细胞如何形成生物、疾病发生了什么问题、我们如何变老或者如何开发一种药物。这是功能基因组学所要解决的问题，功能基因组学是后基因组时代的一个领域，处理基因及其产物的功能分析。
在功能基因组学技术中，DNA微阵列和蛋白质组学在研究复杂生物系统方面具有极大的希望。尽管DNA微阵列允许高通量分析转录子组(transcriptome)(在任一时间由细胞基因组转录的mRNA的互补序列)，基因可能存在，它们可能被突变，但是它们不一定转录。有些信使转录但不翻译，mRNA拷贝数不一定反映功能蛋白质分子的数量。蛋白质组学(在任一时间由一种细胞编码的整套蛋白质)解决通过DNA分析不能解决的问题，即，蛋白质产物的相对丰度、翻译后修饰、亚细胞定位、转换(turnover)、与其它蛋白质的相互作用以及功能方面。
表达文库中一种基因引起的可观察的特征允许在新测序的基因组(基因组文库)中发现功能开放阅读框，以及表征未知基因的功能(基因组或cDNA文库)。同时适合细菌和真菌细胞以及体外和体内实验的文库在这方面将是一种有效的工具。尽管质粒载体在理论上允许这样，但是质粒DNA对真核细胞的无效转导，更不用说质粒在体内不高的基因转移效率，降低了质粒文库作为表型组学(phenomics)的高通量工具的有效性(蛋白质的自动/高通量分析)。
很长时间以来，杆状病毒已经被用作生物杀虫剂，并且作为在昆虫细胞中高效生产重组蛋白的工具。它们通常被认为是安全的，因为它们具有天然的高种属特异性，并且因为知道它们在任何非无脊椎动物宿主中均不繁殖。
苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)含有一个适合的真核启动子，能够有效地转移并在几种哺乳动物细胞型中体外表达靶基因。此外，如WO-A-01/90390中报道的，杆状病毒能够与腺病毒相当地介导体内基因转移；参见Airenne等人，Gene Ther.71499-1504(2000)。易于操作，重组杆状病毒的快速构建，甚至在高感染复数下在哺乳动物细胞中缺乏细胞毒性，固有的在哺乳动物细胞中不能复制，插入外源序列的大容量(没有已知的插入限制)，都是杆状病毒的特征。
Vp39是杆状病毒的一种主要衣壳蛋白。杆状病毒通过受体介导的胞吞进入细胞。该病毒被多种哺乳动物细胞系有效地内化，但是不能进入非允许细胞的核。
以前曾经提出，哺乳动物细胞有效转导的阻断不是缺乏杆状病毒通过受体介导的胞吞进入细胞，而是病毒不能到达核(Boyce，PNASUSA 932348-2352，1996；Barsoum，Hum.Gene Ther.82011-2018，1997)。一般假定转导的阻断是在病毒逃离内体时。
众所周知，为了在病毒表面呈现异源蛋白质要改造AcNPV的主要表面糖蛋白(Boublik等人，Biotechnology(N.Y.)131079-1084，1995)。也可参照O′Reilly等人，《杆状病毒表达载体.实验室手册》，Oxford University Press，New York，NY(1994)。
为了避免繁重的和耗时的噬斑纯化过程，通过在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)中同源重组能够将遗传物质导入杆状病毒基因组内；参见Patel等人.Nucleic Acids Res.20，97-104，1992。该方法是快速的(在10-12天内获得纯重组病毒)，可确保没有亲本病毒背景，但是需要酵母培养经验，而且传统转移载体与该系统不相容。
Luckow等人，J.Virol.67，4566-4579，1993描述了一种更快速的产生重组杆状病毒的方法(在7-10天内获得纯重组病毒)，它利用Tn7的位点特异的转座，向在大肠杆菌细胞中繁殖的杆粒DNA(病毒基因组)内插入外源基因。根据颜色(β-半乳糖苷酶)筛选含有重组杆粒的大肠杆菌克隆，利用从单个白色菌落中纯化的DNA转染昆虫细胞。该系统适用于同时分离多种重组病毒，但是在转化后获得相对较低百分数的重组菌落(杆状病毒基因组)。
如Leusch等人，Gene 160，191-194，1995所述，温度敏感的筛选方法提高了原始系统的较差的选择特征。然而，该系统已证明在使用中不稳定。
发明概述根据本发明的第一方面，一种筛选靶基因的方法包括下列步骤(i)产生在作为载体的杆状病毒中克隆的基因或基因组片段文库；(ii)用该载体转化一种宿主细胞；和(iii)在预定的条件下检测基因表达。
杆状病毒基因组或cDNA文库为表型组学提供了一种有效的工具，能够在体外和体内在真核细胞中功能筛选构建的文库。向杆状病毒供体载体内加入一个细菌启动子也允许在细菌细胞中表达筛查cDNA文库。杆状病毒文库可以从人及其它脊椎动物来源的适当有效的全长克隆和序列构建。这将使得杆状病毒对靶细胞的有效感染(昆虫细胞)和转导(脊椎动物细胞)相结合，用于表型组学。
根据本发明的第二方面，修饰杆状病毒衣壳以展示一种或多种异源蛋白质或肽(在此广义地使用后一个术语以包括蛋白质)。基因组中相应修饰的杆状病毒代表本发明的另一方面。这些杆状病毒能够用来转导哺乳动物和其它细胞。具体而言，现在证实，杆状病毒转导哺乳动物细胞的主要阻断不是在于内体逃离，经而是在于病毒衣壳的核转运。
也已经证实，新的蛋白质个体能够与vp39的N端或C端融合，而不累及病毒滴度和AcMNPV衣壳表面的vp39融合蛋白的功能性。而且，标记的病毒能够用于体内基因转移。因此构建的杆状病毒提供了一种多用途工具，用于实时分析AcMNPV在哺乳动物细胞和完整动物中的转导途径，以及在昆虫细胞中的感染机制。衣壳修饰的杆状病毒在转基因的核及亚细胞靶向方面以及作为真核细胞的一种新肽展示系统方面也具有极大的希望。
与gp64包膜展示系统相比，衣壳展示系统具有许多优点。在vp39中，没有结构基序与基质(stromal matter)内的分子结合或用于衣壳装配，也不负责病毒的感染性。另外，免疫电子显微镜检查证实，vp39随机分布于衣壳表面，与病毒包膜上的gp64相对。杆状病毒包膜展示系统只允许与gp64的N端融合，而vp39允许在两端标记。尽管仍然有待于证实大蛋白质如何能够在杆状病毒衣壳上展示，但是结果提示至少能够有效表达27kDa的蛋白质。因为衣壳的长度能够相对自由地延长，所以合理地预期vp39也适合更大的蛋白质，例如可达100kDa或更大。肽或蛋白质在衣壳上的随机展示使得能够发现可将衣壳转运到核或其它细胞内器官的部分。
