专利名称：降低热处理食物的丙烯酰胺含量的方法
技术领域：
本发明涉及与常规热处理食物相比降低热处理食物的丙烯酰胺含量的方法。
背景技术：
近来，瑞典国立食品管理局(NFA)和来自斯德哥尔摩大学的科学家公开了新的研究结果，根据该结果，在制作时给予高热处理的各种食物中，形成了一种有毒并且可能致癌的物质-丙烯酰胺。为了刺激国际协作和研究，NFA通知了其它国家和国际机构和组织，因为加热的食物中丙烯酰胺的形成显然是一种普遍现象。然后，在2002年夏季，在日内瓦，由联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合召集，举行了专家磋商会议(有关食物中丙烯酰胺的健康隐患的WHO，FAO/WHO磋商会议(日内瓦，2002年6月25-27日)。
就丙烯酰胺毒理学效应的实质性终点，专家磋商会议讨论了下列问题神经毒性、生殖毒性、诱变性和致癌性。
详细来说，专家磋商会议起始于如下观点丙烯酰胺及其代谢产物环氧丙酰胺的基因毒性潜力有重要作用。在体内，丙烯酰胺在体细胞和生殖细胞中具有基因毒性。因此它可以在基因以及染色体水平引起可遗传的损害。正如已知的，它的代谢产物之一是环氧丙酰胺-一种化学上有反应性的环氧化物，它可以直接与DNA反应并形成加合物。已经强调基因毒性机制在丙烯酰胺的致癌性中起重要作用。
专家磋商会议评定了来自实验动物研究的可用资料。磋商会议特别强调了基因毒性机制在癌发生中的重要性，并且形成如下意见迄今为止，几乎还没有证据证实其它的替代机制，例如激素性质的机制。
国际专家磋商会议描述了丙烯酰胺在大鼠中的致癌潜力，其与某些食物中存在的、部分取决于制备过程的其它致癌物质，例如苯并芘相当。然而，丙烯酰胺的存在量被认为比迄今为止食物中发现的所有其它致癌物质的存在量都高。对于人类，食物中致癌物质的相对潜力是未知的。来自有工作性接触的工作者的流行病学研究数据的重要性较低，因为它们并不都适于确定癌症风险的微小改变。总的说来，专家磋商会议将食物中丙烯酰胺的存在评定为引起关注的问题。
在现有资料的基础上，WHO/FAO专家磋商会议得出结论食物是一种导致消费者暴露的重要因素。
当某些食物在较高温度下制作时形成丙烯酰胺。除高温之外，接触高温的持续时间也有作用。对于该机制的形成，国际专家磋商会议没有发现任何其它可靠证据。根据专家磋商会议，仍然不了解丙烯酰胺形成的机制。
在某些实验条件下，看起来丙烯酰胺可以在氨基酸，尤其是天冬酰胺(Mottram et al.，Nature 419，(2002)，448；Stadler et al.，Nature 419，(2002)，449)与糖，例如果糖、半乳糖、乳糖或蔗糖(Stadler et al.，Nature 419，(2002)，449)的反应中体外形成。
造成热处理食物中丙烯酰胺含量的可变性的原因尚未充分理解(关于食物中丙烯酰胺的健康隐患的WHO，FAO/WHO磋商会议(日内瓦，2002年6月25-27日))。
FAO和WHO召集的国际专家磋商会议荐意对食物加工条件和丙烯酰胺形成之间的关系进行研究，以及为了使丙烯酰胺含量减到最小而对加工条件进行优化。
迄今为止现有技术中尚未描述过使热处理食物中丙烯酰胺含量最小化的方法，然而迫切需要该方法。因此本发明的目的是提供允许制备与常规热处理食物相比丙烯酰胺含量降低的热处理食物的方法。
这个目的是通过提供权利要求中描述的实施方案达到的。
发明内容
因此本发明涉及与相应常规热处理食物相比降低丙烯酰胺含量的方法，包括a)提供或选择与相应常规植物材料相比，可溶性糖和/或氨基酸含量降低的植物材料；b)加工所述植物材料得到食物；和c)热处理在加工步骤b)中产生的食物。
丙烯酰胺(CAS号79-06-1)，也称作2-丙烯酰胺、乙烯基酰胺或乙烯甲酰胺，在室温下是无色固体，极易溶于水，但不溶于庚烷。在本发明的上下文中，术语“丙烯酰胺含量降低”是指与相应常规热处理食物的丙烯酰胺含量相比，丙烯酰胺含量降低至少15％，特别是至少30％，优选至少50％，75％和特别优选至少90％。
已经描述了确定食物中丙烯酰胺含量的方法，例如，Tareke et al.(J.Agric.Food Chem.50，(2002)，4998-5006)。丙烯酰胺在衍生(如形成二溴产物)后通过GC/MS，或通过LC/MS-MS，优选通过如Tareke et al.(J.Agric.Food Chem.50，(2002)，4998-5006)所述的LC/MS-MS定量确定。形成二溴产物的衍生化可以如美国环境保护机构(＝EPA)的EPA方法8032A(htttp//www.epa.gov/epaoswer/hazwaste/test/pdfs/8032a.pdf，1996年12月版，″Acrylamide by gas chromatography″)实施。在本发明的上下文中，优选根据EPA方法8032A进行此衍生化。
在本发明的上下文中，术语“食物”是指含有植物材料的任何食物。该术语包括，特别是适用于制作“热处理食物”的预备阶段(preliminarystages)，例如生面团混合物、马铃薯片、马铃薯条、颗粒和玉米粒。用于制作热处理食物的预备阶段，尤其是马铃薯片，也可以是预煮的或烫漂(blanch)的形式或是冷冻的形式。
在本发明的上下文中，术语“热处理食物”是指已暴露过＞100℃的温度，优选110℃至230℃，尤其是120℃-200℃，优选150℃-170℃，特别优选150℃-180℃的任何食物。在本发明的上下文中，术语“热处理”是指在标准压力条件下导致100℃以上温度的任何处理，尤其是指油炸(油汆)(deep-fat frying)、炙(grilling)、炸(frying)、烤(roasting)、挤压(extruding)、烘焙(backing)或微波加热、高压灭菌或部分油炸(Parfrying)。
热处理时间可以根据食物而不同。绝对丙烯酰胺含量总是随热处理时间的增加而增加。在本发明的帮助下，现在可以与常规热处理食物相比，降低在限定温度下用限定方法热处理了限定时间的食物的丙烯酰胺含量。
在本发明的上下文中，特别是就油炸马铃薯条和油炸马铃薯片而言，当热处理为油炸加工时，热处理进行10秒至8分钟，优选2至5分钟，特别优选2至3分钟。如果热处理是烘焙工艺，在本发明的上下文中，热处理进行1至120分钟，优选5至30分钟。
在本发明的上下文中，特别是就制作部分油炸(parifried)的油炸马铃薯条而言，马铃薯条的热处理是在油中以油汆方式进行部分油炸的过程，该过程可以进行30秒至600秒，优选60秒至360秒，和/或部分油炸温度可以在120℃至200℃的范围，优选130℃至170℃。通常，部分油炸时间应该足以使马铃薯切片的水分降低至按重量计算低于75％的水分含量。意用于通过炸完成成品制备的部分油炸的和冷冻的马铃薯条典型地部分油炸至按重量计算60-70％的水分含量。计划通过烤箱完成制作的冷冻马铃薯条通常部分油炸至按重量计算低于60％，优选40％-55％，和更优选44％-50％的更低水分含量。
部分油炸步骤所需的实际时间由几个因素决定，包括具体的油温度、马铃薯片的大小和温度、批投料量、油炸锅的体积和马铃薯片的初始含水量。
优选，如国际专利申请WO97/40707A1第14页所述确定含水量。
这种“热处理食物”的实例是油炸马铃薯片(potato crisps)(与这个英文术语同义的是美国术语“炸薯片(potato chip)”)、油炸(马铃薯)条(potatochips)(与这个英文术语同义的是美国术语“炸薯条(French fry)”)、部分油炸马铃薯条(parffied potato chips)(在热处理以后可以任选冷冻)、马铃薯泥(mashed potato)、饼干(biscuits)、发面饼干(crackers)、面包干(crispbread)、早餐谷物(breakfast cereals)、玉米酥(maize crisps)(炸玉米粉卷，tacos)、爆米花(popcorn)、面包酥(bread crisps)、薄脆饼(wafers)、salt sticks、咖啡(coffer)、面包(bread)、馅卷(rolls)、蛋糕(cakes)、大米酥(rice crisps)、比萨饼(pizza)和烤面包片(toast)，以及玉米粉煎饼(tortillas)、油炸丸子(croquettes)、wedges、马铃薯棒(potato sticks)、麻花面包(twisters)、用于肉、鱼和蔬菜的面包涂层(bread coatings)、用于坚果的面包涂层、玉米粉饼片(tortilla chips)、面包和各种烘焙制品和谷物配制品以及预熟的食品，特别是婴儿食品。
在本发明的上下文中，英文术语“油炸马铃薯片”和“油炸马铃薯条”代替同义美国术语“炸薯片”和“炸薯条”使用。
在本发明的上下文中，术语“常规热处理食物”是指由常规植物材料制作的食物。在本发明的上下文中，术语“相应常规热处理食物”优选涉及由常规植物材料制作的热处理食物，其中该植物材料已经与本发明所用植物材料一样用相同的方式加工和热处理，然而，本发明使用的植物材料与相应常规热处理植物材料相比，由于遗传修饰，其可溶性糖和/或氨基酸的含量降低。
