专利名称：无细胞生产葡糖胺的制作方法
技术领域：
本发明涉及从淀粉、麦芽糖糊精或糖原无细胞生产葡糖胺的方法；或者从果糖和氨基基团源无细胞生产葡糖胺的方法。
相关领域葡糖胺是一种氨基糖，存在于许多天然多糖产物中。已经发现葡糖胺在骨关节炎和其他疾病的治疗中有着越来越多的用处。葡糖胺传统地通过将由聚(N-乙酰-D-葡糖胺)组成的甲壳类外甲壳(几丁质)水解而产生。然而，原材料的可获得性正日益受到限制。最近，公开了通过微生物发酵生产葡糖胺。美国专利US6372457公开了为了高水平生产葡糖胺，在与葡糖胺或者葡糖胺-6-磷酸相关的通路中进行了遗传修饰的微生物发酵。
本领域中仍然需要采用丰富而廉价的起始材料生产葡糖胺的方法。
发明概述本发明涉及一种从淀粉、麦芽糖糊精或糖原生产葡糖胺-6-磷酸的无细胞方法，包括将淀粉、麦芽糖糊精或糖原在反应混合物中与谷氨酰胺一起温育，该反应混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种生产葡糖胺的无细胞方法，包括将果糖和氨基基团源在反应混合物中一起温育，该反应混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
本发明的又一实施方案涉及一种从淀粉、糖原或麦芽糖糊精生产葡糖胺-6-磷酸的无细胞方法，其中包括将淀粉、糖原或麦芽糖糊精在反应混合物中与谷氨酰胺一起温育，该反应混合物中包含磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖-6-磷酸异构酶(也被称为磷酸葡糖异构酶)、葡糖-1，6-二磷酸以及含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的细胞提取物。
本发明的另一实施方案涉及一种从淀粉、糖原或麦芽糖糊精生产葡糖胺-6-磷酸的无细胞方法，其中包括将淀粉、糖原或麦芽糖糊精在反应混合物中与铵源一起温育，该反应混合物中包含磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、葡糖-1，6-二磷酸以及含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种生产葡糖胺的无细胞方法，包括将果糖和谷氨酰胺在反应混合物中一起温育，该反应混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的细胞提取物。
在又一实施方案中，本发明涉及一种生产葡糖胺的无细胞方法，包括将果糖和铵源在反应混合物中一起温育，该反应混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
本发明另外的实施方案涉及一种含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物，其中所述的提取物是通过收集通过30％至60％硫酸铵饱和度进行硫酸铵沉淀所产生的沉淀而制备的。
在又一实施方案中，本发明涉及一种生产葡糖胺的无细胞方法，包括将葡糖胺-6-磷酸和磷酸化酶在反应混合物中一起温育。
发明详述从淀粉、麦芽糖糊精或糖原生产葡糖胺的酶促反应途径已经被确定。淀粉或糖原的末端葡糖残基能在磷酸化酶作用下从聚合物中释放并转移到磷酸分子上，所述磷酸化酶切割糖苷键以形成葡糖-1-磷酸。在活化剂葡糖-1，6-二磷酸存在的情况下使用葡糖磷酸变位酶，产物葡糖-1-磷酸被转换成葡糖-6-磷酸，后者用磷酸葡糖异构酶转化成果糖-6-磷酸。葡糖胺-6-磷酸合酶(葡糖胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶)通过将氨基基团从谷氨酰胺转移给果糖-6-磷酸而形成葡糖胺-6-磷酸。或者，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶也可以通过将氨基基团转移给果糖-6-磷酸而形成葡糖胺。最后，磷酸酶催化从葡糖胺-6-磷酸上去除磷酸基团从而产生葡糖胺。从葡糖胺-6-磷酸释放出来的磷酸可用于磷酸化酶对淀粉、麦芽糖糊精或糖原进一步切割。
葡糖胺-6-磷酸合酶催化由果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的氨基基团合成葡糖胺-6-磷酸。由于果糖-6-磷酸的磷酸基团在反应期间维持完整并且没有参与到转氨酶反应中，该酶能够以密切相关的化合物果糖为底物而发挥功能。
葡糖胺-6-磷酸脱氨酶也能催化由果糖-6-磷酸和铵合成葡糖胺-6-磷酸。如上所述，果糖-6-磷酸的磷酸基团在反应期间维持完整并且没有参与到转氨酶反应中，并且该酶能够以密切相关的化合物果糖为底物以低速率发挥功能。
