专利名称：生物技术制备木糖醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制备木糖醇(xylite)的方法，该方法使用了可将木糖代谢为木糖醇的微生物。
背景技术：
木糖醇是天然存在的糖醇，由于其在代谢过程的降解是非胰岛素依赖的，因此最常在保健食品中被用作糖替代物。
木糖醇还被用于制药工业，例如，用于牙膏。
由于与蔗糖相比，木糖醇具有近似的甜度而没有致癌效应，因而被广泛地应用于口香糖、咀嚼片和类似产品。
现有技术中木糖醇经化学路线合成，高压高温下在镍催化剂上还原木糖，平均生产率为所用木糖的50至60％。
木糖是植物源原料的主要成分，其通过酸性水解或亚硫酸盐沥滤，从富含半纤维素的植物残渣中获得。
为了克服化学方法中木糖醇低生产率的缺点，例如，在EP 0716067中提及，从葡萄糖酸开始，经过若干处理步骤，化学制备木糖醇，从而获得60至70％的生产率。
这些化学方法的共同特点是成本高，和/或为了通过化学路线制备木糖醇，需要使用与环境不相容的催化剂。更为突出地，为了此目的而使用了镍催化剂，镍催化剂的使用会导致环境保护方面的问题。
此外，这些化学方法中部分反应在70至150℃的高温和高达10Mpa的高压下进行。而且，这些化学方法还需要复杂的纯化和浓缩步骤，以最终获得纯净的木糖醇。
另一种不同于化学制备木糖醇的方法，生物技术方法在现有技术中已有描述，其在将木糖转化为木糖醇的过程中提供了非常高的生产率。
德巴利氏酵母属，假丝酵母属和毕赤酵母属用作微生物，一方面是因为，这些微生物是天然的木糖利用者，可在限氧条件下将木糖转化为木糖醇。
该反应在辅因子NADH的参与下经木糖还原酶(XR)而催化。
作为一种天然的木糖醇形成剂的替换物，微生物经如EP 0670161中教导的基因技术修饰以便经此处理后，它们还能够通过利用其它碳源来形成木糖醇。
EP 0640429中描述了另一种通过生物技术路线增加木糖醇产量的策略，合成和代谢木糖醇的酵母经基因技术修饰，从而消除了转化所需终产物的酶。
根据这一发明的教导，导致所需木糖醇最终产物的转化和/或降解的基因表达被消除或减少了。
现有技术中还已知以非天然方式还原木糖的微生物，这些微生物经基因技术处理后能够形成木糖还原酶并因此能够利用木糖制备木糖醇。
还已知这种木糖还原酶可被强烈地过表达从而改善生产率。
上述生物技术方法的共同特征为即使在强烈地过表达木糖还原酶并且同时消除了参与木糖醇天然代谢的酶的情况下，也无法足够有效地提高木糖醇的生产率，以便成本有效地通过生物技术的方法路线制备木糖醇。
发明内容
因此，本发明的任务是提供一种优势在于自木糖经生物技术制备木糖醇过程中木糖醇的生产率较高的方法，从而使得这一方法具有经济上的可行性。
本发明的任务通过一种生物技术制备木糖醇的方法得以实现，该方法使用可将木糖代谢为木糖醇的微生物，并且该方法包括如下工序a)修饰微生物从而减少或消除除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化，b)在含有木糖和10-40克每升亚硫酸盐(例如亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾)的底物中培养微生物，c)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期培养微生物，以及d)自底物中富集和提取木糖醇。
木糖向木糖醇的转化路线如下
如已描述的那样，此反应在辅因子NADH的参与下经木糖还原酶而催化。
如已在本领域文献中描述且讨论过的，在修饰微生物的情况中，通过酶的过表达，催化该反应的木糖还原酶的过量供应不会导致木糖醇产率的大量提高，因此也不能导致木糖醇生成中的经济上的改善。
令人惊奇的是，已发现木糖转化为木糖醇的反应强烈地依赖于辅因子NADH的可获得性并受其限制。
根据本发明的概念，应以这样的方式修饰微生物例如，消除微生物其它的NADH消耗酶系，例如线粒体NADH脱氢酶，乙醇脱氢酶和磷酸甘油脱氢酶。
本发明的修饰微生物的效果是基于上述酶显示了与这种辅因子较强亲和力的事实基础上的。
如果NADH优先被与木糖还原酶相竞争的酶氧化成NAD(P)，所需的辅因子就无法提供至高木糖醇生产率所需的程度。
根据本发明，应用经遗传修饰的微生物的结果是经本发明的方法实质地提高了木糖醇的生产率。因此，这种方法与以前的化学方法相比，是一种具有吸引力的替换方法，因为其克服如上所述为了解决同一任务的其它生物技术方法的缺陷。
而且，本发明方法的特殊优势在于，其可以使用可再生的原料并且与常规的化学方法相比，不存在因使用镍催化剂而引起的环境损害。
此外，生物技术方法自身固有反应条件相对温和的特点，因此通常较化学方法更易于与环境相容。实例中的描述显示了个别微生物，特别是酵母，怎样先经修饰然后被用于制备木糖醇。
糖酵母菌属酵母对生物技术方法具有重要意义。在这些酵母中，NADH经不同的代谢路线被氧化。特别值得提及的是醇发酵、由外线粒体NAHD脱氢酶制备和氧化甘油。这些酶与NADH的亲和力较木糖还原酶更高，因此辅因子优先被这些酶氧化。