在本发明的上下文中，术语“植物材料”是指由植物组成或含有植物的部分的任何材料。优选，所述植物的部分是收获的植物产物，例如块茎、果实、种子、鳞茎、叶子和根。该植物材料可以来源于任何期望植物种类，即单子叶植物以及双子叶植物。优选这是来自农场植物的植物材料，即来自为了营养或为了技术，尤其是工业目的而栽培的植物。尤其优选来自淀粉质植物(例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、稻、豆类、木薯)，尤其是来自马铃薯植物的植物材料。
在本发明的上下文中，术语“常规植物材料”尤其是指相应未遗传修饰的植物的植物材料，即该植物不具有遗传修饰，其中该修饰导致，与相应野生型植物相比，可溶性糖含量降低(尤其是葡萄糖和/或果糖)和/或氨基酸含量降低(尤其是天冬酰胺)。然而在本发明的上下文中，常规植物材料也可以来源于遗传修饰的植物，即，该植物在另一个方面已经被遗传修饰，但是与相应野生型植物相比，该遗传修饰不引起可溶性糖含量降低(尤其是葡萄糖和/或果糖)和/或氨基酸含量降低(尤其是天冬酰胺)。
术语“遗传修饰”在下文中定义。
在本发明的上下文中，术语“可溶性糖”是指植物材料中存在的任何可溶于水的糖，优选该可溶性糖是己糖，优选还原糖，尤其是果糖和/或葡萄糖。
在本发明的上下文中，术语“可溶性糖含量降低”或“降低的可溶性糖含量”是指与相应常规热处理食物或相应常规植物材料的可溶性糖(尤其是果糖和/或葡萄糖)含量相比，可溶性糖含量降低，优选指植物材料的可溶性糖(尤其是果糖和/或葡萄糖)含量降低至少10％，尤其是至少15％，优选至少20％，和特别优选至少40％，尤其是50％-95％，优选60％-90％。
在本发明的上下文中，术语“氨基酸”是指植物材料中存在的任何氨基酸，优选丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和缬氨酸，更优选天冬酰胺。
在本发明的上下文中，术语“氨基酸含量降低”或“降低的氨基酸含量”是指与相应常规热处理食物或相应常规植物材料的氨基酸(尤其是天冬酰胺)含量相比，氨基酸含量降低，优选指植物材料的氨基酸(尤其是天冬酰胺)含量降低至少10％，尤其是至少15％，优选至少20％，和特别优选至少40％。
热处理食物中丙烯酰胺含量的可变性的原因尚未充分理解(关于食物中丙烯酰胺的健康隐患的WHO，FAO/WHO磋商会议(日内瓦，2002年6月25-27日)，因此迄今为止没有描述过使热处理食物的丙烯酰胺含量最小化的方法。尤其是没有描述过以选择特殊植物材料作为基础的方法。
现在意外地发现用于生产热处理食物的起始植物材料的选择对这种食物的丙烯酰胺含量具有关键作用。本发明首次教导了使用与相应常规植物材料相比具有降低的可溶性糖和/或氨基酸含量的植物材料可以允许制作在热处理后，与使用具有常规可溶性糖和/或氨基酸含量的植物材料时相比，丙烯酰胺的含量降低的食物。因此本发明教导了可以使用可溶性糖和/或氨基酸含量相对低的植物材料以避免热处理食物中丙烯酰胺的形成。
确定植物材料中糖含量的方法(尤其是果糖和葡萄糖)，是本领域技术人员已知的并且在例如Muller-Rober et al.(Mol.Gen.Genet.224，(1990)，136-146)中描述，也在下文中描述。在本发明上下文中，优选按如下所述(“葡萄糖、果糖和蔗糖的确定”)实施葡萄糖、果糖和/或蔗糖含量的确定。
确定植物材料中氨基酸，尤其是天冬酰胺，含量的方法是本领域技术人员已知的并且例如在Cohen，Meys，Tarvin(1988)，The pico-tag methodA Manual of advanced techniques for amino acid analysis，MilliporeCorporation，Milord，Mass.，USA中描述。优选的是Roessner et al.(PlantPhysiology 127，(2001)，749-764)描述的方法。
在本发明方法另一实施方案中，使用的植物材料的特征在于它是遗传修饰的，与相应野生型植物的常规植物材料相比，该遗传修饰导致可溶性糖，尤其是葡萄糖和/或果糖，含量降低。
在本发明的上下文中，“遗传修饰”可以是与相应野生型植物的常规植物材料相比，导致可溶性糖含量降低的任何遗传修饰。
在本发明的上下文中，遗传修饰可以由一个或多个基因突变所引起。突变类型对此并不关键，只要与相应野生型植物的常规植物材料相比，它导致可溶性糖含量降低即可。
在本发明的上下文中，术语“突变”是指任何突变类型，例如缺失、点突变(核苷酸置换)、插入、倒位、基因转换或染色体易位。
突变可以由使用化学试剂或高能辐射(例如X射线、中子、伽马或紫外辐射)所引起。例如Ehrenberg and Husain，1981，(Mutation Research 86，1-113)，Muller，1972(Biologisches Zentralblatt 91(1)，31-48)描述了可以用于引起化学诱导的突变的试剂和通过与相应诱变剂的反应而产生的突变。例如Jauhar和Siddiq(1999，Indian Journal of Genetics，59(1)，23-28)、Rao(1977，Cytologica 42，443-450)、Gupta和Sharma(1990，Oryza 27，217-219)和Satoh和Omura(1981，Japanese Journal of Breeding 31(3)，316-326)描述了使用γ射线、乙基甲烷磺酸(EMS)、N-甲基-N-硝基脲或叠氮化钠(NaN3)产生稻突变体。例如Arora et al.(1992，Annals of Biology 8(1)，65-69)描述了使用NaN3和顺丁烯二酰肼(1，2-二氢哒嗪-3，6-二酮)产生小麦突变体。Scarascia-Mugnozza et al.(1993，Mutation BreedingReview 10，1-28)给出了使用各种类型高能辐射和化学试剂制备小麦突变体的综述。Svec et al.(1998，Cereal Research Communications 26(4)，391-396)描述了使用N-乙基-N-硝基脲产生triticale突变体。Shashidhara et al.(1990，Journal of Maharashtra Agricultural Universities 15(1)，20-23)描述了使用MMS和γ射线产生黍突变体。
已经描述了原则上可以进行营养繁殖的植物种类的突变体制备，例如，产生改性淀粉的马铃薯(Hovenkamp-Hermelink et al.(1987，Theoreticaland Applied Genetics 75，217-221)，和油产量增加和油质量改变的薄荷(Dwivedi et al.，2000，Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences22，460-463)。
原则上，所有这些方法均适于提供，由于遗传修饰而与相应野生型植物的常规植物材料相比可溶性糖含量降低并因此适合用于本发明方法的植物材料。
使用本领域技术人员已知方法可以发现适当基因中的突变。具体地，可用于此目的的方法是基于与探针杂交(Southern印迹)的分析、通过聚合酶链式反应(PCR)的扩增、相关基因组序列测序和单个核苷酸置换的检索。基于杂交模式鉴定突变的方法是例如限制性片段长度多态性(RFLP)的检索(Nam et al.，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister and Dean，1993，The Plant Journal 4(4)，745-750)。基于PCR的方法是例如扩增片段长度多态性(AFLP)的分析(Castiglioni et al.，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem et al.，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer et al.，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)。通过利用限制性内切酶切割的扩增片段(Cleaved Amplified PolymorphicSequences，CAPS)也可以鉴定突变(Konieczny and Ausubel，1993，ThePlant Journal 4，403-410；Jarvis et al.，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem et al.，1996，The Plant Journal 9(5)，745-753)。已经描述了确定SNPs(单核苷酸多态性)的方法，尤其是Qi et al.(2001，NucleicAcids Research 29(22)，e116)Drenkard et al.(2000，Plant Physiology 124，1483-1492)和Cho et al.(1999，Nature Genetics 23，203-207)。尤其是，允许在短时间内研究许多植物在某些基因中的突变的方法是合适的。已经描述了这样的方法，称作TILLING(Targeting Induced Local Lesions INGenomes，寻找基因组中诱导的局部损害)，例如McCallum et al.(2000，Plant Physiology 123，439-442).