在本发明的第一个实施方案中，制备了用于从淀粉、糖原、麦芽糖糊精或其他底物生产葡糖胺的含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。细胞提取物可以从含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的任何细胞中制备。优选的，从已知含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的细胞中制备。细胞可以是真核或原核细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞。原核细胞可以是细菌细胞。在一个优选实施方案中，细胞提取物从大肠杆菌细胞中制备。细胞可以是培养的细胞或取自组织或器官的细胞。细胞提取物可以从任意量的细胞中制备，这取决于期望的葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的量。
细胞提取物可以通过任何已知能保持酶活性的制备提取物的方法制备。优选地，提取物通过以下步骤制备裂解细胞，例如通过超声裂法，去除细胞的碎片以及通过硫酸铵沉淀对所得提取物进行分级分离，从而至少部分纯化葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性。在优选实施方案中，采用的是在30％至60％硫酸铵饱和度下所形成沉淀中发现的级分。更优选的是，既可采用在30％至50％硫酸铵饱和度中所形成沉淀中发现的级分也可采用在40％至60％硫酸铵饱和度中所形成沉淀中发现的级分。虽然这些级分有很大程度的重叠，但是在30％至50％硫酸铵饱和度中所形成沉淀中发现的级分将包含更多脱氨酶的活性，而在40％至60％硫酸铵饱和度中所形成沉淀中发现的级分将包含较高水平的合酶活性。含有葡糖胺-6-磷酸合酶或脱氨酶活性的沉淀可以重悬浮于任何能保持合酶或脱氨酶活性的缓冲液中。例如缓冲液可以是但不限于，100mM Tris，pH7.5；100mM NaCl或50mMTris，pH7.5；可以用100mM NaCl。
细胞提取物的制备，包括分级分离，可以通过检测葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性进行监控。酶活可以通过本领域已知的任何方法检测。在一个实施方案中，酶活性的测量可以通过采用果糖-6-磷酸和谷氨酰胺或铵源作为底物，并检测葡糖胺-6-磷酸产生。在另一实施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶的活性可以同谷氨酸脱氢酶的活性联系在一起，使得合酶反应的产物谷氨酸被脱氨基，同时辅酶NADP+被还原成NADPH。因此合酶的活性可以通过分光光度法在340nm波长下检测NADPH的产量而被检测。在这一实施方案中，用于检测合酶活性的典型反应混合物包含100mM磷酸钾，pH7.5；50mM KCl；5mM果糖-6-磷酸；5mM谷氨酰胺；2mM EDTA；0.5mM NADP+；30U谷氨酸脱氢酶；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
在另一实施方案中，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的检测采用葡糖胺-6-磷酸作为底物并检测果糖-6-磷酸。
在另一实施方案中，葡糖胺-6-磷酸的活性可以同葡糖-6-磷酸脱氢酶的活性联系在一起，使得果糖-6-磷酸被磷酸葡糖异构酶转换成葡糖-6-磷酸，葡糖-6-磷酸被氧化成D-葡糖酸-1，5-内酯-6-磷酸，NADP+被还原成NADPH。因此活性可以通过分光光度法在340nm下检测NADPH的产量而被检测。在这一实施方案中，用于检测脱氨酶活性的典型反应混合物包含100mM Tris-HCl，pH7.85mM NADP+10mM MgCl25mM葡糖胺-6-磷酸5U磷酸葡糖异构酶0.4U葡糖-6-磷酸脱氢酶酶提取物在一个优选实施方案中，制备的细胞提取物将具有至少大约0.01U/mg蛋白质的葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶比活性，更优选的为大约0.1U/mg蛋白质至大约1.0U/mg蛋白质，最优选为大约0.2U/mg蛋白质的比活性。