本发明也提供通过Tn7介导的转座产生重组杆状病毒的一种改进的方法。该方法基于一种修饰的供体载体和一个改进的杆状病毒杆粒在带SacB基因的大肠杆菌中的筛选方案。重组杆粒能够以每μg供体载体≥105的频率产生，背景可以忽略。这种易于使用的有效系统为重组杆状病毒的高通量产生以及一种更方便的生产单病毒的方法提供了基础。提出的筛选方案也可用于通过在大肠杆菌中转座构建其它载体。
根据本发明的修饰的杆状病毒之其它用途包括任何形式的“衣壳治疗”。因此，蛋白质能够用作直接向核内转运肽或蛋白质的系统。
具体而言，杆状病毒介导的治疗的概念包括使用杆状病毒衣壳作为穿梭载体向细胞内转运治疗性蛋白质的可能性，作为传统蛋白质转导方案的一种备选方案。不需要转基因表达的治疗的好处是显然的。
杆状病毒衣壳展示系统提供了一种易行的工具，用于研究杆状病毒在哺乳动物细胞中的转导机制，以及在昆虫细胞中的感染机制。另外，该系统也提供了一种新的工具，用于扩大在细胞内水平上杆状病毒靶向的可能性，以及增强复杂肽和蛋白质的展示。而且，EGFP杆状病毒构建体提供了一种有价值的工具，用于研究病毒在哺乳动物细胞中的实时进入和细胞内运动，以及追踪体内的生物分布和转导。
本发明的另一个方面是一种新的四启动子载体(pBVboostFG)，它使得能够在细菌、昆虫和哺乳动物细胞中筛查含有大插入片段的文库。希望的DNA片段的克隆是基于噬菌体λ的位点特异的高效重组系统。另外，该载体与改良的基于mini Tn7的转座克隆系统pBVboost相容，该系统不用任何背景即能够容易、快速地生产重组杆状病毒。该载体含有下列启动子鸡β-肌动蛋白、T7lac、p10和pPolh，能够用来在哺乳动物、细菌和昆虫细胞中表达克隆的插入片段。通过本发明，待测基因鸡抗生物素蛋白和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)容易、高效地克隆到新载体中，并在宿主细胞中表达。利用该载体，能够以整个基因组的规模筛查大文库，从而使pBVboostFG成为一种功能基因组学工具。
文库向研发的载体的克隆是基于噬菌体λ的位点特异的高效重组系统。按照相同的重组克隆方案，能够容易地将克隆的文库转移到其它任何系统中。另外，克隆的基因之转导也能够通过杆状病毒介导的转导直接在体内进行，而不需要任何其它的亚克隆步骤。与基于腺病毒和逆转录病毒的系统不同，利用杆状病毒作为含有文库的载体的一个好处是，能够掺入其基因组的插入DNA没有已知的上限。
附图简述

图1是衣壳展示质粒pBACcap-1的图谱。该质粒通过肽或蛋白质与AcMNPV衣壳蛋白vp39的N端或C端融合，用于杆状病毒衣壳的展示。
图2是pBVboost供体载体的质粒图谱。昆虫细胞表达盒包含一个多克隆位点(MCS，显示单一限制性内切酶)，其侧翼为多角体蛋白启动子(pPolh)和猿病毒40聚腺苷酸化位点(SV40 pA)。Tn7L和Tn7R，Tn7盒的左端和右端；SacB#3，突变的果聚糖蔗糖酶基因；ori，ColE1复制起点；GENT，庆大霉素基因。
图3是pBVBoostFG载体的图谱。该载体用来利用噬菌体λ的RC系统有效构建杆状病毒表达文库，但是也包括基于限制性内切酶的传统文库构建的选择。该系统允许在一种通用(杂合四启动子)系统下表达希望的基因，能够同时表征克隆的开放阅读框在大肠杆菌中作为质粒文库或在昆虫和哺乳动物细胞和动物中作为杆状病毒文库的活性。对于pBVboostFGR，标记基因在pPolh启动子下的克隆能够用来容易地检测产生的杆状病毒，或者通过其它方法修饰产生的杆状病毒文库。
图4概括了基于pBVboostFG的系统克隆及产生通用杆状病毒文库的用途。步骤如下1.将希望的文库RC克隆到pBVboostFG的RC盒内。
2.用重组pBVboostFG文库转化大肠杆菌DH10BacΔTn7细胞。
3.庆大霉素、四环素和蔗糖筛选产生100％的重组杆粒。
4.转移菌落并培养过夜。
5.通过碱裂解提取重组杆粒，转染昆虫细胞。
6.初次病毒筛选。滴度～108pfu/ml。
7.转导希望的靶细胞，在体内检测。
图5是SES-PCR策略的示意图，用来构建向pBVboostFG内克隆的抗生物素蛋白(A)和EGFP(B)盒。最下面的虚线显示寡核苷酸中与所用RC系统的LR反应和细菌ompA信号(抗生物素蛋白中)相容的attL位点。(C)用来合成与LR反应相容的抗生物素蛋白和EGFP构建体的寡核苷酸。attL-序列以斜体显示，编码omp A信号肽的序列加下划线。
优选实施方案描述为了引导杆状病毒文库基因在无脊椎动物、大肠杆菌和昆虫细胞中高水平表达，可以根据允许靶基因在原核和真核细胞中高水平表达的杂合或其它适合的启动子，构建一种表达盒。该表达盒中可能包含例如cre-重组酶的靶位点(loxP)，以便在体外利用位点特异的重组容易地构建杆状病毒文库(Sauer，Methods 14381-392，1998)。为了进一步增加构建杆状病毒文库的选择，可在该表达盒中包含attR和ccdB位点(以及为了筛选表达盒成功连接的例如氯霉素抗性或其它标记)。这使得适合Life Technologies Gibco BRL_GatewayTM克隆技术(LifeTechnologies)的文库能够容易地转变为新的杆状病毒文库。除了cre/lox和Gateway相容性之外，该表达盒允许在如上所述的修饰后，用载体MCS中可以获得的几种独特限制性内切酶进行传统的文库构建。
构建的表达盒可以克隆到能够用作供体载体的任何适合的杆状病毒质粒或杆状病毒系统内。pFastBac-1是一种优选的骨架质粒，因为与Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统(Gibco BRL)相容，该系统能够通过在大肠杆菌中位点特异的转座快速、容易地制备re-杆状病毒。希望时，该表达盒也能整合到任何希望的质粒/表达系统中，例如Bac-TO-BacTM杆状病毒表达系统的一种形式，它允许更有效、直接地构建杆状病毒(Leusch等人，Gene 160191-194，1995)。