所有这些方法在原则上均适用于鉴定适用于本发明方法的遗传修饰植物材料。
此外，可以用基因工程方法(反义、共抑制技术、核酶、体内诱变、RNAi技术等)制备可用于本发明上下文的遗传修饰植物材料。
在本发明方法尤其优选的另一实施方案中，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，遗传修饰导致植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白质的活性降低。
在本发明的上下文中，术语“R1蛋白质”是指例如在Lorberth etal.(Nature Biotech.16，(1998)，473-477)，Ritte et al.，(PNAS 99，(2002)，7166-7171)和国际专利申请WO98/27212、WO00/77229、WO00/28052中已经描述并具有以下特征的蛋白。R1蛋白的重要特征是i)它们的氨基酸序列(见例如GenBank登记号A61831、Y09533)；ii)它们在植物细胞质体中的定位；iii)它们影响植物中淀粉的磷酸化程度的能力。此外，术语″“R1蛋白质”指在二激酶型反应中催化淀粉磷酸化的蛋白，其中三个底物——α-聚葡聚糖(polyglucan)、ATP和H2O转变为三个产物——α-聚葡聚糖-P、AMP和正磷酸盐(Ritte et al.，PNAS Vol.99 No.10，(2002)，7166-7171)。在更近文献中使用的术语″R1蛋白″的同义词是术语″GWD蛋白″，它是″alpha-glucan water dikinase(α-葡聚糖水二激酶)″的缩写(Blennow etal.，Trends in Plant Science Vol.7 No.10(2002)，445-450)。因此，对于本发明，该术语也包括“GWD蛋白”。
例如，抑制来自马铃薯的编码R1蛋白的R1基因导致转基因马铃薯植物中可从马铃薯块茎分离的淀粉的磷酸含量降低。
此外，Lorberth et al.证明来自马铃薯(Solanum tuberosum)的R1蛋白，当相应R1 cDNA在大肠杆菌中表达时，能够将细菌糖原磷酸化(Lorberth et al.，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)。
Ritte et al.(Plant J.2l，(2000)，387-391)证明在马铃薯植物中来自Solanum tuberosum的R1蛋白质可逆地结合淀粉颗粒，与淀粉颗粒结合的强度依赖于该植物的代谢状态。在马铃薯植物中与淀粉颗粒结合的该蛋白主要存在于在黑暗中生长的叶子中。光照射叶子后，相反，该蛋白主要以不与淀粉颗粒结合的可溶形式存在。
在本发明的上下文中，尤其重要的是，在转基因马铃薯植物或它们的块茎中抑制马铃薯R1基因的表达可以导致所谓的寒冷诱导的甜味物减少(Lorberth et al.，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)，即，与未被遗传修饰的相应野生型植物的块茎相比，冷藏马铃薯块茎的可溶性糖含量降低，尤其是果糖和葡萄糖含量降低。
此外，甚至在紧接收获之后，或在室温贮藏后，R1基因表达降低的这些转基因植物的马铃薯块茎，与未被遗传修饰的相应野生型植物的块茎相比，可溶性糖含量也降低，尤其是果糖和葡萄糖含量降低。
通过本发明，已经首次证明，油炸或部分油炸来源于R1基因表达降低的植物(Lorberth et al.Nature Biotech.16，(1998)，473-477)的(冷藏)马铃薯块茎导致，与油炸未被遗传修饰的相应马铃薯块茎时相比，油炸产品中丙烯酰胺的形成显著降低。丙烯酰胺形成的降低意外地高。
在本发明方法另一实施方案中，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，遗传修饰导致植物细胞中存在的一个或多个内源转化酶蛋白的活性降低。
在本发明的上下文中，术语″转化酶蛋白″是指具有转化酶的酶活性的蛋白。
转化酶催化蔗糖裂解为葡萄糖和果糖。优选，在本发明的上下文中，这些是酸性转化酶，也称作液泡转化酶，并且已经在例如Zrenner et al.中描述(Planta 198，(1996)，246-252)。
已经描述了转化酶活性降低的马铃薯植物，例如在Zrenner et al.(Planta 198，(1996)，246-252)和Greiner et al.(Nature Biotechnology 17，(1999)，708-711)中。
在本发明的上下文中，尤其重要的是，在转基因马铃薯植物，尤其是表达来自烟草的液泡转化酶抑制剂的植物中(Greiner et al.，NatureBiotechnology 17，(1999)，708-711)，转化酶的活性降低导致，与未被遗传修饰的相应野生型植物的块茎相比，这些转基因植物的冷藏马铃薯块茎具有降低的可溶性糖含量，尤其是果糖和葡萄糖含量。
在本发明的上下文中，术语“活性降低”是指与相应未遗传修饰的细胞相比，编码R1或转化酶蛋白的内源基因的表达降低和/或植物材料的细胞中R1蛋白或转化酶蛋白的量降低和/或植物材料的细胞中R1蛋白或转化酶蛋白的酶活性降低。
在本发明的上下文中，术语″植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白的活性降低″是指与相应未遗传修饰的野生型植物的细胞相比，编码R1蛋白的一个或多个内源基因的表达降低，和/或植物材料的细胞中R1蛋白的量降低和/或植物材料的细胞中R1蛋白的酶活性降低。
在本发明的上下文中，术语“植物细胞中存在的一个或多个内源转化酶蛋白的活性降低”是指与相应未遗传修饰的细胞相比，编码转化酶蛋白的一个或多个内源基因的表达降低，和/或植物材料的细胞中转化酶蛋白的量降低和/或植物材料的细胞中转化酶蛋白的酶活性降低。
表达降低可以通过例如测定编码R1或转化酶蛋白的转录物的量来确定，例如用Northern印迹分析或RT-PCR。优选地，降低指与相应未遗传修饰的细胞相比，转录物的量降低至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
导致相关植物细胞中R1或转化酶蛋白活性降低的这些蛋白的量的降低可以通过例如免疫学方法，如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附试验)或RIA(放射性免疫测定法)来确定。优选地，降低指与相应未遗传修饰的细胞相比，R1或转化酶蛋白的量降低至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
R1蛋白的酶活性降低可以基于Ritte et al.(PNAS 99，(2002)，7166-7171)描述的酶学试验来确定。
转化酶蛋白的酶活性降低可以通过Greiner et al.(NatureBiotechnology 17，(1999)，708)描述的方法来确定。
R1或转化酶蛋白的酶活性降低优选指与相应未遗传修饰的细胞相比，活性降低至少50％，尤其是至少60％，优选至少70％。
优选地R1蛋白的酶活性降低是指与相应未遗传修饰细胞的R1活性相比，R1的活性降低至少50％，尤其是至少60％和优选至少70％。
优选地转化酶蛋白的酶活性降低是指与相应未遗传修饰细胞的转化酶活性相比，转化酶蛋白的活性降低至少50％，尤其是至少60％，和优选至少70％。
在本发明方法另一实施方案中，遗传修饰是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在和/或表达将导致，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白的活性降低。
在本发明方法另一实施方案中，遗传修饰是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在和/或表达将导致，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个内源转化酶蛋白的活性降低。
在本发明的上下文中，术语″外来核酸分子″是指非天然存在于相应植物细胞中的分子，或非天然存在于植物细胞的该特定空间中的分子，或在植物细胞的基因组中位于非天然所处位置的分子。优选，该外来核酸分子是由各种元件组成的重组分子，这些元件的组合或特定空间排列不天然存在于植物细胞中。
在本发明方法另一优选的实施方案中，外来核酸分子选自(a)编码至少一个引起R1蛋白的内源编码基因表达降低的反义RNA的DNA分子；(b)通过共抑制作用导致编码R1蛋白的内源基因表达降低的DNA分子；(c)编码至少一个以特定方式切割编码R1蛋白的内源基因转录物的核酶的DNA分子；(d)通过体内诱变导入并导致编码内源R1蛋白的基因中发生突变或插入异源序列的核酸分子，其中该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的R1蛋白；(e)同时编码至少一个反义RNA和至少一个有义RNA的DNA分子，所述反义RNA和所述有义RNA形成双链RNA分子引起编码R1蛋白的内源基因表达降低；(f)含有转座子的DNA分子，该转座子序列的整合在编码R1蛋白的内源基因中导致突变或插入，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的R1蛋白；和(g)通过插入编码R1蛋白的内源基因中引起编码R1蛋白的基因表达降低或失活的R1蛋白合成的T-DNA分子。