在本发明的又一实施方案中，采用一种无细胞方法利用含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物从淀粉、麦芽糖糊精或糖原中生产葡糖胺-6-磷酸。在这个实施方案中，淀粉、麦芽糖糊精或糖原在含有细胞提取物的反应混合物中与谷氨酰胺或铵源一起温育。淀粉可以是任何淀粉，包括但不限于，可溶淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米淀粉、木薯淀粉或小麦淀粉。麦芽糖糊精是不甜的、由主要靠(α)-1，4键连接的D-葡糖单元组成的天然多糖聚合物。麦芽糖糊精由淀粉的部分水解而形成。淀粉可以是任何淀粉，包括，但不限于，可溶淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米淀粉、木薯淀粉或小麦淀粉。可以被本发明采用的麦芽糖糊精包括，但不限于，麦芽糖糊精10。糖原可以是任何来源，包括，但不限于，兔肝、牛肝、贻贝或牡蛎。在反应混合物中的细胞提取物优选浓度为大约1％至大约20％，更优选为大约5％至大约15％，最优选为大约10％。在反应混合物中的淀粉、麦芽糖糊精或糖原优选浓度为大约0.05％至大约2.0％，更优选为大约0.1％至大约1.0％，最优选为大约0.2％。温育进行的优选温度为大约20℃至大约50℃，更优选为大约25℃至大约40℃，最优选为大约30℃。反应进行时间优选为大约10分钟至大约2小时，更优选为大约30分钟至大约1.5小时，最优选为大约1小时。
在优选实施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶以及从淀粉、麦芽糖糊精或糖原中生产葡糖胺-6-磷酸所需要的辅助因子被加入到反应混合物中。这包括磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶和磷酸葡糖异构酶以及活化剂葡糖-1，6-二磷酸中的一种或多种。反应混合物中包含磷酸源；淀粉、麦芽糖糊精或糖原、KCl、谷氨酰胺、镁源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸变位酶；磷酸葡糖异构酶和细胞提取物。磷酸源可以包括，但不限于，磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁、磷酸钙、磷酸或磷酸铵。镁源可以包括，但不限于，氯化镁、硫酸镁和柠檬酸镁。在一个优选实施方案中，反应混合物包含100mM磷酸钾，pH7.0；0.2％可溶淀粉；50mM KCl；5mM谷氨酰胺；5mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U/ml磷酸化酶a；5U/ml葡糖磷酸变位酶；25U/ml磷酸葡糖异构酶；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
在另一优选实施方案中，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶以及从淀粉、麦芽糖糊精或糖原中生产葡糖胺-6-磷酸所需要的辅助因子被加入到反应混合物中。这包括磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶和磷酸葡糖异构酶以及活化剂葡糖-1，6-二磷酸中的一种或多种。反应混合物中包含磷酸源；淀粉、麦芽糖糊精或糖原、KCl、铵源、镁源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸变位酶；磷酸葡糖异构酶和细胞提取物。磷酸源可以包括，但不限于，磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁、磷酸钙、磷酸或磷酸铵。镁源可以包括，但不限于，氯化镁、硫酸镁和柠檬酸镁。铵源可以包括，但不限于，硫酸铵、磷酸铵、氯化铵或氢氧化铵。在一个优选实施方案中，反应混合物包含100mM磷酸钾，pH7.5；0.2％麦芽糖糊精10；50mM KCl；50mM硫酸铵；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U/ml磷酸化酶a；16U/ml葡糖磷酸变位酶；25U/ml磷酸葡糖异构酶；以及包含葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的40-60％硫酸铵沉淀分离液。
在如上所述葡糖胺-6-磷酸生产之后，需要去除磷酸基团以产生葡糖胺。因此，本发明的进一步实施方案是一种无细胞生产葡糖胺的方法，其中包括将葡糖胺-6-磷酸与磷酸酶在反应混合物中温育。磷酸酶可以是任何能从葡糖胺-6-磷酸有效脱磷酸化的磷酸酶。例子包括虾碱性磷酸酶、牛肠碱性磷酸酶和细菌碱性磷酸酶。温育进行的优选温度为大约20℃至大约50℃，更优选为大约25℃至大约40℃，最优选为大约30℃。反应进行时间优选为大约10分钟至大约2小时，更优选为大约10分钟至大约1小时，最优选为大约10分钟。反应混合物包含适合去磷酸化步骤发生的缓冲液，优选碱性缓冲液，例如Tris，pH8.5。在具体实施方案中，反应混合物包含20mM葡糖胺-6-磷酸；5U/ml虾碱性磷酸酶；50mM Tris，pH8.5；以及5mM MgCl2。