该表达盒也能够作为杆状病毒基因组的一部分克隆，然后通过cre/lox、Gateway或直接克隆法直接进行文库构建。
所有克隆工作都能够用标准分子生物学方法进行。针对在适当大肠杆菌株(供体质粒形式的文库)、昆虫细胞和脊椎动物细胞中的表达/表型效应筛查构建的杆状病毒文库。选择的病毒或整个文库也能够直接用于体内研究。这显示了新杆状病毒文库的极大的和独特的潜能；同一种文库能够用于原核和真核细胞以及细胞(体外)和动物(体内)研究。
例如，为了能够细胞内靶向AcMNPV，研制了一种杆状病毒衣壳展示系统。该系统基于一种多用途供体载体，该载体可以将希望的蛋白质有效地生产为与杆状病毒主要衣壳蛋白vp39 N端或C端的融合体(Thiem和Miller，J.Virol.632008-2018，1989)。是肽或蛋白质的可能的靶标的另外一种杆状病毒衣壳蛋白包括p24和p80。
高滴度re-AcMNPV的一种构建体能够在其衣壳中展示高浓度的外源蛋白质。标记的病毒是研究杆状病毒在哺乳动物细胞中从细胞表面到核内的转导途径和杆状病毒的体内转染能力的一种便捷工具。该系统同时提供了一种有效的工具，用于研究非允许细胞系的AcMNPV转导的瓶颈，和通过在vp39蛋白内掺入特异序列提高核或亚细胞靶向的可能性。通过向包膜内插入特异配体或抗体，随后通过vp39修饰进行细胞内靶向，AcMNPV也允许在细胞表面水平上双重靶向。
为了使实现功能融合和衣壳装配的机会最大，构建一种转移质粒，它使得希望的个体能够与vp39的N端或C端融合(图1)。融合蛋白的产生由一个强多角体蛋白启动子驱动，如O′Reilly等人(同上)所公开。由于计算机预测显示vp39在C端有低复杂性，而在N端受到限制，所以可以向N端添加一个接头序列(例如GGGGS)，以获得N端融合蛋白正确折叠所需的距离和柔性。用His标签(His-tag)对vp39的标记之选项也可是优选的。例如，pBACcap-1质粒产生在N端含有His标签的vp39。然而，同一种转移质粒也能用于含或不含His标签的N端或C端融合。该系统适用于转座子介导的病毒制备。然而，pBACcap-1中的表达盒能够被容易地转移到任何希望的杆状病毒载体中。
本发明包括双重靶向的可能性，作为主要在组织或细胞表面水平上进行的常规靶向的延伸。组织靶向的基本概念是向基因转移载体表面上添加特异配体，以实现与希望的细胞或组织的特异结合。众所周知，特异的配体-受体相互作用不能保证靶细胞的有效转导。内化、逃离内体和遗传物质向核内的转运也是需要的。尽管通过选择细胞膜靶向部分能够有助于转导，但是从细胞质到核的途径仍然难以达到。包膜病毒在组织和细胞内水平上的有效双重靶向方面具有希望。通过用希望的组织靶向部分修饰包膜，用细胞内靶向部分修饰衣壳，应当能够实现有效、特异的靶细胞转导。也可以向这些载体中添加利用特异启动子的转录靶向。
用于改进重组杆状病毒产生的本发明的一种方法包括向供体质粒内掺入一种致死基因。该致死基因的产物可以杀死仍然携带供体载体的细胞，而表达盒从供体质粒向杆粒内成功转座造成的组合选择压力仅可以有效地拯救重组杆粒。在一个具体实施方案中，供体载体pBVboost携带来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的SacB基因；参见Tang等人，Gene 96，89-93，1990。SacB编码果聚糖蔗糖酶，该酶可以催化蔗糖水解，产生致死性产物果聚糖。在蔗糖存在下，果聚糖将杀死细胞。为了平衡在蔗糖存在下果聚糖的致死效应与其它抗生素压力，使用突变基因可能有效。
转基因向pBVboost内克隆似乎不影响改进的筛选方案。这些病毒的产量和表达特征通常与其它系统产生的病毒相似或相同。产生高滴度病毒(～108pfu/ml)，它们能够在昆虫细胞中，或者使用适当的启动子能够在哺乳动物细胞中表达大量希望的基因产物；参见Airenne等人(2000)，同上。然而，与原始方法相比，一个显著不同是杆粒重组体能够以每μg供体载体≥105的频率产生，背景可以忽略。通过优化感受态DH10BacΔTn7细胞的制备和进一步优化转化方案，可以进一步提高这一频率。pBVboost系统的另一个优点是，由于有效的筛选方案，不需要颜色筛选(即平板中不需要昂贵的X-Gal和IPTG)。这使该系统节省成本。
总之，使用所述的新筛选方案避开了与最初以转座为基础地在大肠杆菌中生产杆状病毒基因组有关的缺点，而保留了简单、快速、方便的病毒生产。向供体质粒内添加致死基因，并且使用染色体attTn7被占据的大肠杆菌株，能够以节省成本的方式有效地筛选重组杆粒。这种改进的pBVboost系统适用于高通量用途，如表达文库筛选，但是也加强单重组病毒的构建。
如上所述，本发明的一个方面是一种具体载体。为了只用一种载体，不进行其它任何亚克隆，构建一种允许在不同宿主系统中表达克隆的基因或cDNA文库的载体，将4种不同的启动子组合在同一载体中。这个四启动子盒由pPolh、CAG(CMVie增强子+鸡β-肌动蛋白启动子)、T7lac和p10组成，它们引导靶基因在脊椎动物细胞、大肠杆菌和杆状病毒感染的昆虫细胞中高水平表达；这在下文更详细地描述，如图3所示。pPolh启动子之后的一个多克隆位点允许选择修饰杆状病毒性质或表达标记基因，以便如此处所述检测重组杆状病毒合成。为了能够向载体内有效地重组克隆希望的文库(或基因/cDNAs)，质粒内包含噬菌体λ的位点特异的RC盒，其含有attR1/2位点，使该载体成为用于这种重组克隆系统的目标载体。为了进一步能够快速、高通量地生产重组杆状病毒，使用四启动子RC盒，可以作为pBVboost载体的一部分克隆，它能够零背景地生产重组杆状病毒，使之适用于文库筛查。图4显示了一张流程图，说明实际上如何克隆并生产希望的杆状病毒文库。