由于NADH经此概述的分解路线而消耗，因此提供于木糖还原的NADH供应受到限制，无法制备更多的木糖醇。
根据本发明，可通过如下方法提高细胞质中可用的NADH的含量以及因而参与木糖还原酶反应的NADH量失活微生物中一种或几种导致NADH氧化的酶或抑制其表达。
酵母的内膜线粒体不能透过NADH；因此，酶系的修饰针对与氧化相关的细胞质NADH脱氢酶。
在酿酒酵母中，基因NDE1和NDE2编码外NADH脱氢酶，然而GPD1和GPD2编码磷酸甘油脱氢酶。根据本发明，上述一种或几种基因的抑制导致可替换代谢路线中NAD消耗的减少，并使得可用于木糖还原酶的NADH达到更高程度。
根据本发明的优选实例，向酿酒酵母中加入浓度为10至40克每升的亚硫酸盐(例如亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾)底物时，同等地抑制了葡萄糖降解为乙醇。因此，甘油产量增加。
根据本发明，通过基因技术抑制消耗NADH的磷酸甘油脱氢酶的表达可抵消甘油的形成。
在这些条件下，木糖醇的产量辅因子NADH而提高，NADH由于磷酸甘油脱氢酶受到抑制而被额外地提供，从而被自木糖形成木糖醇的木糖还原酶利用。
本发明使用经修饰微生物的方法的这一效果被一个实例证明是可以实现的，特别是使用了经重组DNA技术修饰的微生物基因。可替换地，微生物的修饰可通过受控的或随机的基因突变而实现。
微生物的这种修饰可以这样的方式进行，在第一步中，破坏和/或处理利用NADH辅因子的酶序列，使其不能被微生物制备或仅能被活性减弱了的酶合成。
基因技术修饰微生物的这些方法是技术状态的一部分。以这样的方式遗传处理的微生物提高了木糖醇的产量并将其累积于生长培养基中，木糖醇可通过结晶和/或色谱方法自此生长培养基中富集和/或提取。下面实例中的描述举例说明了微生物修饰和木糖醇回收的方法。
具体实施例方式
实施例1首先，描述表达异种木糖还原酶的制备酵母株。
酵母中异种木糖还原酶的表达是现有技术的一部分，描述于例如WO91/15588中。
Pichia stipitis在100ml YPD(11培养基中包含10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄糖，pH＝6.5)中于30℃培养过夜。10ml培养基中的细胞经离心成团并分离染色体DNA，参照Kaiser等(1994)的试验设计。这一DNA用作XYL1基因956bp无内含子(introne-free)开放读码框PCR扩增的模板(Amore等1993)。所得片断在1％琼脂糖凝胶中分离并使用Genomed的“JETQUICK Gel Extraction Spin Kit”进行纯化。质粒经相应的限制性核酸内切酶处理并经上述方法纯化。使用p425GPD作为载体以在酿酒酵母菌中的表达。此载体是多拷贝质粒且包含作为选择标记物的酿酒酵母菌LEU2基因(Mumberg等1995)。此载体经相同的限制性核酸内切酶切为片断并相应地纯化。XYL1基因的开放读码框扎结于载体中，通过质粒制备和限制性分析鉴定重组质粒。在使用此方法制备的质粒(p425GPD-PsXYL1)中，XYL1的转染易于受强GPD启动子的控制，并确保酿酒酵母菌中外源XR的高表达。酿酒酵母菌株KOY50(MATa；his3Δ1；leu2Δ；ura3Δ0)被p425GPD-PsXYL1转化，参照Schietstl和Gietz的方法(1989)。分离并分析了Leucin-原养型转化体。
实施例2通过基因NDE1和NDE2基因替换失活NADH脱氢酶位于线粒体的细胞溶质的NADH脱氢酶与XR竞争辅因子NADH。为了减少细胞溶质的NADH消耗，通过适宜的DNA片断基因替换使得基因NDE1和NDE2失活。与NDE1起始密码子5’端40bp同源和终止密码子3’端40bp同源的替换片断经PCR扩增。此片断包含裂殖酵母属稷酒的his5+基因和补充有酿酒酵母菌的his3突变(Wach等1997)。扩增后，如上述方法分离纯化此片断。根据Schiestl和Gietz(1989)的方法使用替换片断转化酿酒酵母菌株KOY50。分离组氨酸原养型转化体。使用诊断PCR证实此片断正确整合与NDE1取代。这一菌株(KOY50Δndel)经p425GPD-PsXYL1转化，如实施例1所述，并用于制备木糖醇。
如上述方法构建NDE2同源替换片断，用以制备nde1/nde2双突变体。此时使用kanMX组件(Wach等1994)作为选择性标记物。此组件使转化体可耐受G418(geneticine)。转化后，KOY50Δnde1细胞置于包含G418的培养基上。抗性克隆经诊断PCR测试以确定正确插入了替换片断并使NDE2失活。所得菌株(KOY50Δnde1Δnde2)经p425GPD-PsXYL1转化，如实施例1所述，并用于制备木糖醇。
实施例3编码磷酸甘油脱氢酶的基因GPD1和GPD2的基因替换细胞质的磷酸甘油脱氢酶GPD1p和GPD2p利用NADH作为辅因子。它们的失活优先导致通过使用XR将木糖还原为木糖醇对细胞溶质的NADH的氧化。在基因替换时，使用了酿酒酵母菌株KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2。