而在另一优选实施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶被用来直接从果糖生产葡糖胺。反应混合物包含果糖、谷氨酰胺、KCl以及细胞提取物。在一个优选实施方案中，反应混合物包含20mM果糖；50mM KCl；5mM谷氨酰胺；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
在进一步优选实施方案中，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶被用于从果糖直接生产葡糖胺。反应混合物包含果糖、铵、KCl以及细胞提取物。在一个优选实施方案中，反应混合物包含20mM果糖；50mM KCl；250mM硫酸铵；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
本发明的另一实施方案是一种生产葡糖胺的无细胞方法，其中包括在包含具有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性细胞提取物的反应混合物中温育果糖和氨基基团源。在反应混合物中细胞提取物的优选浓度为大约1％至大约20％，更优选为大约5％至大约15％，最优选为大约10％。在反应混合物中果糖的优选浓度为大约1mM至大约100mM，更优选为大约10mM至大约50mM，最优选为大约20mM。氨基基团源可以是任何能够贡献氨基基团给酶反应的化合物。例子包括谷氨酰胺和铵盐。在采用谷氨酰胺时，它在反应混合物中的优选浓度为大约1mM至大约100mM，更优选为大约2mM至大约50mM，最优选为大约5mM。在一个优选实施方案中，反应混合物包含100mM Tris，pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；5mM谷氨酰胺；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
温育进行的优选温度为大约20℃至大约50℃，更优选为25℃至大约40℃，最优选为30℃。反应进行时间优选为大约10分钟至大约2小时，更优选为大约15分钟至大约1小时，最优选为大约20分钟。在采用铵盐作为氨基基团源时，合适的盐包括，但不限于，硫酸铵、磷酸铵、氯化铵以及氢氧化铵。存在的铵优选浓度为大约10mM至大约1000mM，更优选为大约50mM至大约500mM，最优选为大约250mM。在优选实施方案中，反应混合物包含100mM Tris，pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；250mM硫酸铵；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
随后的实施例将说明但并不限制本发明的方法和组合物。其他在化学品酶法生产通常遇到的多种条件和参数的修饰和修改，以及对于本领域人员来说显而易见的修饰和修改，属于本发明的原则和保护范围之内。
实施例1从大肠杆菌细胞中分离和检测葡糖胺-6-磷酸合酶从冷冻小瓶中拿出的大肠杆菌细胞被接种到含有12L发酵种子培养基的培养烧瓶中。培养基中含有以下化学物质(g/L)玉米浸出液，10；KH2PO4，2.5；MgSO4·7H2O，2.0；(NH4)2SO4，0.5；柠檬酸，0.192；FeSO4·7H2O，0.03，MnSO4·H2O，0.021；消泡剂6000K，0.5；右旋葡糖，84。种子发酵罐在39℃以700rpm的搅拌速度和3.5LPM的气流操作。发酵的pH值用21％ NH4OH维持在6.9。在生长24小时后，培养液被离心而沉淀被重悬浮于提取缓冲液中(100mMTris，pH7.5；100mM NaCl)。细胞被离心并且沉淀以OD660值为大约200的浓度重悬浮于提取缓冲液中。采用声裂法处理细胞4次，30秒，间隔1分钟。采用离心分离细胞碎片并且留下悬浮物作为酶提取物。在提取物中加入硫酸铵至226g/L(40％饱和度)，对提取物进行离心。在上清液中加入120g/L硫酸铵(60％饱和度)。离心之后，收集沉淀，并在提取缓冲液中重悬浮。绝大多数葡糖胺-6-磷酸活性存在于这一部分。