在本发明方法另一优选的实施方案中，外来核酸分子选自(a)编码转化酶抑制剂的DNA分子；(b)编码至少一个可以引起编码转化酶蛋白的内源基因表达降低的反义RNA的DNA分子；(c)通过共抑制作用导致编码转化酶蛋白的内源基因表达降低的DNA分子；(d)编码至少一个以特定方式切割编码转化酶蛋白的内源基因的转录物的核酶的DNA分子；(e)通过体内诱变导入并在编码内源转化酶蛋白的基因中导致突变或异源序列插入的核酸分子，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的转化酶蛋白；(f)同时编码至少一个反义RNA和至少一个有义RNA的DNA分子，所述反义RNA和所述有义RNA形成双链RNA分子以引起编码转化酶蛋白的内源基因表达降低；(g)含有转座子的DNA分子，该转座子序列的整合在编码转化酶蛋白的内源基因中导致突变或插入，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的转化酶蛋白；和(h)通过插入编码转化酶蛋白的内源基因中引起编码转化酶蛋白的基因表达降低或失活的转化酶蛋白合成的T-DNA分子。
为了通过反义或共抑制技术抑制基因表达，例如，可以使用包含编码R1蛋白或转化酶蛋白的整个序列和可能地存在的侧翼序列的DNA分子，也可以使用仅仅包含编码序列的一部分的DNA分子，其中这些部分需要足够长以便在细胞中引起反义作用或共抑制作用。合适的序列通常是最小长度达15bp的序列，优选最小长度21bp，优选100-500bp的长度，而且为了有效的反义抑制或共抑制，特别优选超过500bp长度的序列。
这些陈述可以相应地应用于BE I基因表达的抑制。
对于反义或共抑制方法，也适于使用与植物细胞中编码R1蛋白或转化酶蛋白的内源序列具有高度同源性的DNA序列。最小同源性应该大于大约65％。优选使用具有至少90％同源性的序列，尤其是95％至100％的同源性。这些陈述可以相应地应用于BE I基因表达的抑制。
此外，为了达到反义或共抑制作用，也可以想到使用内含子，即编码R1蛋白或转化酶蛋白的基因的非编码区。
已经描述了使用内含子序列来抑制编码淀粉生物合成蛋白的基因表达，例如，国际专利申请WO97/04112、WO97/04113、WO98/37213、WO98/37214。这些陈述相应地应用于BE I基因表达的抑制。
本领域技术人员熟悉如何实现反义和共抑制作用。已经描述了共抑制方法，例如Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990)，340-344)，Niebel et al.，(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103)，Flavell et al.(Curr.Top.Microbiol.lmmunol.197(1995)，43-46)，Palaqui and Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159)，Vaucheret et al.，(Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317)，de Borne et al.(Mol. Gen.Genet.243(1994)，613-621)。
本领域技术人员也知道利用核酶的表达来降低细胞中某些酶的活性并且在例如EP-B1 0321201中描述。已经描述了植物细胞中核酶的表达，例如，Feyter et al.(Mol.Gen.Genet.250，(1996)，329-338)。
此外，植物材料的植物细胞中R1或转化酶活性的降低还可以通过″体内诱变″完成，其中通过细胞转化，杂合RNA-DNA寡核苷酸(″chimeroplast″)被导入细胞(Kipp，P.B.et al.，Poster Session at the 5thInternational Congress of Plant Molecular Biology，21.-27.September1997，Singapore；R.A.Dixon and C.J.Arntzen，Meeting reporton″Metabolic Engineering in Transgenic Plants″，Keystone Symposia，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15，(1997)，441-447；国际专利申请WO 9515972；Kren et al.，Hepatology 25，(1997)，1462-1468；Cole-Strauss et al.，Science 273，(1996)，1386-1389；Beetham et al.，(1999)，PNAS 96，8774-8778)。
RNA-DNA寡核苷酸的DNA成分的一部分与内源R1或转化酶基因的核酸序列同源，但是，与之相比，具有突变或含有被同源区包围的异源区。
通过RNA-DNA寡核苷酸和内源核酸分子在同源区的碱基配对，及随后的同源重组，RNA-DNA寡核苷酸的DNA成分中存在的突变或异源区可以转移到植物细胞的基因组中。这导致一个或多个R1或转化酶蛋白活性降低。这些陈述可相应地应用于BE I基因表达的抑制。
此外，同时表达待抑制的各相应靶基因(优选R1或转化酶基因)的有义和反义RNA分子也可以降低植物细胞中的R1或转化酶活性，。
这可以通过例如使用嵌合构建体完成，该构建体含有相应靶基因或靶基因的部分的反向重复。在这种情况下，该嵌合构建体编码相应靶基因的有义和反义RNA分子。有义和反义RNA作为一个RNA分子在植物中同时合成，有义和反义RNA被间隔区彼此分开并能够形成双链RNA分子。这个技术也称作″RNAi技术″。
已经证明将反向重复DNA构建体导入植物基因组是一种抑制相应于该反向重复DNA构建体的基因的高效率方法(Waterhouse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，(1998)，13959-13964；Wang and Waterhouse，Plant Mol.Biol.43，(2000)，67-82；Singh et al.，Biochemical Society Transactions Vol.28 part 6(2000)，925-927；Liu et al.，Biochemical Society Transactions Vol.28 part 6(2000)，927-929)；Smith et al.，(Nature 407，(2000)，319-320；国际专利申请WO99/53050A1)。(一个或多个)靶基因的有义和反义序列也可以使用相同或不同的启动予彼此分开表达(Nap，J-P et al，6thInternational Congress of Plant Molecular Biology，Quebec，18-24 June，2000；Poster S7-27，Presentation Session S7)。这些陈述可相应地应用于BE I基因表达的抑制。
因此也可以通过产生R1或转化酶基因的双链RNA分子达到植物材料的植物细胞中R1或转化酶活性的降低。优选，为了这个目的，将R1或转化酶基因或eDNA的DNA分子的反向重复序列导入植物的基因组，待转录的DNA分子(R1或转化酶基因或cDNA或这些基因或cDNA的片段)处于能够控制所述DNA分子表达的启动子的控制下。这些陈述可相应地应用于BE I基因表达的抑制。
此外，众所周知，植物中启动子DNA分子的双链RNA分子的形成可以反式地导致这些启动子的同源拷贝的甲基化和转录失活，这些启动子在下文中称作靶启动子(Mette et al.，EMBO J.19，(2000)，5194-5201).
通过靶启动子的失活，因此可以降低天然存在于这些靶启动子控制下的某些靶基因(例如R1或转化酶基因)的基因表达。
也就是说，在这种情况下，与植物中启动子的原始功能不同，包含特抑制基因(靶基因)的靶启动子的DNA分子不用作基因或cDNAs表达的控制元件，而是自身用作可转录DNA分子。
为了在植物中产生在那里可以作为RNA发夹分子存在的双链靶启动子RNA分子，优选使用含有反向重复的靶启动子DNA分子的构建体，其中靶启动子DNA分子处于可以控制所述靶启动子DNA分子进行基因表达的启动子的控制下。然后将这些构建体导入植物的基因组。所述靶启动子DNA分子的″反向重复序列″的表达导致植物中双链靶启动子RNA分子形成(Mette et al.EMBO J.19，(2000)，5194-5201)。用这种方法靶启动子可以失活。因此也可以通过产生R1或转化酶基因启动子序列的双链RNA分子达到植物细胞中R1或转化酶活性的降低。优选，为了这个目的，将R1或转化酶启动子的启动子DNA分子的反向重复序列导入植物的基因组，待转录的靶启动子DNA分子(R1或转化酶启动子)处于可以控制所述靶启动子DNA分子表达的启动子控制下。这些陈述相应地应用于BE I基因表达的抑制。
在本发明另一实施方案中，外来核酸分子通过转座子或所谓的转移DNA(T-DNA)插入编码R1或转化酶蛋白的基因，结果在植物材料的有关细胞中所述蛋白的活性降低。这些陈述相应地应用于BE I基因表达的抑制。
原则上，适于本发明方法的植物材料不仅可以使用同源的，也可以使用异源的转座子而产生，使用同源转座子也指使用天然已经存在于植物基因组中的那些转座子。这些陈述相应地应用于BE I基因表达的抑制。