这两菌株均负有ura3Δ0突变。为了此分裂作用，使用了含有与GPD1和GPD2同源的片断，如实施例2中对于NDE1的描述。包含白色假丝酵母URA3基因的片断作为选择性标记物。此选择性标记物侧翼的DNA部分彼此相同(Goldstein等1999)。白色假丝酵母的URA3补充酿酒酵母菌中ura3突变。
尿嘧啶代谢未受损的细胞与ura3突变细胞相反，对于5-氟orodic acid(5-FOA)敏感。将分裂盒整合入基因组后，在重复DNA部分上生成自发同源重组并因此失去URA3标记物。发生这样的重组的克隆可被简便的分离，因为它们能耐受5-FOA。
上述DNA片断经PCR扩增并纯化。CPD1基因替换片断根据Schiestl和Cietz(1989)在酿酒酵母KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2中的方法转化。
尿嘧啶原养型转化体在相应的选择培养基上分离。通过诊断PCR替换GPD1。接着，此方法构建的菌株经5-FOA耐受选择。在5-FOA耐受的菌株中，通过诊断PCR检测URA3标记物的损失。最后，如上所述，在进一步的工作中失活GPD2。
这样构建的菌株经p425GPD-PsXYL1转化，如实施例1所述，并用于制备木糖醇。
实施例4通过四分体分析(tetrad analysis)脱氢酶失活的菌株的制备为了制备几种脱氢酶失活的菌株，首先分别失活各相关基因，如实施例2中所述。随后杂交育种各突变体并因此形成deploid菌株的孢子，进行四分体分析。
双突变体可在非亲代双型(NPD)中简便地鉴定。KOY50株用于失活GPD1和GPD2，如实施例2中对于NDE1的描述，各自被基因替换。杂交相反配对型的转化体，所得菌株在相应培养基上导致孢子形成(sporilate)。四分体测试组氨酸原养型。NPD四分体GPD1/GPD2双零突变体作为组氨酸-原养型单孢子的克隆而被分离，经p425GPD-PsXYL1转化，并用于制备木糖醇。
权利要求
1.使用可将木糖代谢为木糖醇的微生物制备木糖醇的生物技术方法，该方法包括如下步骤a)修饰微生物从而减少或消除除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化，b)在含有木糖和每升10-40克亚硫酸盐(例如亚硫酸氢钙、亚硫酸钠或亚硫酸钾被用作亚硫酸盐)的底物中培养所述微生物，c)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期培养所述微生物，d)自底物中富集和提取木糖醇。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于经修饰的微生物中至少一种酶的表现活性减弱或没有活性，这些酶为磷酸甘油脱氢酶，外线粒体NADH脱氢酶或乙醇脱氢酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于此微生物中编码磷酸甘油脱氢酶、外线粒体NADH脱氢酶或乙醇脱氢酶的基因的表达被消除或减弱了。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所用的微生物是假丝酵母属、糖酵母菌、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、裂殖酵母属和德巴利式酵母属。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于使用酿酒酵母时，NED1、NED2、GPD1和GPD2中至少一种基因被消除或失活。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其特征在于半乳糖、甘露糖、葡萄糖或阿拉伯糖被用于底物中作为进一步的碳源。
全文摘要
本发明涉及一种生物技术制备木糖醇的方法，其中使用了可将木糖代谢为木糖醇的微生物。本发明方法包括如下步骤a)对微生物进行修饰，以便减少或排除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化；b)在包含木糖和10－40克每升的亚硫酸盐(例如，亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾)的底物中培养此微生物；c)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期中培养此微生物；以及d)富集并自底物中收回木糖醇。
文档编号C12P19/00GK1653187SQ03811033
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月15日 优先权日2002年5月15日
发明者托马斯·沃尔瑟, 卡伊·奥斯特曼, 汉斯-弗里德·利斯特尼克, 托马斯·布莱, 格哈德·罗德尔 申请人:德累斯顿科技大学