葡糖胺-6-磷酸合酶的活性可以通过与谷氨酸脱氢酶的活性联系在一起而被检测，谷氨酸脱氢酶使合酶反应的产物谷氨酸脱氨基，且将辅酶NADP+还原成NADPH。在反应中所产生NADPH的量用分光光度计在340nm波长下的吸光率来监控。酶比活性的计算基于在加入大肠杆菌提取物之后原始吸收率的变化。检测中包含如下物质100mM磷酸钾，pH7.5；50mM KCl；5mM果糖-6-磷酸；5mM谷氨酰胺；2mM EDTA；0.5mM NADP；30U谷氨酸脱氢酶；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总提取物)。
在粗提取物中有大约0.02U/mg蛋白质葡糖胺-6-磷酸合酶活性，在硫酸铵沉淀后有0.2U/mg蛋白质的活性。葡糖胺-6-磷酸的产生也通过液相色谱分析而确定。
实施例2结合酶反应从淀粉中生产葡糖胺-6-磷酸在这个实施例中，从淀粉中无细胞生产葡糖胺-6-磷酸是通过在反应混合物中结合几种酶而完成的。反应混合物中包含100mM磷酸钾，pH7.0；0.2％可溶淀粉50mM KCl；5mM谷氨酰胺；5mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；
10U磷酸化酶a(Sigma)；5U葡糖磷酸变位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖异构酶(Sigma)；以及10％大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)。
淀粉通过加热至沸腾而溶解在水中。反应混合物被温育在30℃水浴中1小时并且分析葡糖胺-6-磷酸。对照组由包含热失活大肠杆菌提取物或没有淀粉溶液的反应混合物组成。
HPLC数据显示在反应中产生了葡糖胺-6-磷酸(175μg/ml)。在反应混合物中检测到葡糖胺-6-磷酸和果糖-6-磷酸。在包含热失活大肠杆菌提取物或没有淀粉溶液的对照反应中，没有检测到葡糖胺-6-磷酸。
实施例3结合酶反应从麦芽糖糊精和谷氨酰胺生产葡糖胺-6-磷酸在这个实施例中，从麦芽糖糊精中无细胞生产葡糖胺-6-磷酸是通过在反应混合物中结合几种酶而完成的。反应混合物中包含100mM磷酸钾，pH7.5；0.2％麦芽糖糊精1050mM KCl；5mM谷氨酰胺；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U磷酸化酶a(Sigma)；16U葡糖磷酸变位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖异构酶(Sigma)；100μL 40-60％(NH4)2SO4分离液反应在30℃中温育1小时并分析葡糖胺-6-磷酸。包括了对照反应。这些由没有大肠杆菌提取物和没有麦芽糖糊精的反应组成。HPLC数据显示通过这个反应产生了130μg/ml葡糖胺-6-磷酸。对照反应没有产生任何葡糖胺-6-磷酸。当用100μl粗大肠杆菌提取物替换时，对于40-60％硫酸铵分离液产生48μg/ml葡糖胺-6-磷酸。
实施例4结合酶反应从麦芽糖糊精和硫酸铵生产葡糖胺-6-磷酸这个实施例说明从麦芽糖糊精无细胞生产葡糖胺-6-磷酸。反应是通过在反应混合物中结合几种酶而完成的。反应中包含100mM磷酸钾，pH7.5；0.2％麦芽糖糊精1050mM KCl；50mM(NH4)2SO4；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U磷酸化酶a(Sigma)；16U葡糖磷酸变位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖异构酶(Sigma)；100μL 40-60％(NH4)2SO4分离液加H2O至总体积为1ml反应温育1小时并分析葡糖胺-6-磷酸。对照由没有大肠杆菌提取物且没有麦芽糖糊精的反应组成。HPLC数据显示在这个反应中产生了葡糖胺-6-磷酸(111μg/ml)。在对照反应中，没有产生葡糖胺-6-磷酸。
实施例5通过磷酸酶从葡糖胺-6-磷酸生产葡糖胺在这个实施例中，从葡糖胺-6-磷酸无细胞生产葡糖胺是在以下反应混合物中完成的20mM葡糖胺-6-磷酸(Sigma)；5U虾碱性磷酸酶(Sigma)；
50mM Tris，pH8.5；以及5mM MgCl2；1ml反应混合物在30℃中温育10分钟并通过HPLC分析葡糖胺。在反应混合物中检测到葡糖胺(2.8mg/ml，13mM)。在没有包含底物葡糖胺-6-磷酸或没有磷酸酶的对照组中没有检测到葡糖胺。
实施例6从果糖和谷氨酰胺生产葡糖胺建立从果糖和谷氨酰胺生产葡糖胺的酶反应。包含100mM TrispH7.5；50mM KCl；20mM果糖；5mM谷氨酰胺；以及0.1ml大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)的1ml反应体系在30℃中温育20分钟，并且样本被进行葡糖胺分析。采用带有热失活大肠杆菌提取物的反应体系作为对照。