依靠转座子修饰基因表达是本领域技术人员已知的。Ramachandran和Sundaresan(2001，Plant Physiology and Biochemistry 39，234-252)中给出了使用内源和异源转座子作为植物生物技术工具的综述。Maes etal.(1999，Trends in Plant Science 4(3)，90-96)的综述中描述了鉴定突变体的可能性，该突变体中特定基因已通过转座子插入诱变法失活。Hirochika(2001，Current Opinion in Plant Biology 4，118-122)描述了在内源转座子帮助下产生稻突变体。例如Hanley et al.(2000，The Plant Journal 22(4)，557-566)报道了使用内源反转录转座子鉴定玉米基因。Kumar和Hirochika(2001，Trends in Plant Science 6(3)，127-134)描述了使用反转录转座子产生突变体的可能性和鉴定突变体的方法。已经描述了不同物种中异源转座子的活性，这些描述不仅涉及到双子叶植物，而且涉及到单子叶植物如稻(Greco et al.，2001，Plant Physiology 125，1175-1177；Liu et al.，1999，Moleculaf and General Genetics 262，413-420；Hiroyuki et al.，1999，ThePlant Journal 19(5)，605-613；Jeon and Gynheung，2001，Plant Science161，211-219)、大麦(2000，Koprek et al.，The Plant Journal 24(2)，253-263)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Aarts et al.，1993，Nature 363，715-717，Schmidt and Willmitzer，1989，Molecular and General Genetics220，17-24；Altmann et al.，1992，Theoretical and Applied Genetics 84，371-383；Tissier et al.，1999，The Plant Cell 11，1841-1852)、番茄(Belzileand Yoder，1992，The Plant Journal 2(2)，173-179)和马铃薯(Frey et al.，1989，Molecular and General Genetics 217，172-177；Knapp et al.，1988，Molecular and General Genetics 213，285-290)。
T-DNA插入诱变是基于来自土壤杆菌的Ti-质粒的某些部分(T-DNA)可以整合到植物细胞基因组中的事实。在植物染色体中的整合位点在这里不固定，可以是任何期望的位置。如果T-DNA整合进入表现基因功能的染色体部分中，那么这可以导致基因表达改变并且因此也导致相关基因编码的蛋白质的活性改变。具体地，T-DNA整合入蛋白的编码区常常导致相关细胞不再能够合成相应蛋白，或不再能够合成活性形式的蛋白。已描述了使用T-DNA插入来产生突变体，例如对于拟南芥(Krysan et al.，1999，The Plant Cell 11，2283-2290；Atipiroz-Leehan and Feldmann，1997，Trends in genetics 13(4)，152-156；Parinov and Sundaresan，2000，CurrentOpinion in Biotechnology 11，157-161)和稻(Jeon and An，2001，PlantScience 161，211-219；Jeon et al.，2000，The Plant Journal 22(6)，561-570)。已描述了鉴定使用T-DNA插入诱变法产生的突变体的方法，尤其可参见Young et al.，(2001，Plant Physiology 125，513-518)，Parinov et al.(1999，The Plant cell 11，2263-2270)，Thorneycroft et al.(2001，Journal ofExperimental Botany 52，1593-1601)和McKinney et al.(1995，The PlantJournal 8(4)，613-622)。
T-DNA诱变原则上适合用于产生可用于本发明方法中的植物材料。
在本发明方法另一实施方案中，与相应野生型植物的未遗传修饰植物细胞相比，遗传修饰不仅导致植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白活性降低，而且同时导致植物细胞中存在的一个或多个内源I型分支酶同种型(分支酶I＝BEI蛋白)的活性降低。
在本发明的上下文中，术语“BEI蛋白”是指分支酶(＝BE)同种型I。优选BEI蛋白来源于马铃薯植物。
这里同种型的命名基于Smith-White和Preiss(Smith-White andPreiss，Plant Mol Biol.Rep.12，(1994)，67-71，Larsson et al.，Plant Mol Biol.37，(1998)，505-511)提出的命名法。这种命名法在于将在氨基酸水平与玉米BEI蛋白(GenBank登记号D11081；Baba et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.181(1)，(1991)，87-94；Kim et al.Gene 216，(1998)，233-243)，而不是与玉米BEII蛋白(Genbank登记号AF072725，U65948)具有较高同源性(同一性)的所有酶，称作分支酶同种型I，或简短地BEI蛋白。
已经描述了许多植物的编码“BEI蛋白”的核酸分子，例如玉米(Genbank登记号D 11081，AF 072724)、稻(Genbank登记号D11082)、豌豆(Genbank登记号X80010)和马铃薯。已经描述了各种形式的马铃薯BEI基因和BEI蛋白，例如Khoshnoodi et al.Eur.J.Biochem.242(1)，148-155(1996)，Genbank登记号Y 08786和Kossmann et al.，Mol.Gen.Genet.230，(1991)，39-44)。马铃薯植物中，BEI基因主要在块茎中表达，几乎根本不在叶子中表达(Larsson et al.Plant Mol.Biol.37，(1998)，505-511)。
关于导致R1活性降低的遗传修饰，应用上面作出的陈述。导致BEI蛋白I(分支酶I)活性降低的遗传修饰可以是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在和/或表达导致，与野生型植物中未被遗传修饰的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个内源BEI蛋白同种型I活性降低。
在本发明的上下文中，术语″植物细胞中存在的一个或多个内源分支酶同种型I活性降低″是指与相应未遗传修饰的细胞相比，编码BEI蛋白的一个或多个内源基因表达降低，和/或植物材料的细胞中BEI蛋白的量降低和/或植物材料的细胞中BEI蛋白的酶活性降低。
表达降低可以通过例如测定编码BEI蛋白的转录物的量来确定，例如用Northern印迹分析或RT-PCR。优选降低是指与相应未遗传修饰的细胞相比，转录物的量降低至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
导致相关植物细胞中BEI蛋白活性降低的BEI蛋白的量降低可以通过例如免疫学方法，如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附试验)或RIA(放射性免疫测定法)来确定。
优选降低是指与相应未遗传修饰的细胞相比，BEI蛋白的量降低至少50％，尤其是至少70％，优选至少85％和特别优选至少95％。
在本发明方法另一优选的实施方案中，导致植物细胞中存在的一个或多个内源BEI同种型I蛋白活性降低的外来核酸分子选自(a)编码至少一个引起编码BEI蛋白的内源基因表达降低的反义RNA的DNA分子；(b)通过共抑制作用导致编码BEI蛋白的内源基因表达降低的DNA分子；(c)编码至少一个以特定方式切割编码BEI蛋白的内源基因的转录物的核酶的DNA分子；(d)通过体内诱变导入的并在编码内源BEI蛋白的基因中导致突变或异源序列插入的核酸分子，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的BEI蛋白；(e)同时编码至少一个反义RNA和至少一个有义RNA的DNA分子，所述反义RNA和所述有义RNA形成双链RNA分子以引起编码BEI蛋白的内源基因表达降低；(f)含有转座子的DNA分子，该转座子序列的整合在编码BEI蛋白的内源基因中导致突变或插入，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的BEI蛋白；和(g)通过插入编码BEI蛋白的内源基因中引起编码BEI蛋白的基因表达降低或失活的BEI蛋白合成的T-DNA分子。
在本发明方法另一实施方案中，使用的植物材料的特征在于它是遗传修饰的，与野生型植物的相应常规植物材料相比，该遗传修饰导致氨基酸，尤其是天冬酰胺，含量降低。
在本发明的上下文中，“遗传修饰”可以是与来自野生型植物的相应常规植物材料相比，导致氨基酸含量降低，尤其是天冬酰胺含量降低的任何遗传修饰。
对于不同的可想到的产生导致氨基酸含量降低，尤其是天冬酰胺含量降低的遗传修饰的方法，上面一般性地就可导致糖含量降低的遗传修饰所作出的陈述可以应用于此。
在本发明方法另一实施方案中，与未被遗传修饰的相应野生型植物的植物细胞相比，遗传修饰导致植物细胞中存在的一个或多个内源天冬酰胺合成酶蛋白活性降低。
在本发明的上下文中，“天冬酰胺合成酶蛋白”是指催化天冬氨酸转变为天冬酰胺及ATP转变为AMP和焦磷酸盐和谷氨酰胺转变为谷氨酸的蛋白。已经描述了天冬酰胺合成酶(asn1)的序列信息，例如Lam et al.(Plant Physio.106(4)，(1994)，1347-1357)。
与相应野生型植物相比，天冬酰胺合成酶活性降低的植物的天冬酰胺含量降低(美国植物生物学家协会年会，Madison，WI，USA，(1998)，Molecular and transgenic studies of asparagine synthetase genes inArabidopsis thaliana，Abstract Number 535).
