病原菌应答性启动子的制作方法

专利名称：病原菌应答性启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及对病原菌具有应答性的启动子以及利用该启动子的抗病原菌植物。
背景技术：
马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)与马铃薯植物之间存在着明确的小种-品种间的专一性寄生关系，这种专一性的寄主-病原菌相互关系大多由病原菌所保有的非病原性基因和寄主所具有的真性抗性基因的组合来决定。尝试感染非亲和性小种时，寄主中被诱导出动态抗性反应。即，感染组织中表达伴随活性氧生成、超敏感性细胞死亡、植物抗毒素(马铃薯中为日齐素)的生成、PR(病理相关)蛋白的表达、乳突毛形成、木质化等过敏性反应的抗性反应，病原菌的发展停止(参照文献15、32、44、45和47)。另一方面，感染亲和性小种时，不会诱导这些抗性反应，病原菌的侵入得到发展，引起马铃薯植物的致命性整株感染病——马铃薯晚疫病。
可以认为这些动态抗性反应中，最重要的局部抗性反应之一为植物抗毒素的蓄积。植物抗毒素是在感染病原菌时被诱导蓄积的具有抗菌作用的小分子物质，有文献显示其在决定感染与否时发挥了重要的作用(参照文献12、13、21、28和46)。马铃薯中的植物抗毒素是倍半萜烯化合物，通过类异戊二烯代谢系统合成(

图1)。
马铃薯中，已知通过引发物处理或接种非亲和性小种，类异戊二烯合成由固醇·配糖生物碱合成急剧地转换为倍半萜烯植物抗毒素的合成。该现象可能是由于在类异戊二烯合成系统的限速步骤中协同作用的角鲨烯合酶和倍半萜环化酶所调节的，这两种酶分别使该系统偏向固醇·配糖生物碱合成途径或类异戊二烯植物抗毒素合成途径(参照文献8)。马铃薯的倍半萜环化酶是vetispiradiene合酶，其被命名为马铃薯vetispiradiene合酶(参照文献53)。有报道指出通过接种病原菌和经来自马铃薯晚疫病菌细胞壁的引发物HWC处理，马铃薯块茎组织的PVS活性显著增加(参照文献54)。还已知烟草植物中，通过引发物处理，倍半萜烯合成途径激活，合成了一种植物抗毒素——辣椒二醇(参照文献42和48)。最近，这些现象在基因表达水平得到阐明。分离马铃薯的PVS和角鲨烯合酶的cDNA，以这些克隆作为探针，使用由马铃薯块茎提取的RNA进行Nortern印迹分析时，证实在亲和性和非亲和性小种接种区中诱导了PVS mRNA的瞬时蓄积。另一方面也显示有观察到创伤处角鲨烯合酶诱导的mRNA蓄积，因接种亲和性和非亲和性小种受到抑制(参照文献53)。不过，该报告与仅在接种非亲和性小种时植物抗毒素生物合成，病原菌发展停止的情况是矛盾的(参照文献40)。
通常已知很多植物的基因构成多基因家族，各同源基因具有不同器官专一性，在对刺激应答产生的代谢变化中发挥不同的作用。有报道指出马铃薯植物中的PVS基因形成多基因家族，存在PVS1～4成员(参照文献53)。但是，有关这些各成员表达情况的详细内容未有论述。
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发明内容
人们试图利用植物所具备的抗性反应来增强抗病性。其中的一项研究是利用病害应答性启动子在病害时特异性生成抗性诱导物质的方法。根据所述方法，病害时可特异地且迅速地生成抗性诱导物质，由此实现有效的防御。
过去发现了几种病害应答性启动子，但迄今为止，所报告的病害应答性启动子不仅在病原菌感染时被诱导，大多在创伤或在生长阶段也被诱导。因此，使用这样的启动子制备导入了抗性诱导物质生成相关基因的转基因植物，在病原菌的感染部位以外(感染时以外)转基因也表达，可以预想植物会因此而受害。本发明在以上背景下完成，其目的在于提供对于病原菌的感染特异性应答的启动子(病原菌应答性启动子)，以及利用该启动子制备抗病原菌植物的方法等。
本发明人鉴于以上课题，尝试从马铃薯植物中获得对于作为病原菌代表的晚疫病菌具有特异应答性的启动子。首先将研究集中于与植物抗毒素的生成有关的基因——马铃薯vetispiradiene合酶(PVS)，详细地研究了晚疫病菌的主要的初次感染部位叶组织中各PVS成员(PVS1-PVS4)的表达情况。结果得知只有PVS3无论接种亲和性小种或非亲和性小种时都被强烈诱导。即表明PVS3的启动子对于亲和性小种感染也显示应答性。
接下来，构建马铃薯基因组文库，尝试利用该文库来了解PVS3的序列。经多次筛选，最终成功地确定了PVS3基因组DNA序列。在依据所确定的序列信息推定PVS3的启动子区，研究其功能时，确认了对晚疫病菌的应答性。为了进一步详细研究该推定启动子区的功能，首先在GUS基因的上游连接该推定启动子区，将其导入马铃薯，制备马铃薯转化体。使用该转化体进行各种试验，结果未见叶组织切除(创伤)导致的GUS染色，而见到了接种晚疫病菌亲和性小种导致的GUS染色，由此确认该启动子区显示晚疫病菌特异地、即病原菌特异性应答性。
如上所述，本发明成功地获得了对病原菌感染显示特异性应答的启动子(病原菌应答性启动子)。利用该启动子可制备只在感染病原菌时使特定的基因表达的植物。即，导入连接有该启动子的基因后所得的转化体中，当病原菌感染时，导入的启动子被特异性诱导，结果使转基因表达。如果采用可激活防御应答的基因作为转基因，则可以制备当病原菌的感染时，可特异性激活防御应答的植物，即，可制备对于病原菌感染具有高抗性的植物。
这里，通常的基因转录由被称为转录活性因子的蛋白质因子结合到启动子区内的被称为顺式序列的几个碱基-十几个碱基的序列而起始(文献66)。因此，确定顺式序列是阐明转录机理的第一步。鉴于此，本发明人将成功鉴定的上述推定启动子的一部分依次去掉后所得的PVS3启动子序列与GUS基因形成的嵌合基因(PVS3:GUS)通过根癌农杆菌(Agrobacterim tumefaciens)瞬时导入叶组织，研究PVS3启动子活性。结果发现了启动子活性的重要的区——50bp(SEQ ID No.23)的区。即，成功地鉴定出可能是PVS3启动子活性表达所必须的50bp的区。但目前在该区中尚未发现已知的调控元件。
本发明人成功鉴定的病原菌应答性启动子(PVS3启动子)虽然是由马铃薯植物获得的，但其适用对象不仅限于马铃薯植物。首先第一点，PVS3是催化马铃薯植物中植物抗毒素合成的酶，马铃薯植物与其它茄科植物中的植物抗毒素都是萜烯类化合物，这点是共同的，它们具有共同的植物抗毒素的合成途径。如后所述，还已知本基因的诱导依赖于SIPK和WIPK，两种酶通常不仅限于茄科植物，在很多植物中都是共同的，其与防御应答有关。考虑到这么多的共同点，可以预想本发明的启动子(PVS3启动子)不仅限于茄科植物，在已报告有SIPK和WIPK直向同源相关性的十字花科(参照文献57)、豆科植物(参照文献58)为中心的其它广泛的植物中也同样可作为病原菌应答性启动子应用。
本发明是基于以上的研究结果而完成的，提供以下内容。
含有以下(a)-(c)中任意一项的DNA的病原菌应答性启动子(a)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的DNA；(b)含有在SEQ ID NO.1所示碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(c)在严谨条件下与(a)或(b)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
含有以下(A)-(C)中任意一项的DNA的病原菌应答性启动子(A)含有SEQ ID NO.2所示碱基序列的DNA；(B)含有在SEQ ID NO.2所示碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(C)在严谨条件下与(A)或(B)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
含有以下(1)-(3)中任意一项的DNA的病原菌应答性启动子(1)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列内连续的一部分，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(2)含有在(1)的DNA中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
(3)在严谨条件下与(1)或(2)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
含有以下(i)-(iii)中任意一项的DNA的病原菌应答性启动子(i)含有SEQ ID NO.22所示碱基序列的DNA；(ii)含有在SEQ ID NO.22所示碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(iii)在严谨条件下与(i)或(ii)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
含有以下(I)-(III)中任意一项的DNA，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的病原菌应答性启动子(I)含有SEQ ID NO.23所示碱基序列的DNA；(II)含有在SEQ ID NO.23所示的碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列的DNA；(III)在严谨条件下与(I)或(II)的DNA杂交的DNA。
[1]-[5]中任一项的病原菌应答性启动子，其特征在于对病原菌感染特异性应答。
DNA，该DNA含有SEQ ID NO.23所示碱基序列。
DNA，该DNA含有SEQ ID NO.23所示碱基序列中连续10个或以上的碱基序列，具有病原菌应答性启动子活性。
载体，该载体包含[1]-[6]中任一项的病原菌应答性启动子。
载体，该载体含有[7]或[8]的DNA。
DNA构建体，该DNA构建体包括[1]-[6]中任一项的启动子；与该启动子相连并受其控制的、在植物体内表达并激活该植物的防御应答的基因。
DNA构建体，该DNA构建体包括[7]或[8]的DNA；与该DNA协同构成病原菌应答性启动子的DNA；与所构建的病原菌应答性启动子相连并受其控制的、在植物体内表达并激活该植物的防御应答的基因。
[11]或[12]的DNA构建体，其中上述基因具有其表达产物激活控制植物的防御应答的信息转导途径的功能。
[11]或[12]的DNA构建体，其中上述基因具有其表达产物激活SIPK或WIPK的功能。
[11]或[12]的DNA构建体，其中上述基因编码组成型活性形式MEK的基因。
转化体，该转化体是用[11]-[15]中任一项的DNA构建体转化宿主植物而得到的。