分析结果显示在20分钟内从果糖和谷氨酰胺形成了92.5μg葡糖胺。这个反应的比活性为23mmol/min/mg蛋白，比天然底物果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的活性低10倍。在带有热失活大肠杆菌提取物的对照中没有检测到葡糖胺。
实施例7从果糖和铵生产葡糖胺建立从果糖和铵生产葡糖胺的酶反应。包含100mM Tris pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；250mM硫酸铵；以及0.1ml大肠杆菌提取物(1mg/ml总蛋白)的1ml反应体系在30℃中温育20分钟。样本通过HPLC分析葡糖胺产生。采用带有热失活大肠杆菌提取物的反应体系作为对照。
结果显示在20分钟反应内从果糖和铵形成了6μg/ml葡糖胺。这个反应的比活性为1.5mmol/min/mg蛋白，比天然底物果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的活性低130倍。在带有热失活大肠杆菌提取物的对照中没有检测到葡糖胺。
实施例8将nagB基因克隆入pKK223-3为了构建nagB表达质粒，在nagB翻译起始密码子的前端和nagB翻译终止密码子的下游分别插入EcoRI和HindIII限制性酶切位点。用于聚合酶链式反应(PCR)的引物为5′-CATCTAGAATTCATGAGACTGATCCCCCTGACTACC-3′(SEQID NO1)和5′-CATCTAAAGCTTCAAGGAGCCAGGGCAGGG-3′(SEQ ID NO2)。PCR反应基于来自Invitrogen的PCR反应试剂盒的操作规则来进行。反应由1ng大肠杆菌基因组DNA，0.3um每种引物，dNTP混合物(每种dNTP 0.3um)，1mM MgSO4，以及在1X Pfx扩增缓冲液中的1U铂Pfx DNA聚合酶组成。800-bp PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳回收，用EcoRI和HindIII限制性酶消化，并连接入质粒pKK223-3的EcoRI-HindIII位点。然后将质粒转化进入大肠杆菌DH5a菌株。在LB培养基中生长时，nagB基因产物的过表达通过IPTG诱导。
在含有50mM Tris缓冲液，pH7.8，5mM葡糖胺-6-磷酸，5U葡糖胺-6-磷酸异构酶，5U葡糖-6-磷酸脱氢酶，1mM NADP和酶提取物的混合物中检测葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的活性。活性通过340nm吸收值的变化而跟踪。在包含nagB表达质粒菌株的提取物中葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的活性比宿主菌株大肠杆菌DH5a的提取物高大约50倍。
实施例9从果糖和铵生产葡糖胺实施了在砷酸钠存在的情况下从果糖和铵生产葡糖胺的酶反应。1ml反应体系中包含以下物质100mM HEPES，pH7.2100mM NaAsO4，pH7.2
20mM MgCl2250mM果糖100mM(NH4)2SO4100μl大肠杆菌粗提取物(2.8mg/ml总蛋白)反应体系在50℃中温育24小时并分析葡糖胺的存在。对照由没有果糖、没有粗提取物和带有沸腾过的粗提取物的反应体系组成。在没有果糖的对照中没有检测到葡糖胺。没有粗提取物的对照和带有沸腾过的提取物的对照中含有大约280μg/ml。采用带有克隆化过表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的细胞制成的粗提取物产生大约1300μg/ml。采用来自非转化细胞(即没有包含克隆化葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的细胞)制成的粗提取物结果为产量是大约290μg/ml葡糖胺。在带有克隆化过表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的细胞制成的粗提取物中，果糖转化为葡糖胺的活性大约增加了100倍。
现在已经充分描述了本发明，要理解的是对于本领域人员来说，在宽泛而等价的各种条件，公式和其他参数之内同样可以实现本发明而没有影响本发明的范围或任何实施例。这里提到的所有专利和出版物全部引入作为参考。
序列表<110>Bao，WuliBinder，Thomas P.
Hanke，Paul D.