有几点使得基于pBVboostFG的系统成为文库筛查载体的一个通用选择。主要的好处之一是适用于多种其它宿主系统应用产生的杆状病毒，该文库(或单基因/cDNA)能够在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、甚至在完整动物中体内表达。最后一个选项是最重要的，因为它提供了从体外文库筛查到动物试验的快速转变，而不需要其它任何亚克隆步骤，因此明显有助于疾病相关基因的筛选。在本文中，杆状病毒的向性(tropism)是研究最广泛的病毒基因转移载体之一。
该系统的第二方面依赖于产生含有杆状病毒而没有野生型背景的文库的有效克隆方案。这是基于两个连续的RC步骤，包括噬菌体λ的位点特异的重组，和改进的mini Tn7转座系统。在文库构建中使用RC策略比基于限制性内切酶/连接酶的常规克隆方法有几个好处。首先，在克隆过程中不进行限制性内切酶消化提高了全长文库的保真度，因为希望的克隆不从内部存在的限制性酶切位点消化。其次，使用的噬菌体λ的RC系统比基于限制酶切/连接的策略有更高的克隆效率。而且，噬菌体λ的位点特异的重组系统是可逆的，这与其它许多相应的位点特异的重组酶系统不同。这一特征意味着利用同一系统能够将克隆到新载体内的任何片段容易地转移到其它任何载体中，反之亦然。
高克隆效率与快速、无背景的杆状病毒生产相结合，产生比通过同源重组或常规克隆方法可能获得的更便捷的典型文库。因为该系统中的重组杆状病毒基因组在大肠杆菌中产生，所以不需要进行噬斑纯化来分离不同的克隆。这也有利于所述文库的筛查和产生。
使用杆状病毒文库的另一个优点是能够筛选长DNA插入片段。文库构建中使用的RC步骤也允许转移长插入片段。相反，最近的腺病毒和逆转录病毒基因转移载体能够向其基因组内掺入不到8kb的外源DNA。从提取的poly-A RNA开始，用基于pBVboostFG的系统构建杆状病毒文库能够在一周内完成(图4)。在筛选并鉴定候选克隆后，用于体内检测的病毒扩增能够在1-2周内完成。
根据噬菌体λ的RC方案分离的载体中存在第二个杆状病毒启动子，如pPolh，能够将其它特性克隆到产生的杆状病毒文库内。该特征由下述举例说明为了鉴定产生的重组杆状病毒，在pPolh下克隆荧光标记。其它相应的方法是病毒文库的假分型(pseudotyping)，或通过在pPolh启动子下克隆GP64或VP39融合蛋白，对杆状病毒外壳或衣壳的修饰，这允许将产生的病毒更特异、更有效地靶向具体细胞型内。
下表列出了该研究中使用的载体。
下列实施例说明本发明。
实施例1衣壳展示载体为了构建一种用于衣壳展示的通用杆状病毒载体，通过聚合酶链反应(PCR)由纯化的杆粒DNA(Luckow等人，J.Virol.67，4566-4579，1993)扩增对应于vp 39的核苷酸(nt)469-1506的区域(GenbankM22978)。正向引物是5′-TT GAAAGA TCT GAA TTCATG CACCAC CAT CAC CAT CACGGA TCCGGC GGC GGC GGC TCG -3′(vp39基因的nt 469-486的具体序列加框；BglII、EcoRI、BamHI位点加下划线；含有起始密码子的六组氨酸标签为斜体)；反向引物是5′-TT CTGGGT ACCGCt ttaATG GTG ATG ATG GTG GTGTCT AGAGCt ttaACT AGT -3′(vp39基因的nt 1489-1506的具体序列加框；KpnI、XbaI和SpeI位点加下划线；六组氨酸标签为斜体；终止密码子为小写字母)。PCR基本如Airenne等人，Gene 14475-80，1994所述进行，不同之处在于退火温度设定为58℃。扩增的片段用BglII和KpnI酶消化，如Airenne等人，同上所述纯化。纯化的PCR产物克隆到BamHI+KpnI消化的pFastBAC1载体(Invitrogen，Carlsbad，USA)内。获得的质粒被命名为pBACcap-1。核苷酸序列通过测序证实(ALF；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)。
展示EGFP的病毒的制备通过PCR由pEGFP-N1质粒(GenbankU55762，Clontech，PaloAlto，USA)扩增编码EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的cDNA，并克隆到pBACcap-1内。利用两组引物使EGFP能够与vp39的N端和C端融合。对于N端融合，正向引物是5′-CGG GAT GAA TTC-3′(pEGFP-N1的nt670-699的具体序列加框；EcoRI位点为斜体)，反向引物是5′-GCGGCC GGA TCC -3′(pEGFP-N1的nt 1375-1395的具体序列加框；BamHI位点为斜体)。将对应于pEGFP-N1的nt 670-1395的扩增片段克隆到SpeI/XbaI缺失的pBACcap-1的EcoRI/BamHI位点内。获得的质粒被命名为pEGFPvp39。
对于C端版本，正向引物是5′-GTC GCC ACT AGT -3′(pEGFP-N1的nt 682-702的具体序列为黑体；SpeI位点加框)，反向引物是5′-AGA GTC ACT AGT GCt -3′(pEGFP-N1的nt 1375-1398的具体序列加框；SpeI位点为斜体；终止密码子为小写字母)。将对应于pEGFP-N1的nt 682-1398的扩增片段克隆到pBACcap-1的SpeI位点内。获得的质粒被命名为pvp39EGFP。核苷酸序列通过测序证实(ALF)。
利用Bac-To-Bac系统TM，按照厂商说明书(Invitrogen)生产重组病毒。如Airenne等人，Gene Ther.71499-1504，2000所述，浓缩并梯度纯化病毒。通过对Sf9细胞进行终点稀释试验测定病毒滴度。对病毒制品进行无菌试验，分析它们不含脂多糖和支原体污染。