[16]的转化体，其中上述宿主植物是茄科植物。
[16]的转化体，其中上述宿主植物是马铃薯属的植物。
转基因植物的制备方法，包括用[11]-[15]中任一项的DNA构建体转化宿主植物的步骤。
赋予宿主植物病原菌抗性的方法，包括用[11]-[15]中任一项的DNA构建体转化宿主植物的步骤。
]植物，该植物外源导入了[1]-[6]中任一项的病原菌应答性启动子。
植物，该植物外源导入了[7]或[8]的DNA。
本发明中，“病原菌应答性启动子”是指对病原菌感染产生应答(被诱导)的启动子。这里，“启动子”是指调节在其控制下的基因转录起始的功能区。
本发明中的“外源导入”是指由外部导入。因此“外源导入的启动子”是指由外部导入宿主细胞的启动子，例如当宿主细胞原本保有与导入的启动子相同的启动子时，虽然构成相同，但只有导入的启动子才被称为外源导入的启动子，以此区分两者。
本发明中，术语“含有DNA”也包括“由DNA组成”的表达方式。因此例如对于“含有特定的DNA的启动子”而言，其含义当然也包括“由该DNA组成的启动子”。
本说明书中使用的各简写符号的含义如下。ATP腺苷5’-三磷酸、BPB溴酚蓝、BSA牛血清清蛋白、CBB考马斯亮蓝、CTP胞苷5’-三磷酸、DEPC焦碳酸二乙酯、DTT二硫苏糖醇、EDTA乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸、EGTA乙二醇双(β-氨基乙醚)乙二胺-四乙酸、FPP法尼基二磷酸、GAP甘油醛-3-磷酸、GTP鸟苷-5’-三磷酸、HMG-CoA3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A、HMGR3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、HWC菌丝壁组分、Ig免疫球蛋白、IPP异戊烯基二磷酸、IPTG异丙基-1-硫代-β-D-硫代半乳糖苷、KD千道尔顿、MOPS3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳、PBS磷酸盐缓冲液、PCR聚合酶链式反应、PMSF苯甲基磺酰氟、PR病理相关、SDS十二烷基硫酸钠、SHAM水杨异羟肟酸(salycylhydroxamic acid)、SSPE氯化钠-磷酸钠、EDTA、TBEtris-硼酸、EDTA、TBStris缓冲盐溶液、TEtris-EDTA、Tris2-N-三(羟甲基)氨基甲烷、TTP5’-三磷酸硫胺素、X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。
如无特别说明，以下的基因工程操作可参考Molecular Cloning(ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)或Currentprotocols in Molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel等.，1987)进行。
本发明提供由病原菌感染而诱导的启动子。利用本发明的启动子进行基因导入，则可以在转基因植物中使所需基因在病原菌感染时特异表达。因此，例如使用与防御应答有关的基因，可以制备在病原菌感染时可以迅速进行防御应答的抗病原菌植物。
附图简述图1是表示马铃薯块茎中刺激应答性类异戊二烯的生物合成途径的图。过敏性反应中，倍半萜烯植物抗毒素的合成活跃进行，创伤诱导性固醇和类固醇·配糖生物碱的合成受到抑制。
图2是表示感染晚疫病菌后的陈化马铃薯片内的PVS(马铃薯vetispiradiene合酶)基因和PSS(马铃薯角鲨烯合酶)基因的表达状态的图。感染小种0(非亲和性)、或感染小种1、2、3、4(亲和性)(104游动孢子/片)或者水处理之前将马铃薯片陈化24小时。
图3是表示使用由感染非亲和性晚疫病菌或亲和性晚疫病菌后(顺序为非亲和性、亲和性)、或者水处理后(Mock)的陈化马铃薯片中提取的总RNA进行RT-PCR的结果图。使用PVS1、PVS2、PVS3和PVS4各自的克隆特异性引物进行PCR。对于PVS1、PVS2、PVS3和PVS4分别得到了469bp、132bp、326bp和469bp的扩增产物。
图4是表示使用由感染非亲和性晚疫病菌或亲和性晚疫病菌后(顺序为非亲和性、亲和性)、或者水处理后(Mock)的陈化马铃薯片中提取的总蛋白进行Western印迹分析的结果图。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，各分离10μg的总蛋白，使用抗PVS抗血清进行免疫印迹。检测采用了HRP结合抗小鼠抗体和ECL检测试剂盒。
图5是表示使用从水处理后(Mock)、创伤处理后或感染非亲和性晚疫病菌或者亲和性晚疫病菌后(顺序为非亲和性、亲和性)的马铃薯叶中提取的总RNA进行RT-PCR的结果图。泳道T1使用由感染非亲和性晚疫病菌6小时后的马铃薯块茎中得到的RT-PCR产物的阳性对照。使用各成员(PVS1、PVS2、PVS3和PVS4)特异性引物。结果分别得到了176bp、132bp、326bp和131bp的产物。通过琼脂糖凝胶电泳分离RT-PCR产物，转印尼龙膜。使32P标记的各PCR产物与转印后的膜杂交。
图6表示PVS3基因组克隆的碱基序列和推定的氨基酸序列。图6中给出了推定启动子区和编码区的一部分。氨基酸序列表示在编码该序列的碱基下。非编码区用小写字母表示。终止密码子用星号表示。
图7表示PVS3基因组克隆的碱基序列和推定氨基酸序列。图7中给出了编码区的一部分以及与其相连的非翻译区。氨基酸序列表示在编码该序列的碱基下。非编码区用小写字母表示。终止密码子用星号表示。
图8表示PVS3基因组克隆以及PVS3cDNA克隆的限制酶图谱和结构图谱。编码区用中空框表示。粗线表示内含子。竖线对应内含子的位置。
图9是将烟草(Nicotiana tabacum)(TEAS)、马铃薯(Solanumtuberosum)(PVS)、钝天仙子(Hyoscyamus muticus)(HVS)和辣椒(Capsiumannum)(PEAS)的氨基酸序列的比对模式图。使用与各外显子对应的推定氨基酸。粗竖线表示烟草基因内、马铃薯基因内、钝天仙子基因内和辣椒基因内的内含子位置。框格内的数字表示由外显子编码的氨基酸残基数。百分数表示比较域之间的同源性得分，H、C和DDXXD(或DDXX)表示富含组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸的(已知作为底物结合位点)的保守残基。
图10是用晚疫病菌丝壁成分处理后或水处理后的马铃薯原生质体内萤光素酶活性的测定结果。(A)表示用PVS3启动子区进行瞬时表达测定时所使用的Luc基因的构建体。(B)中，35S表示使用CaMV 35S启动子区时的萤光素酶活性，HWC表示使用推定启动子区，用HWC处理时的萤光素酶活性，“水”表示用水代替HWC进行处理时的萤光素酶活性。
图11是模式表示PVS3启动子构建体的图。GUS是报道基因。
图12是表示应答创伤时PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。使用带有PVS3启动子的转基因马铃薯叶组织。
图13是表示应答晚疫病菌感染的PVS3启动子的表达模式图。使转基因马铃薯叶组织(MayQueen)或作为染色对照区的非转基因马铃薯叶组织(利尻)感染小种0(对于MayQueen为亲和性，对于利尻为非亲和性)。用GUS染色溶液检测感染6小时、12小时、24小时和48小时后的GUS活性。在显微镜下进行观察。
图14表示转基因马铃薯植物中，PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。使用GUS染色溶液检测转基因马铃薯植物的GUS活性。箭头表示晚疫病菌感染区(GUS染色对照)。
图15表示应答花生四烯酸(AA)的PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。将AA(5mM)或水注入转基因马铃薯叶组织。用GUS染色溶液检测注入6小时、12小时、24小时和48小时后的GUS活性。
图16表示应答H2O2的PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。将H2O2(5mM)注入转基因马铃薯叶组织。用GUS染色溶液检测注入6小时、12小时、24小时和48小时后的GUS活性。
图17表示应答葡萄糖/葡糖氧化酶的PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。将葡萄糖(5mM)和葡糖氧化酶(0.5U/ml)注入转基因马铃薯叶组织。用GUS染色溶液检测注入6小时、12小时、24小时和48小时后的GUS活性。
图18表示应答水杨酸(SA)的PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。将SA(5mM)注入转基因马铃薯叶组织。用GUS染色溶液检测注入6小时、12小时、24小时和48小时后的GUS活性。
图19表示应答Cf-9/Avr9相互作用或StMEKDD的PVS3启动子诱导的GUS表达模式图。将保有35s、Cf-9/Avr9、StMEKDD或空载体(对照)的农杆菌接种到转基因马铃薯叶组织。用GUS染色溶液检测接种农杆菌2天后的GUS活性。
图20是表示引发物诱导信号转导途径的图示说明。MAPKKK促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶；MAPKK促分裂原活化蛋白激酶激酶；MAPK促分裂原活化蛋白激酶；SIPK水杨酸诱导的蛋白激酶；WIPK创伤诱导的蛋白激酶；HMGR3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；PVS马铃薯vetispiradiene合酶图21表示马铃薯植物的MEK基因(MEK)的编码区序列及推定其所编码的氨基酸序列。
图22表示组成型活性形式MEK基因(stMEKDD)的编码区序列及推定其所编码的氨基酸序列。
图23表示实施例中使用的引物序列的位置图。与表示各引物位置的箭头一起标记的编号表示SEQ ID NO(例如P9为具有SEQ ID NO.9的序列的引物)。实施例2中使用了P9、P10、P11、P14、P15、P16、P17和P18。而实施例4中使用了P11、P12、P13、P14、P15、P16、P19和P20。
图24表示由pPVS3-1构建pPVS3-10缺失克隆时所使用的引物序列。F表示正向引物，R表示反向引物，下划线表示限制酶的位置。
图25表示瞬时表达测定中使用的含有PVS启动子区的双元载体结构。GUS基因包含内含子。