Solheim，Leif<120>葡糖胺的无细胞生产<130>1533.568PC01<150>US 60/414,410<151>2002-09-30<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建nagB表达质粒的引物<400>1catctagaat tcatgagact gatccccctg actacc 36<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建nagB表达质粒的引物<400>2catctaaagc ttcaaggagc cagggcaggg 30
权利要求
1.一种从淀粉、麦芽糖糊精或糖原生产葡糖胺-6-磷酸的无细胞方法，包括在反应混合物中将淀粉、麦芽糖糊精或糖原与谷氨酰胺温育，该反应混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的细胞提取物。
2.权利要求1的方法，其中所述的细胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸合酶。
3.权利要求1的方法，其中所述提取物是真核细胞或细菌细胞提取物。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞提取物是大肠杆菌提取物。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞提取物通过裂解细胞、去除细胞碎片并进行硫酸铵沉淀以及收集在40％和60％硫酸铵饱和度之间产生的沉淀而制备。
6.权利要求1的方法，其中所述淀粉选自由可溶淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米淀粉和小麦淀粉组成的组中。
7.权利要求1的方法，其中所述糖原选自由兔肝糖原、牛肝糖原、贻贝糖原和牡蛎糖原组成的组中。
8.权利要求1的方法，其中所述麦芽糖糊精是麦芽糖糊精10。
9.权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖-1，6-二磷酸和磷酸葡糖异构酶中的一种或多种。
10.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含磷酸源；可溶淀粉；KCl；谷氨酰胺；镁源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸变位酶；磷酸葡糖异构酶；以及大肠杆菌提取物。
11.一种从淀粉、麦芽糖糊精或糖原生产葡糖胺-6-磷酸的无细胞方法，包括在反应混合物中将淀粉、麦芽糖糊精或糖原与铵源温育，该反应混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶。
13.权利要求11的方法，其中所述提取物是真核细胞或细菌细胞提取物。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞提取物是大肠杆菌提取物。
15.权利要求11的方法，其中所述细胞提取物通过裂解细胞、去除细胞碎片并进行硫酸铵沉淀以及收集在30％和50％硫酸铵饱和度之间产生的沉淀而制备。
16.权利要求11的方法，其中所述淀粉选自由可溶淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米淀粉和小麦淀粉组成的组中。
17.权利要求11的方法，其中所述糖原选自由兔肝糖原、牛肝糖原、贻贝糖原和牡蛎糖原组成的组中。
18.权利要求11的方法，其中所述麦芽糖糊精是麦芽糖糊精10。
19.权利要求11的方法，其中所述反应混合物进一步包含磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡糖-1，6-二磷酸和磷酸葡糖异构酶中的一种或多种。
20.权利要求11的方法，其中所述反应混合物包含磷酸源；可溶淀粉；KCl；铵源镁源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸变位酶；磷酸葡糖异构酶；以及大肠杆菌提取物。
21.一种生产葡糖胺的无细胞方法，包括在反应混合物中将葡糖胺-6-磷酸与磷酸酶温育。
22.权利要求21的方法，其中所述磷酸酶选自由虾碱性磷酸酶、牛肠碱性磷酸酶和细菌碱性磷酸酶组成的组中。
23.一种从果糖生产葡糖胺的无细胞方法，包括在反应混合物中将果糖与谷氨酰胺温育，所述反应混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的细胞提取物。
24.权利要求23的方法，其中所述细胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸合酶。
25.权利要求23的方法，其中所述提取物是真核细胞或细菌细胞提取物。
26.权利要求23的方法，其中所述细胞提取物是大肠杆菌提取物。
27.权利要求26的方法，其中所述细胞提取物通过裂解细胞、去除细胞碎片并进行硫酸铵沉淀以及收集在40％和60％硫酸铵饱和度之间产生的沉淀而制备。
28.权利要求23的方法，其中所述反应混合物包含果糖；KCl；谷氨酰胺；以及大肠杆菌提取物。
29.一种从果糖生产葡糖胺的无细胞方法，包括在反应混合物中将果糖与铵源温育，所述反应混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
30.权利要求29的方法，其中所述细胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶。
31.权利要求29的方法，其中所述提取物是真核细胞或细菌细胞提取物。
32.权利要求31的方法，其中所述细胞提取物是大肠杆菌提取物。
33.权利要求29的方法，其中所述细胞提取物通过裂解细胞、去除细胞碎片并进行硫酸铵沉淀以及收集在30％和50％硫酸铵饱和度之间产生的沉淀而制备。
34.权利要求29的方法，其中所述反应混合物包含果糖；KCl；铵源；以及大肠杆菌提取物。
全文摘要
公开了从淀粉、麦芽糖糊精或糖原或从果糖和氨基基团源无细胞生产葡糖胺的方法。也公开了含有葡糖胺－6－磷酸合酶活性的细胞提取物以及含有葡糖胺－6－磷酸脱氨酶活性的细胞提取物。
文档编号C12P19/26GK1685054SQ03823423
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月29日 优先权日2002年9月30日
发明者W·包, T·P·宾德, P·D·汉克, L·索尔海姆 申请人:阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司