免疫印迹法将来源于4ml培养基的对应于约60,000个感染细胞或病毒的样品加样到还原条件下的10％SDS-PAGE上。如Airenne等人(1994)，同上所述，将凝胶印迹到硝酸纤维素滤膜上，免疫染色。多克隆兔抗-EGFP(Molecular Probes Inc.，Eugene，USA)用作第一抗体(1∶4000)，山羊抗兔血清作为第二抗体(1∶2000)(Bio-Rad，Hercules，USA)。SDS-PAGE中的分子量标准来自Bio-Rad。
电子显微镜检查对于免疫电子显微镜检查，vp39EGFP杆状病毒颗粒与用PBS中的5％胎牛血清处理的formwar-包被的金属网格结合，使之与抗GFP抗体(1∶600稀释，30min)反应，用PBS洗涤。然后用金偶联的蛋白A处理网格25分钟(直径5nm，G.Posthuma和J.Slot，Utrecht，荷兰)，用PBS洗涤25分钟。网格用2.5％戊二醛固定，对比，用0.3％乙酸双氧铀将其包埋于1.5％甲基纤维素中。病毒转导的人肝细胞瘤细胞系HepG2和人内皮主动脉杂交瘤细胞(EAHy926，Dr.Edgell，Univ.N.Carolina，USA)用2.5％戊二醛在室温下固定1小时，然后用1％四氧化锇在4℃下固定1小时。脱水后，在室温下用2％乙酸双氧铀染色细胞30分钟，包埋于环氧类树脂中，为了电子显微镜检查切片。切片用柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色。用JEM-1200 EX电子显微镜(Jeol Ltd.，东京，日本)检查样品。
免疫荧光法和共聚焦显微镜检查分汇合的(Subconfluent)EAHY、HepG2、MG63(人骨肉瘤)和NHO(正常人成骨细胞)细胞培养物用vp39EGFP杆状病毒如下感染首先在冰上用PBS洗涤细胞，以每个细胞80-100pfu的转导复数向含有1％胎牛血清的DMEM中加入病毒，在冰上温育1小时(振荡)。通过在补充0.5μM莫能菌素的培养基中温育细胞，检测溶酶体pH对杆状病毒进入的影响。用含有0.5％BSA的PBS洗涤细胞。然后加入DMEM(含有10％血清)，细胞在37℃下温育不同时间，最后用PBS中的4％低聚甲醛固定20分钟。细胞用EEA1(早期内体抗原1；BDTransduction Laboratories，Lexington，Kentucky)标记。标记中使用山羊抗小鼠第二抗体(Alexa red 546nm；Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon)。将细胞置于mowiol中，用Axiovert 100M SP表荧光(epifluorescence)显微镜(Carl Zeiss，Jena，德国)和共聚焦显微镜(ZeissLSM510)检查。为了显示EGFP和Alexa red 546，使用488和546激光线的多重追踪(multitracking)，以避免假共定位(co-localisation)。对HepG2和EAHY细胞的直接(Live)共聚焦显微镜检查如下进行将细胞平板接种于分室的盖玻片(Nalge NUNC，Naperville，Illinois)上。病毒在冰上结合后，将细胞转移到热工作状态的共聚焦显微镜上，用Tempcontrol 37-2(Carl Zeiss，Jena，德国)控制物镜。利用LSM 510软件(程序版本2.3；Carl Zeiss，Jena，德国)中的程序，以不同时间间隔扫描EGFP阳性的细胞。
向大鼠脑内的体内注射雄性Wistar大鼠(320-350g)用含有芬太尼-氟阿尼酮(Janssen-Cilag，HypnorM_，Buckinghamshire，UK)和咪达唑仑(Roche，Dormicum_，Espoo，芬兰)的溶液(0.150ml/100g)腹膜内麻醉，置于立体定位仪(Kopf Instruments)内。按照下列立体定位坐标打钻孔距satua sagittalis 1mm，距前囱+1mm。在4×5min时间内，利用配有27号的针头的Hamilton注射器注射0.9N NaCl中的100μlEGFPvp39或vp39EGDP杆状病毒(0.9×1010pfu/ml)，深度为3.5mm。基因转移7小时后用CO2处死动物。大鼠通过透心(transcardiac)途径用PBS灌注10min，随后用4％低聚甲醛/0.15M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)固定10分钟。取出大脑，用异戊烷骤冻，制备40μm厚的冷冻切片。立即通过荧光显微镜检查(Olympus AX70显微镜，Olympus Optical，日本)分析载玻片，用Image-Pro Plus软件采集数据。
展示EGFP的病毒的表征编码EGFPvp39或vp39EGFP的病毒感染的Sf9细胞在免疫印迹中产生预期的67kDa带。用梯度纯化的病毒制品获得相同的结果。结果表明，这两种vp39变体都在昆虫细胞中有效产生，并掺入病毒颗粒内。然而，为了证实融合蛋白是病毒衣壳的一部分，梯度纯化vp39EGFP病毒，并与抗EGFP一起温育，用蛋白A金标记，用电子显微镜分析。病毒衣壳显示典型的杆状形态，未包膜衣壳的表面金标记明显。完整的病毒体不被标记。因此，大量EGFP在重组杆状病毒衣壳周围平均分布。
为了估计每个病毒颗粒掺入的EGFP的量，免疫印迹连续稀释的纯化的病毒颗粒，并与已知含量的纯化的EGFP相比较。分析表明，每个病毒颗粒掺入约860个EGFP分子。通过比较vp39EGFP病毒制品的检测的荧光与EGFP对照，确定每个衣壳有590个EGFP分子。考马斯蓝染色的SDS-PAGE也支持高掺入率，据此认为高比例的衣壳由vp39EGFP组成。融合蛋白不影响病毒的装配，因为梯度纯化并浓缩(200×)的EGFPvp39和vp39EGFP病毒的滴度分别为9.5×109和8.8×109pfu/ml。
杆状病毒介导的转导vp39EGFP病毒的细胞内途径之后用共聚焦显微镜监测EGFP标记的衣壳和荧光标记的细胞区室。EAHY、HepG2、MG63和NHO细胞转导不同时间，研究病毒与早期内体抗原1(EEA1)的共定位。选择EAHY、MG63和NHO细胞，因为发现它们完全不允许用LacZ-杆状病毒进行杆状病毒转导。甚至在10mM丁酸钠(它增强基因表达)存在下，以极高的转导复数(1000)，通过X-gal染色，在平板上也未检测到染色为蓝色的细胞，而染色为蓝色的兔主动脉平滑肌细胞(RAASMC)的量与Airenne等人(2000)，同上所述的结果一致。