图26表示对于INF1处理或StMEK1DD表达的PVS3启动子活性的研究方法。对于INF1，是将保有PVS3GUSint的农杆菌注入叶中；对于StMEK1DD，是将保有PVS3GUSint和XVEStMEK1DD的农杆菌混合液注入叶中，静置一天(A)。然后，对于INF1，将INF1溶液注入叶中；对于StMEK1DD，注入β-雌二醇后(B)再静置一天，使StMEK1DD表达，研究GUS活性(C)。
图27表示病毒诱导型基因沉默的过程。(A)表示沉默载体pGR106的结构。将待沉默的基因片段，此时为SIPK和WIPK的cDNA片段插入pGR106。(B)是表示通过接种含有载体的农杆菌来感染病毒的模式图。
图28表示对于INF1处理的PVS3启动子活性。与对照区相比，对-1337(pPVS3-2)中注入INF则诱导GUS活性。另一方面，使-1287(pPVS3-3)之前的PVS3启动子缺失，则经INF1处理而诱导的GUS活性显著减少。
图29表示PVS3启动子的碱基序列和由pPVS3-1至pPVS3-10的缺失位置。将可能存在顺式序列的-1337和-1287之间的序列用粗字体表示，将推定的TATA框和CAAT框用方框包围。
图30表示应答StMEK1DD表达的PVS3启动子活性。与对照区相比，对-1337(pPVS3-2)注入β-雌二醇则诱导GUS活性。另一方面，使-1287(pPVS3-3)之前的PVS3启动子缺失，则经β-雌二醇处理而诱导的GUS活性显著减少。
图31表示WIPK或SIPK对由StMEK1DD表达而诱导的PVS3启动子活性的影响的研究方法。将保有PVS3:GUSint和XVE:StMEK1DD的农杆菌混合液注入沉默叶中，静置一天(A)。注入β-雌二醇后(B)再静置一天，使StMEK1DD表达，研究GUS活性(C)。
图32表示WIPK或SIPK对由StMEK1DD表达而诱导的PVS3启动子活性和TEAS基因表达的影响。使WIPK或SIPK沉默，则StMEK1DD诱导的PVS3启动子活性显著受到抑制(A)。并且，提取总RNA进行Nortern印迹分析时，只在使WIPK或SIPK沉默的区中，本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)的倍半萜环化酶基因表达受到抑制(B)。
实施发明的最佳方式(启动子)本发明的第一方面涉及病原菌应答性启动子，其中一个方案是包含由SEQ ID NO.1所示碱基序列形成的DNA。如后述实施例所说明的那样，该DNA被鉴定为马铃薯PVS3基因的启动子区的序列，其具有对作为病原菌的一种的晚疫病菌的特异应答性。进一步研究的结果表明，即使是该DNA的上游缺失的，含有约1,300bp的DNA(SEQ ID NO.22)也可以保持目标启动子活性。考虑到上述情况，本发明的一个优选的方案是包含由SEQ ID NO.22所示碱基序列的DNA的病原菌特异性启动子。另一方面，如果使该DNA序列(SEQ ID NO.22)的上游进一步缺失50bp(SEQ ID NO.23)，则启动子活性急剧降低。由此可以推测该缺失的50bp(SEQ ID NO.23)是对于该启动子活性的发挥极为重要的区，即包含PVS3基因启动子的顺式序列的区域。因此，该区(以下也称为“第1DNA序列”)对于病原菌应答性启动子的构建极为有用，另外通过使用该区，可以以高自由度设计并构建结合有病原菌应答性启动子的DNA构建体(例如用于赋予植物病原菌抗性的重组载体。具体参照后述DNA构建体一项的内容)。这样，作为另一种方案，本发明提供可用于构建病原菌应答性启动子的DNA序列。这里，如果考虑到通常顺式序列大多是含有十几个碱基的序列，则第1DNA序列的一部分可能是顺式序列。这意味着即使是含有第1DNA序列的一部分区的DNA，当它包含顺式序列时，即成为可用于构建对病原菌应答性启动子有用的DNA。可以推测这样的DNA例如含有第1DNA序列中连续10个或以上碱基的碱基序列、优选含有连续15个或以上碱基的碱基序列、进一步优选含有连续20个或以上碱基的碱基序列的DNA。
使用第1DNA序列(或者其连续的一部分，或者如后所述，在保持其功能的条件下对第1DNA序列或其连续的一部分实施所希望的修饰而得到的DNA(修饰体))时，通过与其它DNA序列组合，可以构建病原菌应答性启动子。这里所述其它的DNA序列可以使用通过与第1DNA序列(或其修饰体)协同作用而可以构建病原菌应答性启动子的DNA序列。具体来说，作为其它的DNA序列，例如可使用SEQ ID NO.24所示的DNA序列。该DNA序列是在PVS3基因中，夹在第1DNA序列和编码区之间的区的DNA序列(参照图29)。该区中存在CAAT框或TATA框，使用该区还可以构建原本的PVS3启动子区，因此通过这样的方案，可以获得具有高启动子活性的病原菌应答性启动子。另外，并不限于该例子，只要采用含有CAAT框或TATA框等的DNA序列，则通过与这些转录起始或转录调控相关的序列的协同作用，预期可以发挥良好的启动子功能。这里的其他的DNA序列可直接或经由其他序列与第1DNA序列连接。
这里所述的“病原菌”是指感染植物使其受创伤的任何菌类，除晚疫病菌等病原丝状菌外，当然也包括病原性细菌。这里所述的，“晚疫病菌”是指属于疫霉属(Phytophthora)的菌类，按照感染对象植物进行分类。晚疫病菌的具体例子有马铃薯晚疫病菌(致病疫霉(Phytophthorainfestans))、烟草晚疫病菌(烟草疫霉(Phytophthora nicotianae))、大豆茎晚疫病菌(大雄疫霉大豆变种(Phytophthora megasperma var.sojae))、苹果晚疫病菌(恶疫霉(Phytophthora cactorum)和栗黑水疫霉(Phytophthoracambivora))。另一方面，除晚疫病菌之外的病原丝状菌有马铃薯菌核病菌(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)、大豆锈病菌(大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi))。另外病原性细菌可以例举番茄青枯病菌(青枯雷尔氏菌((Ralstonia solanacearum)、细菌)。
这里，本发明的启动子(包含对病原菌应答性启动子的构建有用的DNA。如无特别说明，以下也同样)优选对病原菌的感染具有特异应答性。这里所述的“特异性”是指特异性高。因此，本发明的启动子优选为对病原菌感染具有高的特异性，即对病原菌感染具有应答性，且对病原菌感染以外的病害基本上不具应答性的启动子。
(启动子的获得方法)本发明的启动子可如下制备例如按照常规方法从男爵马铃薯(Splanum tuberosum L.)等马铃薯植物中提取基因组DNA，然后使用本发明的启动子特异性引物，利用PCR法等基因扩增反应来制备。具体来说，例如可按照以下的过程制备本发明的启动子。首先，将取样后冷冻处理的马铃薯植物的叶或块茎在乳钵中磨碎。接着，加入适量提取缓冲液(例如含SDS的Tris-HCl缓冲液)，以此作为提取液。接着通过苯酚提取、乙醇沉淀等进行基因组DNA的提取、纯化。以这样得到的基因组DNA为模板，使用SEQ ID NO.1的启动子特异性引物进行PCR，得到作为扩增产物的目标DNA(启动子)。引物例如可使用具有以下序列的引物对。
有义引物TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG(SEQ ID NO.15)反义引物TCTCCATGAGTCCTTACATG(SEQ ID NO.16)引物设计为可特异性扩增目标DNA。以下表示可特异性扩增SEQ IDNO.22的DNA的引物对。
有义引物CGGAATTCGTCCGCCCTTACTATTCCCATC(SEQ IDNO.26)反义引物CCATCGATTCCTCTTCATTGTTAAAGGGGA(SEQ IDNO.35)本发明的启动子的制备方法并不限于上述，例如可以利用市售的马铃薯基因组文库(例如马铃薯品种Desiree基因组文库(Clontech))来制备。由这样的马铃薯基因组文库分离目标启动子时，可以根据文库的种类，利用噬菌斑杂交法或菌落杂交法(参照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York等)。例如当为使用噬菌体构建的文库时，举例来说，可以利用噬菌斑杂交法。选择保有目标启动子区的克隆时，可以使用具有本发明的启动子特异性序列为探针。
选择好目标克隆后，可以以该克隆所保有的DNA为模板，使用SEQ IDNO.1序列特异性引物进行PCR，由此得到作为扩增产物的本发明的启动子。
可将得到的克隆所保有的DNA亚克隆到适当的载体中，用于以后的应用。由此，例如可用于转化用重组载体的构建(参照后述本发明的第二方面)，或者构建用于解读碱基序列的质粒。
本发明的启动子的制备方法并不限于上述，例如可以利用市售的DNA合成仪等合成本发明的启动子。
(修饰启动子)SEQ ID NO.1的序列大约为2600bp，作为启动子区是相当大的，因此推测与启动子活性有直接关系的只是其中的一部分区。基于该考虑，如果能够确认即使含有SEQ ID NO.1序列内连续的一部分的区，只要其可发挥病原菌应答性启动子功能，则可构建本发明的病原菌应答性启动子。考虑到通常启动子的功能区大多位于紧邻结构基因的前面，例如图6和7所示的PVS3基因序列中，包含-2000位至-1位的碱基的区(SEQ IDNO.2)、优选包含同一区域中-1500位至-1位的碱基的区(SEQ ID NO.3)、进一步优选包含同一区域中-1000位至-1位的碱基的区(SEQ ID NO.4)就是功能区的有力的候选物。实际上，如后述的实施例所示，使用位于紧邻结构基因的前面的约1300bp的区(SEQ ID NO.22)时，就可确认其具有启动子活性。而使该约1300bp的区的上游区50bp(SEQ ID NO.23)进一步缺失，则可见启动子活性急剧降低。即，由此可确定PVS3启动子的至少一个功能区存在于该50bp内。考虑到该事实，本发明的启动子中优选包含SEQ ID NO.23所示的序列。这样的启动子的具体例子有SEQ ID NO.22所示的DNA(PVS3基因的-1337位至-1位)。