关于术语“活性降低”的定义，可以相应应用上面就R1或转化酶蛋白作出的陈述。天冬酰胺合成酶活性可以通过例如Romagni and Dayan描述的方法(Journal of Agricultural & Food Chemistry 48(5)，(2000)，1692-1696)确定。
在本发明方法另一实施方案中，遗传修饰是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在/或表达导致，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个内源天冬酰胺合成酶蛋白的活性降低。
术语“外来核酸分子”在这里具有上面已经定义的意思。
本发明方法另一实施方案中，外来核酸分子选自(a)编码至少一个引起编码天冬酰胺合成酶蛋白的内源基因表达降低的反义RNA的DNA分子；(b)通过共抑制作用导致编码天冬酰胺合成酶蛋白的内源基因表达降低的DNA分子；(c)编码至少一个以特定方式切割编码天冬酰胺合成酶蛋白的内源基因的转录物的核酶的DNA分子；(d)通过体内诱变导入的可以在编码内源天冬酰胺合成酶蛋白的基因中导致突变或异源序列插入的核酸分子，该突变或插入引起所述基因表达降低或失活的天冬酰胺合成酶蛋白合成；(e)同时编码至少一个反义RNA和至少一个有义RNA的DNA分子，所述反义RNA和所述有义RNA形成双链RNA分子以引起编码天冬酰胺合成酶蛋白的内源基因表达降低；(f)含有转座子的DNA分子，该转座子序列的整合在编码内源天冬酰胺合成酶蛋白的基因中导致突变或插入，该突变或插入引起所述基因表达降低或失活的天冬酰胺合成酶蛋白合成；和(g)通过插入编码内源天冬酰胺合成酶蛋白的基因中引起编码天冬酰胺合成酶蛋白的基因表达降低或失活的天冬酰胺合成酶蛋白合成的T-DNA分子。
就此而论，上面就不同内容在实施基因工程方法(反义、共抑制和核酶技术、体内诱变、转座子、T-DNA插入)方面一般性地作出的陈述可以相应地应用于天冬酰胺合成酶活性的遗传修饰上。
在本发明方法另一实施方案中，与未被遗传修饰的相应野生型植物的植物细胞相比，遗传修饰导致ADP-葡萄糖焦磷酸化酶蛋白活性增加。
可以，例如，按Müller-Rber et al.(EMBO J.11，(1992)，1229-1238)所述，确定ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性。
在本发明的上下文中，″ADP-葡萄糖焦磷酸化酶蛋白″是指催化葡萄糖-1-磷酸和ATP转变为ADP-葡萄糖和焦磷酸的蛋白质。
在本发明方法另一实施方案中，遗传修饰是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在和/或表达导致，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个ADP-葡萄糖焦磷酸化酶蛋白的活性增加。
术语“外来核酸分子”在这里具有上面已经定义的意思。
优选，外来核酸分子编码去调节的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，特别优选术语称作glgC16的大肠杆菌的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，该酶在转基因马铃薯植物中表达后可以导致淀粉合成速率增加。这些植物的冷藏马铃薯块茎显示出己糖蓄积显著降低(Stark et al.Science 258，(1992)，287-292；Stark et al.，Ann.NY Acad.Sci.792，(1996)，26-37)。
在另一实施方案中，本发明涉及可用于本发明方法的上述植物材料在制备与相应常规热处理食物相比具有降低的丙烯酰胺含量的热处理食物中的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及与相应常规植物材料相比具有降低的可溶性糖和/或氨基酸含量的植物材料在制备丙烯酰胺含量降低的热处理食物中的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及可用于本发明方法的上述植物材料在降低热处理食物的丙烯酰胺含量中的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定适用于制备丙烯酰胺含量降低的热处理食物的植物材料的方法，它包括(a)确定适于制备热处理食物的植物材料中的可溶性糖和/或氨基酸的含量；和(b)根据步骤(a)选择这样的植物材料，它与相应常规植物材料相比，可溶性糖和/或氨基酸的含量降低。
本说明书中提及的所有出版物和专利以其全部内容引入作为参考。
方法葡萄糖、果糖和蔗糖的确定为了确定马铃薯块茎中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，小片(直径大约10mm)马铃薯块茎冰冻在液氮中，然后在80℃、0.5ml 80％(体积/体积)乙醇中提取一小时。离心后(3分钟，3000rpm)，移走上清，沉淀在0.5ml80％(体积/体积)乙醇中再次提取。重复这个过程。合并的上清用于确定可溶性糖的量。
在具有下列组成的试验溶液中定量测定可溶性葡萄糖、果糖和蔗糖100mM咪唑/HCl(pH6.9)5mM MgCl22mM NAD+1mM ATP200μl样品2单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠系膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides))该试验溶液在室温下孵育5分钟。然后向200μl反应体积中顺序添加1500单位酵母己糖激酶(为了测定葡萄糖)、2.5单位酵母磷酸葡糖异构酶(为了测定果糖)、350单位酵母β-果糖苷酶(为了测定蔗糖)后，使用常用光度测量法通过测定在340nm的吸收来测定这些糖。
以下实施例阐明本发明实施例l从马铃薯块茎制备油炸马铃薯片和油炸马铃薯条为了制备油炸马铃薯片和马铃薯条，使用R1基因表达降低的转基因马铃薯植物的成熟马铃薯块茎(Lorberth et al.，Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)，也使用R1基因表达降低且分支酶I基因表达降低的马铃薯植物的马铃薯块茎(WO97/11188)。
在紧接收获以后以及在4℃贮藏不同时间后，进一步加工油炸薯片和薯条。
块茎手工去皮，然后在切片机(model Chef200，来自Saro Emmerich，德国)中切成用于生产油炸薯片的小片或使用冲压机(punch)(Weisser，德国)切割形成薯条。
在油汆锅(Frita4，Franke，Frifri aro GmbH，德国)中，180℃的温度下，使用植物脂肪(Palmaja，Meylip mbH & Co.，KG，德国)油炸样品不同的时间。
然后粉碎油炸产品并分析它们的丙烯酰胺含量。衍生化后使用GC/MS或LC/MS-MS检测(Epa方法8032a，美国环境保护机构)。除了确保低限测定外，这还确保了检测的高选择性。
在全部油炸样品中，发现与相应野生型植物块茎的丙烯酰胺含量相比，转基因马铃薯块茎中的丙烯酰胺含量降低了至少15％。
实施例2测定由R1-和分支酶I基因表达降低的马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片和薯条的丙烯酰胺含量分析根据实施例1制备的油炸马铃薯片和薯条的丙烯酰胺含量。
在下文中未遗传修饰的植物称作野生型植物。
在下文中R1基因表达降低(Lorberth et al.，Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)且分支酶I基因表达降低(见国际专利申请WO97/11188)的转基因马铃薯植物称作015VL001。
如果新鲜采收的马铃薯植物块茎用于在180℃油炸3和6分钟，那么油炸马铃薯片具有下列丙烯酰胺含量
表1油炸马铃薯片(收获以后立即从马铃薯块茎制备的)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
绝对丙烯酰胺含量随油炸时间的增加大大增加。这种情况不仅存在于来自野生型块茎的油炸马铃薯片中而且也存在于来自转基因块茎的油炸马铃薯片中。然而，对于两个油炸时间，由转基因马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片中丙烯酰胺含量的增加，与野生型植物的油炸马铃薯片相比，显著降低。在3分钟油炸时间下，与野生型油炸马铃薯片相比，转基因油炸马铃薯片中的丙烯酰胺含量降低了大约70％。在6分钟油炸时间下，与野生型油炸马铃薯片相比，转基因油炸马铃薯片中的丙烯酰胺形成降低了大约50％。
在进一步的实验中，贮藏在4℃的马铃薯块茎用于制备油炸马铃薯片。收获以后，转基因块茎和相关野生型块茎在4℃贮藏56天。制备油炸马铃薯片和马铃薯条并在180℃、上述条件下油炸不同时间
表2油炸马铃薯片(由贮藏在4℃的马铃薯块茎制备)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
来自4℃贮藏的马铃薯的产品中绝对丙烯酰胺含量总是大大增加。然而，对于3分钟油炸时间和6分钟油炸时间来说，与相应野生型植物制备的油炸马铃薯片相比，转基因马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片中的丙烯酰胺含量增加显示出大约低70％。
在另一实验中，如实施例1所述用冷藏马铃薯块茎(在4℃贮藏56天)制备马铃薯条并油炸。与油炸马铃薯片不同，马铃薯条在180℃预炸30秒，摆在炊纸上，并冷却至室温，并仅在之后油炸给定的时间。
表3油炸马铃薯条(由冷藏的块茎制备)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