已知杆状病毒通过胞吞途径进入细胞。在衣壳被递送到核之前，在微酸条件下，利用病毒gp64将杆状病毒包膜与早期内体的膜融合。转导后(p.t.)30分钟，可见病毒仍然存在于HepG2和EAHY细胞的早期内体中。转导4小时和24小时后，在EAHY细胞中病毒不与EEA1共定位，提示它已经逃离早期内体。然而，在这些细胞中，衣壳不进入核，而在HepG2细胞中，转导4小时后在核中可见衣壳为明亮斑点。在EAHY细胞中，衣壳(EGFP)阳性核的数量极低(0.1％)，而在转导4小时后在HepG2细胞中几乎所有核都是阳性(91％)。在转导后24小时，EGFP在HepG2细胞中不再清楚地区别，提示衣壳已经解离，而它们仍然存在于EAHY细胞的细胞质中。用rab11荧光标记再循环的早期内体以及用抗CD63荧光标记晚期内体和溶酶体显示，在EAHY细胞中在转导后24小时不与EGFP共定位，提示病毒衣壳不在胞吞途径中。转导4小时后EAHY细胞的电子显微镜检查证实，细胞质内不含病毒衣壳，进一步提示它们已经逃离早期内体。在HepG2细胞中，在转导4小时后核内存在衣壳，显示在从早期内体释放后，完整的衣壳被转运到核内。vp39EGFP病毒的实况影像(Live imaging)支持共定位研究的结果。EAHY细胞的电子显微镜检查证实在转导4小时后核内不存在病毒衣壳。为了了解杆状病毒在EAHY细胞中核进入的阻断对于其它非允许细胞是否也有效，利用vp39EGFP病毒研究了MG63(图4)和NHO细胞。结果提示在非允许细胞中杆状病毒衣壳的核进入通常被阻断。
在莫能菌素存在下，细胞的转导导致病毒衣壳进入细胞质的阻断。莫能菌素抑制早期内体酸化，导致物质在早期内体中积累。在HepG2和EAHY细胞中，在转导4小时后，莫能菌素导致病毒在EEA1阳性早期内体中积累。这些结果提示，病毒在允许和非允许细胞中遵循相同的途径。在两种细胞型中，杆状病毒都通过吸附胞吞被摄取，然后包膜与内体进行依赖pH的融合，以前显示在昆虫和哺乳动物细胞中发生。
病毒在大鼠脑中的体内显示为了研究vp39EGFP在杆状病毒生物分布研究中的用途，将一等份病毒注射到大鼠脑中。在向大鼠脑右胼胝体内注射7小时后，在注射部位附近仍然清晰可见病毒。因此，vp39EGFP杆状病毒能够用于更详细的体内生物分布研究。
实施例2细菌株、质粒、细胞系和病毒DNA大肠杆菌DH5α株(Invitrogen，USA)用于质粒的繁殖。DH10Bac细胞和dpFastbac1获自Invitrogen。含有SacB基因的pDNR-LIB载体购自BD Biosciences Clontech，USA。
修饰的供体载体的构建修饰的供体载体如下构建将pFastbac1载体中的氨苄青霉素抗性基因替换为来自pDNR-LIB载体的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(SacB)。实际上，pFastbac1载体用BspHI限制性内切酶酶切，线性载体骨架通过凝胶电泳纯化。通过聚合酶链反应(PCR)，由pDNR-LIB获得SacB表达盒，其中使用引物DNR5′5′-GTTATTCATGAGATCT -3′(pDNR-LIB的nt 1263-1282的序列加框；BspHI和BglII位点加下划线)，DNR3′5′-TTAGGTCATGA -3′(pDNR-LIB的nt 3149-3179的序列加框；BspHI位点加下划线)。PCR基本如Airenne等人(1994)，同上所述进行，不同之处在于在58℃下进行退火，扩增使用EXT DNA聚合酶(Finnzymes，Helsinki，芬兰)。扩增的片段用BspHI消化，如Airenne等人(1994)，同上所述纯化。将纯化的PCR产物克隆到BspHI-消化的pFastbac1载体内(Invitrogen，Carlsbad，美国)，在图2中定向显示。获得的质粒被命名为pBVboost。SacB#3盒的核苷酸序列通过DNA测序证实(ALF；AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)。
染色体attTn7阻断的大肠杆菌株的构建为了阻断DH10Bac中隐蔽的attTn7位点，pBVboost用BseRI/AvrII酶切。切下的庆大霉素抗性用来自pFastbac1的氨苄青霉素抗性盒(ARC)代替。通过PCR获得ARC，其中使用引物DH10Bacinttn7destroybyamp5′5′-AAATATGAGGAGTTACAATTGCTAATTAATTAAT -3′(pFastbac1的nt 471-490的序列加框；BseRI位点加下划线)，DH10Bacinttn7destroybyamp3′5′-CTTGGTCCTAGGATTA -3′(pFastbac1的nt 1430-1449的序列加框；AvrII位点加下划线)。PCR如上所述进行。扩增的片段用BseRI/AvrII消化，如上所述纯化。将纯化的PCR产物克隆到BseRI/AvrII消化的pBVboost内。获得的质粒被命名为pBVboostΔamp。氨苄青霉素盒的核苷酸序列通过DNA测序证实(ALF；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)。
DH10Bac细胞用pBVboostΔamp转化。从5ml LB培养基中含有50μg/ml硫酸卡那霉素(Kan)、10μg/ml四环素(Tet)、50μg/ml氨苄青霉素(Amp)、50μg/ml X-gal、1mM IPTG和10％蔗糖的LB平板中挑取单个蓝色菌落。次日如Donahue，Focus 17，101-102，1995所述通过PCR根据完整杆粒的存在筛选菌落。在凝胶电泳中产生325bp带(完整杆粒的标志)的菌落，通过凝胶电泳纯化质粒DNA的样品(Wizardminipreps；Promega.Madison，USA)，进一步研究供体质粒的缺乏。获得的克隆保存于-70℃下，为大肠杆菌DH10BacΔTn7。