另一方面，通常，即使对具有特定功能的DNA的一部分进行修饰也可以保持其功能。基于该考虑，即使是具有使构成以上本发明的启动子的DNA(即SEQ ID NO.1所示的DNA或含有上述功能区(SEQ ID NO.23)的DNA(例如SEQ ID NO.22所示的DNA))的一部分经过修饰的碱基序列的DNA(以下也称为“修饰DNA”)，只要其具有作为病原菌应答性启动子的功能，即可构成本发明的病原菌应答性启动子。换言之，只要保持病原菌应答性启动子功能，一部分序列的修饰是可接受的。这里的“一部分修饰”的典型的情形有SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.2-4中任意一项的)所示的碱基序列、或SEQ ID NO.22所示的碱基序列中，1或多个碱基取代、缺失、插入或附加。这样的修饰可以在多个位点发生。这里的“多个”因进行修饰的位置或修饰的种类而不同，例如为2-100个，优选2-50个，更优选2-10个。如上所述的修饰的DNA例如可通过限制酶处理、经外切核酸酶或DNA连接酶等的处理、导入定点诱变(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)或导入随机诱变(Molecular Cloning，ThirdEdition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)等导入突变的方法获得。
可以将与具有SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.2-4中任意一项的)的序列的DNA、或具有SEQ ID NO.22的序列的DNA在严谨条件下杂交、且在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA作为构成本发明的启动子的DNA使用。还可以使用与具有在SEQ ID NO.1的序列上施加上述部分修饰而得到的序列(或在SEQ ID NO.2-4中任意一项的序列上施加上述部分修饰而得到的序列)的DNA、或者在SEQ ID NO.22的序列上施加上述部分修饰而得到的序列在严谨条件下杂交、且在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。这里所述的“严谨的条件”是指形成所谓的特异性杂合体，但不形成非特异性杂合体的条件。严谨的条件根据序列长度或构成碱基的种类而变动，例如以下条件使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑精DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在42℃孵育，然后在68℃用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。进一步优选的严谨条件有使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑精DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)作为杂交液的条件。
(DNA构建体)通过连接在本发明的启动子控制下，任何通过表达而激活植物的防御应答的基因(转基因)，均可以构建可使植物具有病原菌抗性的DNA构建体。作为转化用的DNA构建体，优选将本发明的启动子和转基因掺入适当的载体(例如，质粒、细菌噬菌体、病毒)。
(转基因)转基因使用具有以下功能的基因通过在所导入的植物内表达，激活该植物的防御应答。例如可以将具有激活信息转导途径的功能的基因作为转基因，其中所述信息转导途径是控制植物的防御应答的信息转导途径。这样的基因的具体例子有具有激活促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的一种SIPK(水杨酸诱导的蛋白激酶)或WIPK(创伤诱导的蛋白激酶)的功能的MEK基因。作为MEK基因的一个例子，马铃薯植物的MEK基因(StMEK)的编码区序列(SEQ ID NO.5)以及其所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)如图21所示。
特别优选采用编码组成型活性形式蛋白质的基因作为转基因。这些基因可以从原本即在转化体内生成的激活防御应答的蛋白质原本的活性形式，其可迅速且确实地进行防御反应。编码组成型活性形式蛋白质的基因可如下制备以编码野生型蛋白质的基因的序列为基础，实施部分修饰，使其所编码的氨基酸序列的一部分发生变异。马铃薯植物中，制备了具有修饰的MEK的组成型活性形式MEK(StMEKDD)，本发明中，可利用编码该StMEKDD的基因作为转基因。StMEKDD基因的编码区序列(SEQ ID NO.7)以及其所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)如图22所示。
这里，上述“防御应答”的种类没有特别限定，例如植物抗毒素的生成、PR(病理相关)蛋白的表达、活性氧的生成、乳突毛的形成、木质化等均在其列。
(载体)上述DNA构建体的构建中所用的载体只要可将本发明的启动子以及其控制下设置的转基因导入目标细胞(宿主细胞)、且可使转基因在目标细胞内表达的载体即可，对其并没有特别限定，可以根据相应的目的利用适当的质粒载体、λ噬菌体载体等。在构建后述的利用农杆菌转化中所使用的载体时，例如可以利用具有T-DNA边界序列的Ti质粒载体、Ti质粒双元载体。另一方面，在使用无需经由农杆菌的转化方法(电穿孔法、基因枪法等)时，可以利用各种pUC系质粒载体、各种λ噬菌体载体(ZAPII等)等构建重组载体。很多载体市场都有售，本发明可以根据目的从其中适当选择使用。
首先构建含有本发明的启动子的载体，之后可进行转基因的连接。即，可构建可插入所需转基因的通用性高的载体，利用其制备转化用重组载体。
典型的转化用重组载体中，除本发明的启动子之外还可含有转基因和适当的终止子。由上游向下游依次设置启动子、转基因以及终止子，以通过启动子实现转基因的适当的转录。重组载体内可以含有选择性标记或具有增强子功能的序列、编码信号肽的序列等。
(终止子)终止子是作为使mRNA的合成终止的信号而被识别的序列。使用在植物细胞内适当发挥功能的终止子。例如可以使用Nos终止子。
(选择性标记)选择性标记用于识别或选择转化的细胞、组织、愈伤组织等。各种选择性标记都是众所周知的，例如可根据所使用的载体-宿主系统或使用目的，适当选择对卡那霉素等具有抗性的npt基因(Herrera Estrella、EMBO J.2(1983)、987-995)或nptII基因(Messing & Vierra.Gene 19259-268(1982))、对潮霉素具有抗性的hph基因(Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 42929-2931)、对氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等.，EMBO J.2(7))、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、GFP基因(Gerdes、FEBS Lett.389(1996)、44-47)、萤光素酶(Giacomin、p1.Sci.116(1996)、59-72；Scikantha、j.Bact.178(1996)、121)等使用。
启动子或转基因向载体的插入可以使用限制酶和DNA连接酶的方法等常规方法进行(例如参照Molecular Cloning，Third Edition，1.84，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。
(转化方法)可将本发明的DNA构建体或重组载体用于植物的转化。转化方法(基因导入方法)可以使用利用农杆菌的方法(农杆菌法)、利用聚乙二醇转基因的方法、利用电刺激转基因的方法(电穿孔法)以及将结合有基因的金属离子射入植物组织(细胞)的方法(基因枪法)等。各方法的详细内容在各种文献和出版书籍中均有记载，例如农杆菌法可参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，8467-8471或Plant Mol.Biol.20(1992)，963-976等。
转化马铃薯植物时，可以采用Jefferson(1987)的方法(参照文献19)。
导入包含本发明的启动子和转基因的DNA构建体而得到的转化体中，因病原菌感染而使启动子受到诱导，结果，其控制下的转基因表达。因此，如果采用对病原菌感染的防御有效的基因作为转基因，则可得到具有病原菌抗性的植物(转化体)。
使用转化得到的植物细胞可以再生转基因植物。这样的再生方法可以根据植物的种类，按照常规方法进行。
(目标植物)使用本发明的DNA构建体或重组载体转化的植物(目标植物)并没有特别限定，可以是任意的单子叶植物或双子叶植物。双子叶植物例如有被分类为茄科(马铃薯属、烟草属、番茄属等)、蔷薇科(梅属、桃属、苹果属等)、豆科(大豆属、豌豆属等)、十字花科(萝卜属等)、芝麻科等的植物，而单子叶植物例如有被分类为禾本科(稻属、小麦属、黑麦属、大麦属、燕麦属、玉米属、甘蔗属等)、百合科(大葱属、大蒜属)等的植物。
以下利用实施例对本发明进一步详细说明。
以下的实施例1-8中所使用的生物学材料、试剂、实验方法等如下。
1.供试植物使用不具真正抗性基因R1的栽培品种男爵马铃薯和具有真正抗性基因R1的品种利尻(Solanum tuberosum L.与野生品种S.demissum L.的种间杂交种)作为马铃薯植物。品种男爵采用名古屋大学农学部附属农场栽培并于7月收获的块茎，品种利尻采用农林水产省北海道农业试验场苗圃中栽培并于10月收获的块茎，均在4℃保存，用于试验。制备转基因植物时，使用不具真正抗性基因的MayQueen。
2.供试菌使用保存于名古屋大学大学院生命农学研究科资源生物功能学讲座病理学研究室的马铃薯晚疫病菌[Phytophthora infestan(Mont.)de Bary]小种0和小种1、2、3、4。另外，使用该研究室保存的马铃薯晚疫病菌[Phytophthora infestan(Mont.)de Bary]小种1、2、3、4，作为制备马铃薯晚疫病病菌菌丝壁成分(HWC)引发物所使用的菌。
3.菌接种物的制备马铃薯晚疫病菌的游动性孢子悬浮液如下制备。将保存于4℃的马铃薯(品种男爵)的块茎用自来水充分洗净，然后在1％次氯酸钠中浸泡约10分钟。将马铃薯块茎切片(厚度约10mm)，水洗后涂布接种浓度为约104孢子/ml游动孢子悬浮液，在20℃的湿暗条件下培养6天。用镊子取下切片表面生长的菌，悬浮于冷蒸馏水(4℃)中。将孢子悬浮液用金属筛(356筛号)过滤，除去菌丝，用滤纸(ADVANTEC No.5B)进行吸滤。用冷蒸馏水洗涤滤纸上收集的游动孢子囊，然后再悬浮于冷蒸馏水中，在10℃静置2小时。用紫外可见光分析系统(DU系列600、Beckman)测定游动孢子悬浮液的吸光度，将浓度调节为500nm波长下的吸光度为0.068(105孢子/ml)，以此作为接种物使用。