油炸马铃薯条与油炸马铃薯片相比，绝对丙烯酰胺含量降低。这当然主要是由于每公斤马铃薯的油炸马铃薯条与油炸马铃薯片相比具有较小的表面积所致。在两个油炸时间下，这种产品中的丙烯酰胺含量百分比也显示出转基因马铃薯植物制作的油炸马铃薯条比野生型块茎制作的油炸马铃薯条降低大约50％。
在油炸马铃薯片或马铃薯条的工业生产中，油炸之前切片的马铃薯被烫漂。可以在水或蒸汽烫漂机中进行烫漂。烫漂条件没有定值，而是根据使用的马铃薯的质量有很大变化。烫漂过程中，可溶性糖被部分洗掉。这使得油炸的马铃薯产品焦黄色更均一。
为了证明本发明方法也可以在改变的工艺条件下导致由转基因马铃薯植物制作的马铃薯产品，与相应野生型块茎制备的产品相比，丙烯酰胺形成降低，以实验室规模用热的自来水洗涤切片的马铃薯进行烫漂。
为了这个目的，大约200g马铃薯(收获以后在4℃贮藏56天)洗涤三次，每次使用45℃的5升自来水，每次1.5分钟。然后在家用纸上干燥切片的马铃薯并如上所述在180℃油炸3分钟
表4洗涤的油炸马铃薯片(由马铃薯块茎制备)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
洗涤导致由野生型植物的马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片与未洗涤的油炸马铃薯片相比，丙烯酰胺形成降低大约16％。
与由野生型植物的马铃薯块茎制备的“洗涤的”油炸马铃薯片相比，由转基因马铃薯植物的马铃薯块茎制备的“洗涤的”油炸马铃薯片中丙烯酰胺形成降低大约80％。
在进一步分析中，与相应野生型植物的常规植物材料相比，测定可溶性糖，尤其是葡萄糖和/或果糖的含量。
为了这个目的，将马铃薯块茎去皮，使用打孔器(来自Roth)切出直径大约0.5cm的样品。从这个样品自开头、四分之一和二分之一取大约2mm厚的切片，每种情况下将来自5个不同块茎的切片在反应容器中组合并用于确定可溶性糖。
植物材料中糖(尤其是果糖和葡萄糖)含量的测定，是本领域技术人员已知的并且如上所述实施。
表6基于相应野生型块茎(100％)，新鲜收获的和贮藏的块茎样品的可溶性糖含量百分比的比较。
贮藏引起野生型植物中的可溶性糖含量剧增。与野生型植物相比，紧接在收获以后，015VL系的块茎显示葡萄糖和果糖含量降低大约30％-40％。上述冷藏后，转基因植物与相应野生型植物相比，葡萄糖或果糖降低大约50％。
如果葡萄糖或果糖含量与油炸马铃薯片中的丙烯酰胺含量有关，则可以见到马铃薯块茎中的葡萄糖或果糖含量和油炸产品油炸马铃薯片中的丙烯酰胺形成之间存在线性相关。
由此首次证明热处理食物中的丙烯酰胺形成和用于制备该热处理食物的植物材料中的可溶性糖含量相关。对丙烯酰胺形成的降低作用比预期的要明显得多。
实施例3测定由R1-基因表达降低的马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片和马铃薯条的丙烯酰胺含量分析根据实施例1由R1基因表达降低的马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片和马铃薯条的丙烯酰胺含量。
在这种情况下，如实施例2描述，首先试验由不同油炸时间，也研究不同方式贮藏或洗涤的样品。
证实了实施例2所述结果，也就是说，与由相应未遗传修饰的野生型植物的马铃薯块茎制备的相应产品相比，在实施例2中更详细描述的条件下，由R1基因表达降低的马铃薯块茎制备的油炸马铃薯片和马铃薯条同样显示丙烯酰胺较少。
实施例4R1基因表达降低的不同转基因马铃薯植物品种的制备为了制备R1基因表达降低的转基因马铃薯植物，使用土壤杆菌，如Rocha-Sosa et al.(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述，将质粒IR5/29的T-DNA转移到马铃薯植物栽培品种Tomensa，Solara和Bintje中。
有关载体IR5/29的注解IR5-29是质粒pGSV71的衍生物，其中含有来自Solanum tuberosum的patatin基因B33的启动子序列(Rocha-Sosa et al.，(1989)，见上)和在启动子的“有义”方向上的完整R1-cDNA(Lorberth et al.NatureBiotechnology 16，(1998)，473-477)。pGSV71是质粒pGSV7的衍生物，pGSV7源自于中间载体pGSV1。pGSV1是pGSC1700的衍生物，Cornelissen and Vanderwiele((1989)，Nuclear transcriptional activity ofthe tobacco plastid psbA promotor.Nucleic Acids Research 1719-29)描述了pGSC1700的构建。pGSV1是从pGSC1700通过羧苄青霉素抗性基因缺失和质粒pTiB6S3的TL-DNA区的T-DNA序列缺失而得到的。pGSV7含有质粒pBR322的复制起点(Bolivar et al.，(1977)，Construction andcharacterization of new cloning vehicles.II.A multipurpose cloning system.Gene，295-113)和假单胞菌属质粒pVS1的复制起点(Itoh et al.，(1984)，Genetic and molecular characterization of the Pseudomonas plasmid pVS1.Plasmid 11206-220)。
pGSV7还含有来自肺炎克雷白氏杆菌转座子Tn1331的选择性标记基因aadA，它给予对抗抗生素壮观霉素和链霉素的抗性(Tolmasky，(1990)，Sequencing and expression of aadA，bla，and tnpR from themultiresistance transposon Tn1331.Plasmid.24(3)218-226；Tolmaskyand Crosa，(1993)，Genetic organization of antibiotic resistance genes(aac(6′)-1b，aadA，and oxa9)in the multiresistance transposon Tn1331.Plasmid.29(1)31-40)。
质粒pGSV71是通过在pGSV7的两个边界区之间克隆嵌合bar基因而获得的。嵌合bar基因含有用于启动转录的花椰菜花叶病毒的启动子序列(Odell et al.，(1985)，Identification of DNA sequences required foractivity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S promotor.Nature 313810-812)，来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(Thompson et al.，(1987)；Characterization of the herbicide resistance genebar from Streptomyces hygroscopicus.The EMBO Journal，62519-2523)和用于终止转录和聚腺苷酸化的pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因3′非翻译区。bar基因赋予对除草剂草铵膦的耐受性。
该T-DNA按引用顺序含有下列元件-来自pTiB6S3的TL-DNA的左边界序列(Gielen et al.，(1984)，Thecomplete nucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacteriumtumefaciens plasmidp TiAch5.The EMBO J.3835-846)。
-基于TL-DNA左边界序列处于有义方向上的来自Solanumtuberosum的patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa et al.，1989，见上)-基于patatin基因启动子处于有义方向上的完整R1-cDNA(Lorberthet al.，(1998)，见上)-基于TL-DNA左边界序列处于有义方向上的Ti质粒pTiACH5的T-DNA章鱼碱合酶基因(基因3)的聚腺苷酸化信号(3 ′末端)(Gielen et al.，(1984)，见上)-基于TL-DNA左边界序列处于反义方向上的质粒pTiT37的T-DNA胭脂碱合酶基因3′非翻译末端的Taq1片段(3′nos)(Depicker et al.，(1982)，nopaline synthasetranscript mapping and DNA sequence.Journalof molecular and applied Genetics 1561-573)-基于TL-DNA左边界序列处于反义方向上的来自吸水链霉菌的膦丝菌素抗性基因(bar)编码序列(Thompson et al.(1987，见上)。bar野生型基因的5′末端的最末两个密码子被ATG和GAC密码子取代。
-基于TL-DNA左边界序列处于反义方向上的花椰菜花叶病毒的P35S3启动子区(Odell et al.(1985)，见上)-质粒pTiB6S3的TL-DNA的右边界序列(Gielen et al.，(1984)，见上)。
转化各种马铃薯栽培品种后，Western印迹分析(Lorberth et al.Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)用于鉴定每个栽培品种中由于共抑制作用造成的块茎R1蛋白量显著降低的各个品系。