电感受态细胞的制备为了制备电感受态细胞，用来自LB平板(Kan、Tet用于DH10Bac，或者Kan、Tet和Amp用于DH10BacΔTn7细胞，以上述浓度)的单菌落接种10ml含有适当抗生素的Super培养液(SB；30g胰蛋白胨，20g酵母提取物，10g 3-N-吗啉代丙磺酸，1升水，pH 7.0)。悬液在摇床上37℃培养过夜。含有5ml 2M葡萄糖的1升SB然后接种5ml过夜培养物，直到新培养液在600nm的光密度达到0.8-0.9(约2-4小时)。培养液然后在冰上冷却15分钟，在4℃下以1500g离心15分钟。细胞用800、500、300、200和100ml冰冷的水/10％甘油洗涤，如上所述离心。最后，将细胞悬浮于总体积为3-4ml的10％甘油中，以40μl等份保存于-70℃。
向杆粒内的转座和重组杆状病毒的生产用pFastbac1或pBVboost供体载体电转化40μl DH10Bac或DH10BacΔTn7进行转座。使用BIO-RAD Gene Pulser II系统(Hercules，美国)，如Gibco BRL所述进行电转化。细胞在转化4小时后在37℃剧烈振荡下回收。将培养液平板接种于补充了7μg/ml庆大霉素(Gent)和Tet(10μg/ml)、含或不含10％蔗糖的LB平板上。如上所述通过PCR研究菌落是否存在重组杆状病毒基因组。按照Bac-To-Bac系统(Invitrogen)提供的方案生产重组病毒。
结果利用原始pFastbac1或pBVboost供体载体研究在DH10Bac或DH10BacΔTn7(其中染色体attTn7位点被占据)细胞中的转座效率，并比较结果。如预期的，使用pBVboost导致在蔗糖存在下重组杆粒的产生效率显著提高。在DH10Bac细胞中使用pBVboost，检测到转座效率(白色菌落)提高10倍以上。而且，用pBVboost转化DH10BacΔTn7一般产生100％的白色菌落，与之相比，在pFastbac1平板上只有27％。PCR证实在形态学白色菌落中存在重组杆粒。特别是，使用DH10BacΔTn7株也导致含有pFastbac1的重组杆粒显著增多。
实施例3pBVboostFG和pBVboostFGR的构建为了能够向计划的载体内重组克隆，将Gateway克隆盒A(Invitrogen)插入修饰的pTriEx-1.1载体(Novagen)内。将构建的盒克隆到能够快速产生杆状病毒的pBVboost载体内(实施例2)，获得的载体被命名为pBVboostFG(图3)。为了构建含有标记基因的pBVboostFG形式，将编码DsRed的序列(来自DsRed2-N1载体，Clonetech)亚克隆到多角体启动子(pPolh)下的pBVboostFG的MCS内。该载体被命名为pBVboostFGR。
抗生物素蛋白和EGFP向pBVboostFG和pBVboostFGR载体内的克隆利用SES-PCR通过三个步骤获得DNA构建体，其含有细菌ompA分泌信号，该信号与抗生物素蛋白cDNA融合，其侧翼为重组克隆所需的attL1(5′)和attL2(3′)位点(图5)。将该产物LR-克隆(Invitrogen)到pBVboostFG中，获得的质粒被命名为pBVboostFG+avi。利用相同的SES-PCR方法通过两个步骤制备EGFP-构建体(pEGFP-N1，Clontech，Palo Alto，美国)，之后将其克隆到pBVboostFG和pBVboostFGR内。获得的质粒分别被命名为pBVboostFG+EGFP和pBVboostFGR+EGFP。
基因的表达和蛋白质的表征ompA-抗生物素蛋白和EGFP的细菌表达在表达T7聚合酶的大肠杆菌BL21株中进行。为了表达ompA-抗生物素蛋白，首先在37℃和振摇培养条件下培养细胞，直到光密度达到0.2(A595)，之后加入IPTG至终浓度0.4mM，开启蛋白质的产生。抗生物素蛋白的合成在室温下继续过夜。将细胞分级分离为总级分、周质级分和不可溶级分，这些级分进行15％SDS-PAGE，转移到尼龙珠滤膜上。用多克隆兔抗-抗生物素蛋白抗体(1∶5000)检测蛋白质，用山羊抗兔IgG-AP(1∶2000)作为第二抗体。在含有0.4mM IPTG和庆大霉素的LB平板上培养细菌进行EGFP表达，在紫外线下直接从培养物中检测产生的EGFP。
重组杆状病毒利用如上所述的载体pBVboostFG+EGFP和pBVboostFGR+EGFP构建(实施例2)。杆状病毒感染在Sf9细胞(6孔板，每孔1×106细胞)中进行三天。
为了在哺乳动物细胞中检测构建的表达盒，用HepG2和CHO作为通过CAG启动子表达EGFP的检测细胞系。利用pBVboostFG+EGFP，通过杆状病毒转导和转染检测该盒的功能性(FuGENETM，Roche)。在两个试验中，将150,000个细胞接种到6孔板的孔中，24小时后，用1-2μg质粒DNA转染细胞或用病毒以MOI300转导细胞。细胞再温育24小时，用荧光显微镜成像。
待测基因克隆到pBVboostFG和pBVboostFGR内为了向大肠杆菌的周质间隙内转运合成的抗生物素蛋白，使细菌ompA分泌信号与抗生物素蛋白基因融合。为了将ompA-抗生物素蛋白和EGFP一步RC克隆到pBVboostFG(R)内(图5)，利用SES-PCR包含克隆系统需要的长attL位点；参见Majumer等人，Gene 110，89-94，1992。
待测基因抗生物素蛋白和EGFP的表达抗生物素蛋白的表达(pBVboostFG+AVI)在BL21大肠杆菌中有效，过夜诱导后显著比例的总细胞蛋白质由抗生物素蛋白组成。抗生物素蛋白部分产生为不可溶的包涵体。包涵体以及总细胞样品也含有蛋白质的未加工形式(即仍含有信号肽的蛋白质)。相反，实际上从所有周质抗生物素蛋白上切下ompA信号。通过与生物素琼脂糖结合以及与琼脂糖结合的整个级分，研究周质抗生物素蛋白的功能性。EGFP也在质粒pBVboostFG+EGFP转化的大肠杆菌中作为一种功能形式成功地产生，因为它直接从LB平板上生长的细菌培养物中容易地检测。