4.菌丝壁成分引发物的制备按照Doke和Tomiyama，(1980)的方法(参照文献14)，如下制备晚疫病菌菌丝壁成分(HWC)。将马铃薯晚疫病菌置于装有30ml黑麦培养基的100ml三角烧瓶中，在20℃静置培养2周。用自来水将回收的菌丝丛洗净，通过吸滤除去水分，在-80℃冷冻保存。将冷冻菌丝体在乳钵中磨碎，悬浮于菌丝体重5倍量的50mM乙酸缓冲液(pH4.5)中。用超声波破碎仪(W-225R Heat System-Ultrsonics inc.)，以45W的输出对该悬浮液超声波处理5分钟，然后用14,000×g离心30分钟。将所得沉淀悬浮于与之前等量的50mM乙酸缓冲液(pH4.5)中，再在与之前相同的条件下进行超声波处理和离心。将所得沉淀悬浮于与菌丝体等重量的0.1M硼酸缓冲液(pH8.8)中，在与上述同样的条件下进行超声波处理，然后经120℃高压釜处理20分钟，14,000×g离心30分钟，回收上清。另一方面，将沉淀再悬浮于0.1M硼酸缓冲液(pH8.8)中，超声波处理和高压釜处理后离心。将所得上清与之前得到的上清合并，使用透析管(排阻限分子量为12,000)，在4℃用水透析24小时。用分液漏斗将透析后的溶液与等量的二乙醚混合，静置。回收乳浊液层，用旋转蒸发干燥器减压干燥醚，向浓缩物中加入适量的水，冷冻干燥。所得干燥标品为HWC，用于以后的实验。使用HWC时，用超声波仪、以45W的输出进行3分钟超声波处理，悬浮于水中。
5.马铃薯块茎片的制备马铃薯块茎片如下制备。将保存于4℃的马铃薯(品种利尻)的块茎用自来水充分洗净，然后在1％次氯酸钠中浸泡约10分钟。用木塞钻孔器(直径20mm)将块茎沿茎轴方向钻入，取柔软组织部分制备圆柱状的组织柱。用切片机由该柱制备2mm厚度的片。制备的片立即用冷蒸馏水(约4℃)洗净，排列在塑料盘中，在湿暗条件下静置，陈化21小时。该操作完全在黑暗条件下进行。
6.HWC处理及菌的接种对根据上述5.的方法制备的马铃薯块茎片，每一片分别用100μl蒸馏水进行前处理，静置3小时。然后将各片用1mg/ml HWC或作为对照的100μl蒸馏水处理。将马铃薯晚疫病菌游动性孢子接种在片上时，为了使游动性孢子浓度保持均匀，一边搅拌悬浮液(105孢子/ml)一边接种100μl。对马铃薯的叶组织接种菌时，每一片各用500μl蒸馏水进行前处理，静置3小时。然后为了使游动性孢子浓度保持均匀，一边搅拌悬浮液一边对各叶组织接种500μl。
将处理和接种的片、叶组织再在20℃湿暗条件下静置，静置规定的时间。处理后，以3片静置的马铃薯块茎片为一组，以8片叶组织为一组，包在铝箔中，在液氮中冷冻固定，在-80℃保存。
7.由马铃薯叶或块茎提取总RNA总RNA的提取按照Yoshioka等(1996)的方法(参照文献52)进行。将各2g马铃薯叶或块茎片在乳钵中一边加入液氮一边磨碎，加到装有5ml提取缓冲液[100mM Tris-HCl(pH9.0)、100mM NaCl、1％SDS]、1ml 2-巯基乙醇、2.5ml 1M Tris(pH9.0)饱和苯酚、2.5ml氯仿异戊醇(24∶1；v/v)并经DEPC处理过的灭菌离心管中，充分悬浮，然后离心(8,000rpm、15分钟)。向回收的上清中加入二十分之一量的5M氯化钠、5ml异丙醇，在-20℃静置1小时。向离心(8,000rpm、15分钟)得到的沉淀中加入5ml胍盐缓冲液[4M硫氰酸胍、25mM乙酸钠(pH7.0)、0.5％N-月桂酰基肌氨酸、20mM 2-巯基乙醇]、500μl 2M乙酸钠(pH4.0)、5ml水饱和苯酚、1ml氯仿·异戊醇(49∶1；v/v)中，充分悬浮，离心(8,000rpm、15分钟)。向回收的上清中加入5ml异丙醇，在-20℃静置1小时。将离心(8,000rpm、15分钟)得到的沉淀悬浮于300μl胍盐缓冲液，加入等量的异丙醇，在-20℃静置1小时。在室温下，将离心(12,000rpm、15分钟)得到的沉淀用500μl 3M乙酸钠(pH5.2)洗涤，离心(12,000rpm、15分钟)。将该洗涤操作重复2次，再用500μl 70％乙醇洗涤，离心(15,000rpm、15分钟)分离。所得的沉淀真空干燥后溶解于100μl DEPC处理水，以其作为总RNA样品。
8.Nortern印迹分析用甲醛琼脂糖凝胶电泳(参照文献37)对总RNA进行分级，通过碱印迹法(alkaline blotting)(参照文献36)转印Hybond-N+尼龙膜(Amersham)并固定。采用叶PVS1cDNA作为探针。
将吸附有RNA的尼龙膜在42℃的预杂交溶液[50％甲酰胺、5×Denhartz溶液(参照文献37)、5×SSPE(参照文献37)、0.5％SDS、100μg/ml热变性鲑精DNA(Pharmacia)]中放置1小时或以上，然后添加32p标记DNA探针，在42℃下杂交16小时或以上。将该膜在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在室温下洗涤15分钟(2次)；在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在60℃下洗涤15分钟；再在含有0.1％SDS的2×SSPE中、在60℃下洗涤15分钟(1次)。使用X射线胶片OMAT-AR(Kodak)和增感纸Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下进行放射自显影。
9.RT-PCRRT-PCR使用RT-PCR high-Plus(TOYOBO)进行。cDNA的合成如下进行使用1.0μg总RNA、10pmol/μl反义引物和10pmol/μl反义引物，将包括94℃(1分钟)、47℃(1分钟)的扩增反应进行25个循环。使用的引物如下，图23中表示了各cDNA退火的位置。
PVS15’-AGGAGATTGTTCGCCCCATA-3’(SEQ ID NO.9)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.10)(469bp)、或者5’-CATCGATTGTTTTGTACATCTG-3’(SEQ ID NO.11)和5’-AATAATGATACAAAAAAAAATTAAGG-3’(SEQ ID NO.12)(176bp)PVS25’-TATCAATTCACCAAGGAACACT-3’(SEQ ID NO.13)和5’-GAAGTAATTAAATTTAAATATTATCAA-3’(SEQ ID NO.14)(132bp)PVS35’-TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG-3’(SEQ ID NO.15)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.16)(326bp)PVS45’-AGGACATTGTTCGACCTGTT-3’(SEQ ID NO.17)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.18)(469bp)、或者5’-CATCCCTTAAAATTATAAGTATTC-3’(SEQ ID NO.19)和5’-AATAATGATACAAAATAAATTAAGG-3’(SEQ ID NO.20)(131bp)通过2％琼脂糖凝胶电泳对合成的cDNA分级，用溴化乙锭染色，确认条带的有无(参照文献37)。
10.由马铃薯块茎制备可溶性组分由马铃薯块茎片制备可溶性组分的方法可对Dixon和Fuller，(1978)的方法(参照文献13)进行部分变化来进行。
将3片马铃薯块茎片作为1组，包在铝箔中，在液氮中冷冻固定，在-80℃保存。将冷冻的马铃薯块茎片在乳钵中一边加入液氮一边研磨棒粉碎。向所得的马铃薯块茎粉末中加入2g酚吸附剂polycra AT，用研磨棒搅拌。之后加入7ml提取缓冲液
，悬浮后冷却离心(14,000rpm、20分钟、4℃)，将得到的上清在-80℃下保存。
11.大肠杆菌中融合蛋白的表达及其提取为了获得用于制备抗体的抗原，将马铃薯PVS在大肠杆菌中表达。将全长的PVS1 cDNA的可翻译区插入由EcoRI和XhoI酶切的表达载体pET-32b(+)(宝酒造)，将所得载体导入大肠杆菌(BL21，Novagen)。将该大肠杆菌接种于含有50μg/ml carvenicilin的LB琼脂培养基上，在37℃培养过夜。准备四只装有50ml含200μg/ml carvenicilin的LB液体培养基的500ml烧瓶，从培养基上挑单一菌落，分别悬浮于各烧瓶中。在37℃振荡培养(140rpm)，直至A600＝0.6。将其中的250μl作为诱导前蛋白质样品，用于确认融合蛋白的表达。之后添加IPTG，使终浓度为1mM，诱导蛋白质表达，再在37℃振荡培养3小时(140rpm)。在冰上冷却5分钟，然后将培养液离心(5,000rpm、10分钟)。除去上清，将沉淀再悬浮于5ml大肠杆菌悬浮溶液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM EDTA]，将其中的100μl作为诱导后蛋白质样品，用于确认对融合蛋白的诱导表达。将培养液再次离心(5,000rpm、10分钟)，除去上清，将大肠杆菌的沉淀用于确认融合蛋白的可溶性。
对诱导融合蛋白表达的确认和对可溶性的确认如下进行。将如上取样的诱导前和诱导后蛋白质样品离心(5,000rpm、30秒)，除去上清，将沉淀再悬浮于100μl大肠杆菌悬浮溶液。由各悬浮液各取样10μl，进行SDS-PAGE、Western印迹分析。SDS-PAGE和Western印迹分析按照14.SDS-PAGE和Western印迹分析项的内容进行。确认诱导表达后，将诱导融合蛋白表达的大肠杆菌的沉淀充分悬浮于预先冰冷却的5ml结合缓冲液[5mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM Tris-HCl(pH7.9)]。将悬浮液移入透明的离心管中，一边将离心管冰冷却一边用超声波破碎仪破碎大肠杆菌。将菌体悬浮液离心(12,000rpm、10分钟)，将上清作为可溶解组分。向沉淀中加入5ml含尿素的结合缓冲液(将6M尿素加入结合缓冲液所得)，再悬浮，然后将悬浮液离心(12,000rpm、10分钟)，将上清作为尿素组分。分别从可溶解组分、尿素组分取样10μl，进行SDS-PAGE、Western印迹分析。SDS-PAGE和Western印迹分析按照14.SDS-PAGE和Western印迹分析项的内容进行。
在尿素组分中确认有融合蛋白，因此逐步去除尿素，并且再生所生成的蛋白质的结构。蛋白质的再生操作如下进行。将尿素组分转移至透析管，在4℃用200ml 4M尿素透析液[4M尿素、10mM Tris-HCl(pH7.0)、5mM DTT]透析1小时。将透析液换为200ml 2M尿素透析液[4M尿素透析液中尿素浓度改为2M]，在4℃透析1小时。再将透析液换为200ml无尿素透析液[4M尿素透析液中除掉尿素所得]，在4℃透析1小时。再次将透析液换为200ml无尿素透析液[4M尿素透析液中除掉尿素所得]，在4℃透析过夜。将该溶液移入Eppendorf管中，离心(15,000rpm、10分钟)，然后将上清移入新的管中。将该组分作为再生组分，作为用于制备抗体的抗原。通过以上的操作，得到了4ml 8mg/ml的融合蛋白。