使用质粒IR5/29转化获得的栽培品种Tomensa植物称作093IR植物，获得的栽培品种Solara称作095IR植物，以及获得的栽培品种Bintje称作092IR植物。
来自093IR360、095IR049和092IR002系的马铃薯块茎用于制备油炸马铃薯条(实施例5)。
实施例5测定由R1-基因表达降低的不同品种马铃薯块茎制备的油炸马铃薯条的丙烯酰胺含量根据实施例4制备的植物的新鲜采收的马铃薯块茎，按照实施例1加工成马铃薯条并根据实施例2在180℃预油炸30秒，摆在炊纸上并冷却至室温，然后在180℃油炸3分钟。
制备的油炸马铃薯条具有下列丙烯酰胺含量
表1油炸马铃薯条(收获以后立即由马铃薯块茎制备)中丙烯酰胺含量百分比。每个相应的野生型设置为100％。
制备的油炸马铃薯条的绝对丙烯酰胺含量在使用的栽培品种之间在某种程序上变化相当大。这主要是由于可溶性糖的绝对值不同。例如来自栽培品种Sloara的油炸马铃薯条不仅显示出最高的丙烯酰胺含量而且可溶性糖含量也最高。
然而，对于使用的所有转基因栽培品种来说，与野生型块茎制备的油炸马铃薯条相比，该油炸马铃薯条的相对丙烯酰胺含量显示出丙烯酰胺量显著降低大约40-50％。
在进一步分析中，确定各种栽培品种的马铃薯块茎中可溶性糖的含量，尤其是葡萄糖、果糖和蔗糖的含量为了这个目的，按照实施例2将马铃薯块茎去皮并使用打孔器(来自Roth)切出直径大约0.5mm的样品。每种情况下自5个不同块茎的每一个，从打孔器切出样品，自该样品的开始、四分之一和二分之一取大约2mm厚的切片，在反应容器中合并并用于测定可溶性糖。
如上所述确定植物材料的糖含量，尤其是果糖和葡萄糖含量。
如上所述，可溶性糖的绝对值在研究的栽培品种之间变化很大。
栽培品种Solara显示出最高的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。
栽培品种Tomensa显示出最低的葡萄糖和果糖含量，而Bintje的蔗糖含量最低。与相应野生型植物相比，收获以后立即使用的093IR360系的块茎显示出葡萄糖和蔗糖含量降低大约30-40％。与野生型植物相比，收获以后立即使用的095IR049系的块茎显示葡萄糖和果糖含量降低大约10-30％。
如果总葡萄糖和/或果糖含量与油炸马铃薯条中的丙烯酰胺含量有关，则可以见到葡萄糖和/或果糖含量与油炸马铃薯条中的丙烯酰胺形成之间有线性相关。
由此证实了对于各种栽培品种来说，使用R1基因表达降低的马铃薯植物允许制作，与由相应未遗传修饰的野生型植物制备的相应热处理食物相比，具有显著降低的丙烯酰胺含量的热处理食物，尤其是油炸马铃薯条。
实施例6测定由R1基因表达降低的不同品种的贮藏马铃薯块茎制备的油炸马铃薯条的丙烯酰胺含量根据实施例4制备的植物的马铃薯块茎在4℃贮藏73天，按照实施例1加工成马铃薯条，并根据实施例2在180℃预油炸30秒，摆在炊纸上并冷却至室温，然后在180℃油炸3分钟。
制备的油炸马铃薯条具有下列丙烯酰胺含量
表1油炸马铃薯条(由4℃贮藏的马铃薯块茎制备)中丙烯酰胺含量百分比。每个相应的野生型设置为100％。
来自4℃贮藏的马铃薯的产品中绝对丙烯酰胺含量总是显著增加。然而，对于这里列出的品种，也发现与来自相应野生型植物的油炸马铃薯条相比，来自转基因马铃薯块茎的油炸马铃薯条中的丙烯酰胺含量的增加低了大约30-45％。
在进一步实验中，R1基因表达降低的栽培品种Desiree的马铃薯块茎(Lorberth et al.，Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)在4℃贮藏73天。如实施例1所述制备油炸马铃薯条和油炸马铃薯片。油炸马铃薯片如实施例2所述在180℃油炸3分钟。与油炸马铃薯片不同，油炸马铃薯条在180℃预油炸30秒，摆在炊纸上，并冷却至室温，然后油炸3分钟。
制备的油炸马铃薯条和油炸马铃薯片具有下列丙烯酰胺含量
表2油炸马铃薯条和油炸马铃薯片(由4℃贮藏的块茎制备)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
来自4℃贮藏的马铃薯的产品中绝对丙烯酰胺含量总是显著增加。然而，在这个实验中也发现，与相应野生型植物制作的油炸马铃薯条相比，由转基因马铃薯块茎制作的油炸马铃薯条中丙烯酰胺含量的增加低了大约70％。
在进一步实验中，R1基因表达降低的栽培品种Desiree的马铃薯块茎(Lorberth et al.，Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)在8℃贮藏73天。按照实施例1将这些贮藏的马铃薯块茎加工成马铃薯条，并根据实施例2在180℃预先油炸30秒，摆在炊纸上并冷却至室温，然后在180℃油炸3分钟。
制备的油炸马铃薯条具有下列丙烯酰胺含量
表3油炸马铃薯条(由8℃贮藏的块茎制备)的丙烯酰胺含量百分比。野生型设置为100％。
由8℃贮藏的马铃薯块茎制备的产品中绝对丙烯酰胺含量的增加情况不如4℃贮藏的马铃薯块茎的大。然而，在这个实验中，也发现与相应野生型植物制作的油炸马铃薯条相比，来自转基因马铃薯块茎的油炸马铃薯条中的丙烯酰胺含量的增加低了大约48％。
权利要求
1.与相应常规热处理食物相比降低热处理食物的丙烯酰胺含量的方法，包括(a)选择与相应常规植物材料相比，可溶性糖含量降低的植物材料；(b)加工所述植物材料得到食物；和(c)热处理步骤b)中制备的食物。
2.根据权利要求1的方法，其中与相应常规热处理食物的丙烯酰胺含量相比，所述丙烯酰胺含量降低了至少15％。
3.根据权利要求1的方法，其中与相应常规热处理食物的丙烯酰胺含量相比，所述丙烯酰胺含量降低了至少30％。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述热处理在至少100℃的温度实施。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其中所述热处理食物选自油炸马铃薯片、油炸马铃薯条、部分油炸马铃薯条、马铃薯泥、饼干、发面饼干、面包干、早餐谷物、玉米酥(tacos)、爆米花、面包酥、薄脆饼、salt sticks、咖啡、面包、馅卷、蛋糕、大米酥、比萨饼和烤面包片，以及玉米粉煎饼、油炸丸子、wedges、马铃薯条、麻花面包、用于肉、鱼和蔬菜的面包涂层、用于坚果的面包涂层、玉米粉饼片、面包或谷物配制品、预熟的食品，婴儿食品。
6.根据权利要求1至5之一的方法，其中使用的植物材料的特征在于它是遗传修饰的，其中与野生型植物的相应常规植物材料相比，该遗传修饰导致可溶性糖含量降低。
7.根据权利要求6的方法，其中与未被遗传修饰的相应野生型植物的植物细胞相比，所述遗传修饰导致植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白质活性降低。
8.根据权利要求6或7的方法，其中所述遗传修饰是导入一个或多个外来核酸分子，该分子的存在和/或表达导致，与未被遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞相比，植物细胞中存在的一个或多个内源R1蛋白质的活性降低。
9.根据权利要求8的方法，其中所述外来核酸分子选自(a)编码至少一个引起编码R1蛋白的内源基因表达降低的反义RNA的DNA分子；(b)通过共抑制作用导致编码R1蛋白的内源基因表达降低的DNA分子；(c)编码至少一个以特定方式切割编码R1蛋白的内源基因的转录物的核酶的DNA分子；(d)通过体内诱变导入的、在编码内源R1蛋白的基因中导致突变或异源序列插入的核酸分子，该突变或插入引起所述基因表达降低或合成失活的R1蛋白；(e)同时编码至少一个反义RNA和至少一个有义RNA的DNA分子，所述反义RNA和所述有义RNA形成可以引起编码R1蛋白的内源基因表达降低的双链RNA分子；(f)含有转座子的DNA分子，该转座子序列的整合在编码R1蛋白的内源基因中导致突变或插入，该突变或插入引起所述基因表达降低或失活的R1蛋白合成；和(g)通过插入编码R1蛋白的内源基因中引起编码R1蛋白的基因表达降低或失活的R1蛋白合成的T-DNA分子。
10.根据权利要求1至4或6至9之一的方法，其中所述植物材料来源于马铃薯植物。
11.根据权利要求10的方法，其中所述热处理食物选自油炸马铃薯条、油炸马铃薯片、部分油炸马铃薯条和马铃薯泥。
12.根据权利要求1、6、7、8、9或10之一的植物材料在制备与相应常规热处理食物相比丙烯酰胺含量降低的热处理食物中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中与相应常规热处理食物的丙烯酰胺含量相比，所述丙烯酰胺含量降低了至少15％。
14.根据权利要求12或13的用途，其中所述热处理食物选自油炸马铃薯片、油炸马铃薯条、部分油炸马铃薯条、马铃薯泥、饼干、发面饼干、面包干、早餐谷物、玉米酥(tacos)、爆米花、面包酥、薄脆饼、salt sticks、咖啡、面包、馅卷、蛋糕、大米酥、比萨饼和烤面包片，以及玉米粉煎饼、油炸丸子、wedges、马铃薯棒、麻花面包、用于肉、鱼和蔬菜的面包涂层、用于坚果的面包涂层、玉米粉饼片、面包或谷物配制品、预熟的食品，婴儿食品。
15.根据权利要求1、6、7、8、9或10之一的植物材料在降低热处理食物的丙烯酰胺含量中的用途。
16.鉴定适用于制备丙烯酰胺含量降低的热处理食物的植物材料的方法，包括a)确定适于制备热处理食物的植物材料的可溶性糖和/或氨基酸含量；和b)根据步骤a)选择这样的植物材料，它与相应常规植物材料相比，可溶性糖和/或氨基酸含量降低。
全文摘要
本发明涉及，与相应的常规热处理食物相比，降低热处理食物的丙烯酰胺含量的方法。
文档编号A23L1/01GK1708233SQ200380102459
公开日2005年12月14日 申请日期2003年11月7日 优先权日2002年11月8日
发明者S·索伊卡, C·弗罗贝格, M·宽茨, B·埃西格曼 申请人:拜尔作物科学有限公司