利用编码EGFP的杆状病毒感染Sf9细胞。感染3天后，用荧光显微镜研究细胞。实际上，所有细胞均被感染。相应地，含有DsRed和EGFP的病毒类似地感染Sf9细胞。
利用HepG2和CHO细胞证实，四启动子构建体在哺乳动物细胞中也起作用。在此情况下，Sf9细胞使用同一种EGFP构建体。该构建体作为杆状病毒转导HepG2和CHO细胞，并且作为质粒(pBVboostFG+EGFP)转染CHO细胞。
序列表<110>Ark Therapeutics Ltd.
<120>工程杆状病毒及其用途<130>REP07452WO<140>未知<141>2003-03-12<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸<400>1ttgaaagatc tgaattcatg caccaccatc accatcacgg atccggcggc ggcggctcgg 60cggctagtgc ccgtgggt 78<210>2<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸<400>2ttctgggtac cgctttaatg gtgatgatgg tggtgtctag agctttaact agtgacggct 60attcctccac c 71<210>3
<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸<400>3cgggatgaat tcgtcgccac catggtgagc aagggcgagg ag42<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸<400>4gcggccggat cccttgtaca gctcgtccat gcc 33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述寡核苷酸<400>8ttaggtcatg aacatatacc tgccgttcac t31<210>9<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述寡核苷酸<400>12caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgataagcaa 60tgctttctta taatgccaac 80<210>13
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<223>人工序列描述寡核苷酸<400>14gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggcta tgaacaaacc ctccaaattc 60gctctggcgc ttgccttcg 79<210>15<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸<400>15tgctttctta taatgccaac tttgtacaag aaagctgggt attactcctt ctgtgtgcgc 60agg 63<210>16<211>51<212>DNA
<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述寡核苷酸<400>17tgctttctta taatgccaac tttgtacaag aaagctgggt ttacttgtac agctcgtc 58
权利要求
1.杆状病毒，其衣壳已经被修饰以展示一种或多种异源肽。
2.根据权利要求1的杆状病毒，其中vp39、p24或p80被修饰。
3.根据权利要求2的杆状病毒，其中vp39被修饰。
4.根据权利要求3的杆状病毒，其中在N端和/或C端用融合蛋白修饰vp39。
5.根据前述任一项权利要求的杆状病毒，其中所述修饰允许核或亚细胞靶向。
6.如前述任一项权利要求所述的杆状病毒，其基因组已经被修饰以在其衣壳中表达一种或多种异源肽。
7.根据权利要求6的杆状病毒，其中杆状病毒载体含有至少3个基因。
8.根据权利要求6或权利要求7的杆状病毒，其中一种或多种异源基因的长度至少为10kb。
9.根据权利要求6-8中任一项的杆状病毒，其中所述基因是人类基因。
10.根据前述任一项权利要求的杆状病毒的用途，用于将肽递送到另一种细胞的核内。
11.根据权利要求10的用途，其中所述另一种细胞是昆虫细胞。
12.根据权利要求10的用途，其中所述另一种细胞是哺乳动物细胞。
13.根据权利要求10的用途，其中所述另一种细胞是大肠杆菌。
14.一种筛选靶基因的方法，包括下列步骤(i)产生克隆在根据权利要求1-9中任一项的杆状病毒中的基因或基因组片段的文库；(ii)用该载体转化宿主细胞；和(iii)在预定的条件下检测基因表达。
15.根据权利要求14的方法，其中预定的条件包括一组不同的条件，在这些条件下可能检测到或者可能无法检测到靶基因的表达。
16.根据权利要求15的方法，其中不同的条件包括有限稀释。
17.根据权利要求14-16中任一项的方法，其中步骤(iii)包括表型的鉴定。
18.根据权利要求14-17中任一项的方法，其中在筛选预定条件的一种或一些产物之后重复步骤(iii)。
19.根据权利要求14-18中任一项的方法，它还包括表征在预定的条件下表达的基因。
全文摘要
工程改造杆状病毒，使得衣壳展示一种或多种异源肽或蛋白质。所得杆状病毒能够用来递送治疗剂，以及在功能基因组学中应用。
文档编号C12N15/86GK1643153SQ03805769
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月12日 优先权日2002年3月12日
发明者S·雅拉－赫图拉, K·J·艾伦尼 申请人:Ark治疗学有限公司