12.抗PVS抗体的制备将小鼠(BALB/c、雌性、4周龄)饲养5天，将含有100μg在大肠杆菌中表达的融合蛋白的溶液和完全弗氏佐剂(DIFCO)等量混合，将100μl所得乳液进行腹膜注射。1周后，将100μg融合蛋白和不完全弗氏佐剂(DIFCO)等量混合，将100μl所得乳液进行腹膜注射。10天后切取小鼠的尾部采血，用Western印迹分析法研究是否产生抗HMGR抗体。确认发生了抗原抗体反应，因此再将100μg融合蛋白和不完全弗氏佐剂(DIFCO)等量混合，将100μl所得乳液进行腹膜注射。一周后采血，在4℃静置过夜，沉淀出血凝块。将该血液离心(10,000rpm、15分钟)，将上清作为抗血清，分成小份注入Eppendorf管中，在-80℃保存。
13.蛋白质定量样品的蛋白质浓度测定使用根据Bradford(1976)方法制成的蛋白质定量试剂盒(BIO-RAD)进行。校正曲线使用BSA制作。
14.SDS-PAGE和Western印迹分析蛋白质样品的SDS-PAGE按照Laemmli(1970)的方法进行。将10μl样品与10μl样品缓冲液[含2％SDS、10％巯基乙醇、0.002％BPB、20％甘油的50mM Tris-HCl(pH8.5)]混合，煮沸5分钟后冰冷却，用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
Western印迹分析按照Towbin等(1979)的方法(参照文献55)进行。将SDS-PAGE后的凝胶、滤纸、硝基纤维素膜(PROTPRAN，Schleicher和Schuell)分别在转印用缓冲液(0.1M Tris、0.192M甘氨酸、20％甲醇、0.1％SDS)中浸泡30分钟，然后置于半干印迹仪(ATTO)的载物台上，用2mA/cm2的恒定电流通电60分钟，将凝胶中的蛋白质转印到硝基纤维素膜上。将该硝基纤维素膜在含有5％脱脂乳的TBS-T[含137mM氯化钠、0.1％吐温20的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)]中振荡过夜，进行封闭。将该膜在TBS-T中洗涤15分钟一次；再洗涤两次，每次洗涤5分钟，然后在含有作为第一抗体的抗马铃薯PVS抗体(稀释2,000倍)的TBS-T中振荡1小时。再将膜在TBS-T中洗涤，然后在含有作为第二抗体的抗小鼠Ig抗体(Amersham)的TBS-T中振荡30分钟。将膜在TBS-T中洗涤，然后用ECL检测试剂盒(Amersham)在Hyper Film(Amersham)上进行信号的检测。
15.探针的制备以掺入了马铃薯的PVS1-4cDNA的质粒作为模板，使用图23所示的引物，通过PCR对各基因的碱基序列进行特异性扩增。使用2ng掺入TaKaRa TaqTM(宝酒造)和插入片段DNA的质粒，在DNA热循环仪PJ 2000(Perkin Elmer Cetus)上，以94℃-1分钟(热变性)、53℃-45秒(退火)、72℃-2分钟(DNA延伸反应)为一个循环，进行25个循环的反应。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确认扩增的DNA片段的大小。使用QIAquickGel提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶中纯化DNA片段。
16.马铃薯基因组文库的筛选基因组文库使用已有的马铃薯基因组文库(马铃薯品种Desiree，Clontech)。
根据噬菌斑杂交法筛选噬菌体克隆(参照文献37)。将每个培养皿调节为30,000噬菌斑，将该噬菌体溶液与200μl宿主大肠杆菌XL1-BlueMRA(P2)菌株(10mM硫酸镁、A600＝2)混合，在37℃静置20分钟，然后将其与3ml NZYM顶层琼脂糖(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸镁、0.5％氯化钠、0.6％琼脂糖)混合，重叠接种于NZYM琼脂培养基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸镁、0.5％氯化钠、1.5％琼脂粉末)上。在37℃下培养至噬菌斑直径约0.5mm，然后在4℃静置1小时。使培养基上的噬菌斑吸附在Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上，用变性溶液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)处理7分钟，用中和溶液[1.5M氯化钠、0.5mM Tris-HCl(pH7.2)、1mM EDTA]处理3分钟，然后用2×SSPE洗涤。再通过0.4M氢氧化钠将DNA固定在膜上，然后用5×SSPE洗涤(2次)。从合计6.0×105个克隆中筛选目标克隆。
初次筛选后，使用PVS1-4各成员特异性引物进行PCR，选择具有推定大小的条带的PVS1、PVS2和PVS4，再进行二次、三次筛选。
探针的制备、杂交、洗涤和放射自显影与18.中所述的Southern杂交的情形相同。
17.噬菌体DNA的分离·纯化噬菌体DNA的分离·纯化根据液体培养法(参照文献23)和聚乙二醇(PEG)沉淀法(参照文献37)，按照以下的方法进行。从琼脂中回收目标噬菌斑，转移至含有100μl SM溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1M氯化钠、7mM硫酸镁、0.01％明胶]和1μl氯仿的1.5ml管中，在4℃静置过夜，然后充分悬浮。用200ml烧瓶将宿主大肠杆菌[XL1-BlueMRA(P2)菌株]在80ml NZYM(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸镁、0.5％氯化钠)中、在30℃下振荡培养过夜。通过离心(8,000rpm、3分钟、4℃)回收沉淀的宿主大肠杆菌，然后悬浮于10mM硫酸镁溶液中，调整为A600＝2。将这样制备的500μl宿主大肠杆菌悬浮液与50μl噬菌体悬浮液混合，在37℃下静置20分钟，然后用50ml NZYM在37℃下振荡培养，确认溶菌。加入2.9g氯化钠和0.4ml氯仿，再振荡10分钟。通过离心(10,000rpm、10分钟、4℃)回收上清，与相当于上清的五分之一量的50％PEG 6000混合，然后在冰中静置1小时。通过离心(12,000rpm、20分钟、4℃)回收沉淀，悬浮于400μl Tris-Mg-NaCl[10mMTris-HCl(pH7.5)、49.6mM氯化钠、4.9mM氯化镁]。向该溶液中添加4μl 10mg/ml RNase A(Sigma)和4μl 10mg/ml DNase I(Sigma)，在37℃下处理1小时，然后氯仿提取三次。添加与回收的上层等量的2×STE[80mM Tris-HCl(pH7.5)、2％SDS、0.5M EDTA]和五分之一量的10mg/ml蛋白酶K，在65℃处理10分钟，然后用相同容量的Tris饱和苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v/v)、氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)依次提取。向回收的上层中加入2倍量的冷乙醇，在-20℃下静置30分钟，然后通过离心(12,000rpm、10分钟、4℃)回收沉淀。将沉淀用70％乙醇洗涤，然后减压干燥，溶解于100μl水中。
18.Southern印迹分析用选定的限制酶(宝酒造)消化目标克隆的总DNA，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分级(参照文献37)。通过碱印迹法(参照文献36)将分级的DNA片段转印到Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上。
32P标记DNA探针根据随机引物法(Feinberg和Vogelstein，1983)，使用[α-32P]dCTP(ICN Biochemicals)和Megaprime DNA Labellingsystems(Amersham)制备。
将吸附有DNA的尼龙膜在42℃的预杂交溶液[5×Denhardt溶液(参照文献37)、5×SSPE(参照文献37)、0.5％SDS、100μg/ml热变性鲑精DNA(Pharmacia)]中放置1小时或以上，然后添加32P标记DNA探针，在42℃下杂交16小时或以上。将该膜在含有0.1％SDS的2×SSPE中洗涤10分钟(2次)，再在含有0.1％SDS的1×SSPE中洗涤10分钟(1次)。洗涤全部在室温下进行。使用X射线胶片OMAT-AR(Kodak)和增感纸Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下进行放射自显影。
19.质粒的制备为了确定碱基序列，使用pBluescript KS+(Stratagene)对目标DNA片段进行亚克隆。
用选定的限制酶(宝酒造)消化目标克隆的总DNA，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分级(参照文献37)，用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)纯化含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶。经限制酶消化的载体通过碱性磷酸酶E.coli C75(宝酒造)进行脱磷酸处理(37℃、1小时)后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v/v)、氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)依次提取。向回收的上层中加入2倍量的冷乙醇和二十分之一量的3M NaCl，在-20℃下静置30分钟，然后通过离心(12,000rpm、10分钟、4℃)回收沉淀。将沉淀用70％乙醇洗涤，然后减压干燥，溶解于20μl TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]。将如上制备的载体及其插入片段调整为载体插入片段的摩尔比为1∶1，用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)连接，用连接的质粒DNA转化E.coli JM109感受态细胞(宝酒造)，然后接种于LB/Amp/X-gal/IPTG琼脂培养基上(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、0.1mg/ml氨苄青霉素溶液、0.004％X-gal溶液、0.5mM IPTG溶液、1.5％琼脂粉末)，在37℃下培养过夜。将进行了蓝白菌落筛选的单一菌落在LB/Amp液体培养基(2ml LB、0.1mg/ml氨苄青霉素)中培养过夜，分离质粒DNA。使用Flexiprep Kit(AmershamPharmacia Biotech)进行质粒DNA的提取和纯化。
20.DNA碱基序列的确定和数据库分析碱基序列的确定使用基于脱氧终止法(参照文献38)的PRISM DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(AppliedBiosystem)进行。使用ABI 373S DNA测序仪·DNA序列自动分析装置(Applied Biosystem)进行反应产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳和碱基序列的读取。使用日本国立遗传学研究所日本DNA数据库(DDBJ)的大型计算机BLAST程序(参照文献1)对碱基序列的连接、阅读框的氨基酸序列、以及与已知基因的同源性进行分析。氨基酸序列的比对采用CLUSTALw程序(参照文献43)。
21.使用马铃薯块茎原生质体进行的瞬时表达测定使用马铃薯块茎原生质体进行的瞬时表达测定参考Hashimoto等。(1992)的方法(参照文献18)如下进行。在800μl含有1×106个来自马铃薯培养细胞的原生质体的溶液(0.5M甘露糖醇、0.1mM MgSO4、pH7.0)中加入25μg转基因，通过移液管轻轻地吹吸混合，在冰上静置10分钟。将该溶液移至预先冷却的杯中，使用基因导入装置CUY 21(TokiwaScience)，在恒定电流条件下实施电穿孔(6v，50pon，75poff，4次)。将溶液移至离心管。在冰上静置10分钟，然后去除上清，加入900μl培养液，移至12孔培养板，在20℃的暗处静置1小时。之后向经电穿孔导入了含有PVS3推定启动子区的载体的原生质体中加入100μl灭菌水或者100μl 1mg/ml HWC，静置12小时。阳性对照为经电穿孔导入了含有CaMV 35S启动子区的载体的原生质体，将其静置12小时。除去上清，用1×PBS洗涤原生质体，然后用双萤光素酶报道检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)测定萤光素酶活性。
22.转基因植物的制备和GUS染色转基因植物的制备和GUS染色按照Jefferson(1987)的方法(参照文献19)进行。转基因植物的制备使用无菌培养的MayQueen的茎。使转化载体pBI121(Clonetech)的CaMV35S启动子缺失，使翻译起始密码子上游2648bp的PVS3推定启动子区经由BamHI与GUS基因的上游连接，使得GUS可以框内翻译(图11)。通过电穿孔法将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(Clonetech)。将切取的茎在根癌农杆菌的培养液中浸泡2分钟，使其感染，于20℃下、在培养皿中的3C5ZR培养基[30g蔗糖、2g吉兰糖胶、100ml MS矿物质(10×)、5mlFe-EDTA、100ml肌醇、2.4ml 3C5ZR维生素(1ml的1mg/ml盐酸硫胺素，0.5ml的1mg/ml烟酸，0.5ml的1mg/ml盐酸维生素B6、0.4ml的1mg/ml天冬氨酸)、5.3ml IAA(0.1mg/ml)、17.5ml玉米素核苷(0.1mg/ml)，pH5.9，每1000ml]中静置3天。然后移至含有卡那霉素(100μg/ml)和氨噻肟头孢霉素(300μg/ml)的3C5ZR培养基上。该步骤每周重复一次，生出苗后，移至S1再生培养基(15g蔗糖、3g吉兰糖胶、100mlS1矿物质(10×)、5ml Fe-EDTA、2.0ml V2维生素、pH5.7，每1000ml)上，确认根的再生。
GUS染色时，将植物组织在GUS染色液中[100μl X-Gluc(50mg/mlDMF中)、1ml 500mM磷酸缓冲液(pH7.0)、2ml100％甲醇、7.9ml 0.5％triton X-100，每10ml]减压渗透，在37℃的黑暗条件下染色一昼夜。之后，将染色组织在乙酸∶乙醇∶甘油(1∶3∶1)的脱色液中煮沸脱色并观察。显微镜观察接种的马铃薯晚疫病菌时，将脱色的组织在乳酚溶液中(10ml乳酸、10g苯酚、10ml甘油、10ml水、40ml乙醇)煮沸，反复进行。之后在浸有水合氯醛(2.5g/ml)的滤纸上、在4℃的黑暗条件下脱色2天并观察(参照文献49)。
23.马铃薯叶组织中经由根癌农杆菌的瞬时表达测定经由根癌农杆菌的瞬时表达测定按照Chang等人.(2002)的方法(参照文献7)进行。在通过电穿孔导入了含有Cf-9/Avr9或StMEKDD(SEQ IDNO.7)的双元载体的根癌农杆菌LBA4404中加入利福平(50μg/ml)和选定抗生物质，进行培养。将根癌农杆菌离心(3,000rpm、15分钟)收集菌体，在导入缓冲液[1×10x Murashige-Skoog盐、1/10x维生素B5、2％蔗糖、1％葡萄糖、150μM乙酰丁香酮、20mM MES pH5.4]中悬浮，将浓度调解为OD600＝0.1。使用1ml的注射筒，由叶的背面注入悬浮液，2天后GUS染色。
<实施例1>接种晚疫病菌的马铃薯块茎组织中PVS mRNA的蓄积情况对马铃薯块茎进行亲和性、非亲和性小种接种以及水处理，然后在不同时间由3片马铃薯块茎提取总RNA，使用PVS1 cDNA进行Nortern印迹分析。分析结果如图2所示。在亲和性菌处理区、非亲和性菌处理区都见到PVS mRNA的蓄积。
<实施例2>接种晚疫病菌的马铃薯块茎组织中PVSl-4各成员特异性RT-PCR为了研究马铃薯块茎组织中PVS1-4各成员是否表达，从进行了亲和性、非亲和性小种接种以及水处理后经过3、6小时后冷冻的马铃薯块茎中提取总RNA，使用PVS1-4各成员特异性引物(SEQ ID NO.9、10、13、14、15、16、17和18)进行RT-PCR。亲和性菌处理区、非亲和性菌处理区中都检出了相应于PVS1-4的预计大小为469bp、132bp、326bp和469bp的条带(图3)。
<实施例3>接种非亲和性小种和亲和性小种的马铃薯块茎组织中的PVS蛋白的Western印迹分析为了研究PVS mRNA的蓄积情况是否反映到实际的蛋白质合成中，制备了抗马铃薯PVS抗体，进行Western印迹分析。为了获得用于制备抗体的抗原，以推定氨基酸序列为基础，在大肠杆菌内表达。将通过PCR制备的PVS1 cDNA翻译区插入表达载体，作为与硫氧还蛋白的融合蛋白在大肠杆菌内表达。对诱导表达前后的大肠杆菌总蛋白质进行SDS-PAGE，用CBB溶液染色凝胶。尿素组分中检测出约83kD的条带，因此由该组分透析除去尿素，作为用于制备抗体的抗原。
使用制备的抗体研究抗体的效价，稀释1,000倍使用时，可以检测10ng的抗原。由此判断该抗体具有足够的效价以进行之后的Western印迹分析，因此进行24小时陈化后，从马铃薯块茎片中制备可溶性组分在接种水处理、非亲和性小种或亲和性小种24小时内，使用抗马铃薯PVS抗体进行Western印迹分析(图4)。6小时以后，在非亲和性和亲和性小种的接种区都可见PVS蛋白的蓄积。而在水处理区则未见PVS蛋白质的蓄积。这些结果支持了图2中PVS mRNA的蓄积在接种6-9小时出现峰的结果。
<实施例4>接种晚疫病菌的马铃薯叶组织中PVS1-4各成员特异性RT-PCR为了研究马铃薯叶组织中PVS1-4的各成员是否表达，在进行了亲和性、非亲和性小种接种以及水处理、创伤处理后12小时内不同的时间，从3片马铃薯叶中提取总RNA，使用PVS1-4各成员特异性引物(SEQ IDNO.11、12、13、14、15、16、19和20)进行RT-PCR。然后使用PVS1-4各成员特异性cDNA探针进行Southern印迹分析。亲和性菌接种区、非亲和性菌接种区中，只检测出显示显著的m RNA蓄积的一条条带，它是代表PVS3的预计大小为326bp的条带(图5)。使用作为阳性对照的来自块茎组织的RNA时，检测出分别相应于PVS1-4的预计大小为176bp、132bp、326bp和131bp的条带(图5)。
<实施例5>马铃薯基因组文库的筛选考虑到单倍体马铃薯基因组大小为1.6-1.8×109bp(Arumuganathan和Earle，1991)，马铃薯基因组文库的大小平均值是每个噬菌斑为1.5×104bp，并且马铃薯为四倍体植物，为了筛选马铃薯的全部染色体，必须至少筛选5.2×105个噬菌斑。因此，以PVS1 cDNA的全长为探针，筛选了6.0×105个噬菌斑。初次筛选的结果确认了87个克隆。为了区分PVS1-4，同时获得推定启动子区，从该87个克隆中，分别利用PVS1-4各个成员特异性位点构建引物，对其PCR产物进行电泳。对PVS1、PVS2、PVS3和PVS4分别选择3个克隆，进行二次、三次筛选。
将筛选所得克隆分别用EcoRI、HindIII或XhoI单独进行消化，通过所述引物筛选得到PCR产物为探针进行Southern印迹杂交。结果检测出与该探针杂交的条带。由于已确认获得了目标克隆，因此将杂交的、经EcoRI、HindIII消化的DNA片段亚克隆到pBluescript KS+载体，确定碱基序列。
<实施例6>DNA碱基序列的确定和数据库分析对亚克隆的PVS1、PVS3和PVS4的DNA片段进行全碱基序列的确定(图6、7、8、9)。图6和图7表示PVS3的启动子区(SEQ ID NO.1)和编码区(SEQ ID NO.21)。为了对PVS3cDNA和PVS3的基因组结构进行研究，将已经分离的PVS3 cDNA(参照文献53)和本实施例所得的PVS3基因组DNA序列进行了比较。可知对于PVS3，除了3’-非翻译区，全部的碱基序列以及推定的氨基酸序列均一致，由六个内含子分隔(图8)。而与PVS3不同，PVS1和PVS4两者均由5个内含子分隔，(图9)。已知马铃薯植物的栽培品种是四倍体，在基因组中存在多个同源基因(文献56)。本实施例中得到的PVS3基因组克隆只有3’-非翻译区与PVS3cDNA不同，因此可以认为这是编码PVS3亚家族之一的基因。
Back和Chappel(1996)报道了倍半萜环化酶中的功能分化(参照文献4)。对烟草(TEAS)、辣椒(PEAS)的倍半萜环化酶——5-表-马兜铃碱合酶，以及天仙子(HVS)、马铃薯(PVS)的vetispiradiene合酶的推定氨基酸序列进行了比较。得知都为VS的HVS和PVS3或PVS4之间，在vetipiradiene专一性域中，可见90％或以上的同一性(图9)。而PVS3和PEAS之间的同一性则为80％或以下。存在底物结合位点的马兜铃碱专一性域中，PVS与TEAS，或者PVS与PEAS之间，同一性为78％-89％，而PVS与HVS之间可见98％或以上的高的同一性。在叶组织中表达的倍半萜环化酶含有被六个内含子分隔的七个外显子；而在马铃薯块茎组织中表达的PVS1和PVS4含有被五个内含子分隔的六个外显子(图9)。
<实施例7>通过使用原生质体的瞬时表达测定，研究PVS3启动子对HWC的应答性将PVS3推定启动子区连接到萤光素酶的上游，制备pGL3载体，通过电穿孔将其导入原生质体，研究对于HWC的应答性(图10)。与水处理区比较，HWC处理区可见显著高的萤光素酶活性，表明本实验中使用的翻译起始密码子上游的2,648bp的区产生引发物应答。
<实施例8>转基因植物中PVS3基因的表达情况为了详细地研究PVS3的表达情况，将PVS3推定启动子区连接到GUS基因的上游，制备双元载体(图11)，将该双元载体导入对马铃薯晚疫病菌没有真正抗性基因的MayQeen，制备转化体。为了研究PVS3基因对于创伤的应答，将转基因马铃薯叶组织的一部分切除，在不同时间进行GUS染色(图12)。结果切除部位在48小时后仍未染色。由此显示本启动子不对创伤产生应答。
为研究对晚疫病菌的应答，接种晚疫病菌亲和性小种并进行显微镜观察，6小时以内可在入侵细胞内见到GUS染色(图13)。接种48小时后，在整个接种叶上可见强烈的表达。这显示本启动子应答晚疫病菌亲和性小种的感染。
为了研究是否存在本启动子可恒定表达的器官，将整株转基因马铃薯植物进行GUS染色(图14)。除了作为GUS染色的阳性对照使用的晚疫病菌接种叶组织，在生长点或根等部位未见染色。该结果显示本启动子为病原菌特异性应答。
为了研究本启动子是否对任何病害信号都应答，将叶组织用各种引发物处理并进行GUS染色(图15、16、17、18)。用马铃薯晚疫病菌膜的构成脂肪酸——花生四烯酸进行处理时，24小时后可见GUS染色(图15)。而对于活性氧的一种的过氧化氢处理或生成过氧化氢的葡萄糖·葡糖氧化酶处理、或者与整株获得性抗性有关的水杨酸等任何的处理都未见GUS染色(图16、17、18)。
番茄品种的抗性基因产物Cf-9对番茄叶霉病菌(番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum))的专一性引发物Avr9应答，则信息转导机制起作用，诱导过敏性反应，这是众所周知的(参照文献41)。经由农杆菌，Cf-9/Avr9在叶组织中瞬时表达，此时可以GUS染色(图19)。并且，使组成型活性突变酶StMEKDD(SEQ ID NO.7、8)同样表达，结果可见GUS活性(图19)。其中所述StMEKDD用于使已知存在于上述抗性基因的下游、控制各种防御反应的水杨酸诱导的蛋白激酶(SIPK)和创伤诱导的蛋白激酶(WIPK)磷酸化并激活。而在接种了作为对照使用的农杆菌的叶组织中未见GUS染色，其中所述对照农杆菌含不具插入片段的双元载体。
在日齐素合成中起重要作用的HMG-CoA还原酶(HMGR)基因形成多基因家族(图1)。已知HMG1应答创伤，作用于类固醇配糖生物碱的生成；而HMG2和HMG3受病害信号诱导，作用于日齐素的合成(参照文献9)。有报道指出马铃薯植物的PVS基因也同样形成多基因家族，存在PVS1-4的成员(参照文献53)。本研究中，为了研究马铃薯块茎组织和叶组织中PVS1-4各成员的表达情况，使用各成员特异性引物进行了RT-PCR。晚疫病菌的亲和性和非亲和性小种接种的马铃薯块茎片中提取总RNA，以此为模板进行RT-PCR(图3)。接种任意小种都检测出相应于PVS1-4各成员的预计大小的条带。这些结果显示至少在块茎组织中，PVS的成员对于应答刺激的代谢变化可能没有不同的作用。
为了研究PVS mRNA的蓄积情况是否反映到马铃薯块茎组织的PVS蛋白质合成中，制备了抗马铃薯PVS抗体，进行Western印迹分析(图4)。通过接种非亲和性小种和亲和性小种，在接种后6小时至24小时期间可见PVS蛋白的蓄积。有报道使用由马铃薯块茎组织提取的总RNA进行Nortern印迹分析，结果在非亲和性小种和亲和性小种接种区，PVSmRNA在接种后6-9小时出现瞬时蓄积的峰(图2、文献53)。考虑到PVSmRNA的蓄积情况，可以认为PVS蛋白质的半衰期长。另外，有报道接种了非亲和性小种和亲和性小种的马铃薯块茎组织中制备可溶性组分中的PVS酶活性均有所增加(参照文献54)。但也有报道只有接种非亲和性小种，植物抗毒素才蓄积，上述报告与该报道矛盾(参照文献40)。可以认为马铃薯的植物抗毒素的生物合成中，由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)生物合成3-羟-3-甲戊醛酸的酶HMGR和由法尼基二磷酸生物合成vetispiradiene的PVS两种蛋白质发挥着重要的作用(参照文献29、54和9)(图1)。有报道指出HMGR活性只在非亲和性小种接种区显著增加，在亲和性小种接种区随时间减少(参照文献52)。考虑到HMGR的活性情况，可认为马铃薯品种-晚疫病菌小种之间的特异性植物抗毒素的合成控制的关键在于3-羟-3-甲戊醛酸的供应。为了验证该可能性，有必要对接种了亲和性小种的块茎组织，通过由外部供给法尼基二磷酸，研究植物抗毒素lubimin和日齐素是否蓄积。
马铃薯晚疫病菌的实际第一感染组织是叶组织。本研究中，为了研究接种晚疫病菌后PVS1-4各成员是否表达，在接种亲和性、非亲和性小种以及水处理后，在不同的时间从叶组织中提取总RNA，以此为模板进行了RT-PCR(图5)。在亲和性、非亲和性小种接种区，都可见只有PVS3被显著诱导。已知通常在马铃薯叶组织中日齐素不蓄积(参照文献34)。但是，有观察例显示日齐素在叶组织中也瞬时合成(参照文献26)。叶组织中，日齐素在防御应答中的作用至今尚未明确，但接种亲和性小种后PVS3被诱导，由此可以利用本启动子制成抗病害作物。因此，为了获得PVS3启动子序列，分离了基因组克隆。筛选得到了PVS1、PVS3和PVS4(图6、7、8、9)。将本次分离的PVS3基因组克隆与已经分离出的PVS3cDNA相比较，全部与推定氨基酸序列一致。外显子区的限制酶位点一致，各自对应(图8)。
烟草和辣椒的植物抗毒素——辣椒二醇、以及天仙子和马铃薯所生成的日齐素两者均通过类似的合成途径合成(参照文献4和29)(图1)。与前者的合成有关的倍半萜环化酶5-表-马兜铃碱合酶(EAS)，烟草(TEAS)和辣椒(PEAS)的EAS在氨基酸水平上极其类似(参照文献35)。Back和Chappell使用TEAS和天仙子的HVS cDNA构建了各种嵌合基因，由嵌合基因在大肠杆菌内合成了蛋白质(参照文献4)。在菌体可溶组分中加入EAS和AS的底物法尼基二磷酸，通过对5-表-马兜铃碱或vetispiradiene的生成比例进行定量，即可推定控制两种酶的活性的区。根据他们的研究报告，对通过各外显子定义的活性域的推定氨基酸序列进行了比较，vetispiradiene专一性域中，天仙子的HVS与PVS4或PVS3之间可见90％或以上的同一性。存在底物结合位点的马兜铃碱专一性域中，PVS与TEAS或PEAS之间的同一性为78％-89％，而PVS与HVS之间可见98％或以上的高的同一性(图9)。该结果支持了Back和Chappell提出的假说(参照文献4)。PVS1和PVS4含有被五个内含子分隔的六个外显子，而在叶组织中表达的PVS3或其它的倍半萜环化酶含有被六个内含子分隔的七个外显子(图9)。宫田(1984)推断在线粒体基因组高效复制中不具有功能的内含子在进化过程中被除去，DNA缩短。根据该假说，在块茎中表达的PVS1和PVS4的第5内含子可能在进化过程中被除去，缩短。
如果利用启动子制备抗病害植物，则必须进行PVS3启动子区的分析、鉴定。本实施例中，使GUS基因连接到PVS3的推定启动子下游，制备转基因马铃薯植物，由此对本启动子的应答性进行了详细的研究。值得关注的是本启动子不仅不对创伤应答(图12)，在生长点或根等部位也未见染色(图14)。同样在烟草植物的倍半萜环化酶TEAS的启动子下游连接GUS，制备转基因烟草植物，其表达情况已有报道(参照文献51)。但他们报告了对创伤的低水平应答，并且在根或茎中可见GUS活性。根据该报告，可以认为马铃薯叶组织中的PVS3启动子与烟草叶组织中的TEAS启动子的应答方式不同。烟草叶中，对病原菌的攻击或对引发物处理应答，植物抗毒素辣椒二醇高浓度蓄积。而马铃薯叶组织中未见日齐素的蓄积，PVS3 mRNA蓄积只是可由RT-PCR检测出这样的低水平程度(图5)。考虑到该结果，PVS3启动子的特异应答性可能是缘于低的表达水平。
最近，有报道指出HMGR基因表达受促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的一种——SIPK的控制(参照文献33)。本研究中，使组成型活性突变酶StMEKDD(参照文献50)同样地表达，结果可见GUS活性(图19)。其中所述StMEKDD使SIPK和WIPK磷酸化并被激活。并且经由农杆菌，使番茄叶霉病菌的特异性引发物Avr9和番茄品种的抗性基因产物Cf-9在叶组织中瞬时表达，此时可以GUS染色(图19)。Romeis等人报道用Avr9处理转化了Cf-9的烟草植物和培养细胞，则SIPK和WIPK被激活(参照文献35)。可由这些结果推断PVS3启动子也与HMGR基因同样，受SIPK控制。用HWC或花生四烯酸处理马铃薯块茎组织，则相当于SIPK的MAP激酶被激活，这也支持了上述推测(参照文献20)。该推断的信息转导途径如图20所示。
MAPK级联是植物信号转导途径中重要的控制因子之一，近年受到人们的关注(文献65)。其中，已经清楚SIPK和WIPK在植物的病害抗性表达中发挥着重要的作用(文献57)。已知位于MAPK级联的上游的MAPKKK通过使MAPKK磷酸化并激活，并且MAPKK使MAPK磷酸化，引发各种防御反应。最近，使烟草的一种本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)中的MAPKK——StMEK1的组成型活性形式突变酶StMEK1DD过量表达，则显示SIPK和WIPK被激活，烟草植物的倍半萜环化酶——5-表-马兜铃碱合酶(TEAS)被诱导(文献64)。可以容易地预想到与烟草植物同样，马铃薯的PVS基因调控也与MAPK级联相关。以下的实施例中，采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法，对其可能性进行了探讨。近年来，VIGS作为在分析植物基因功能方面有效的基因敲除方法而受到人们的关注(文献59)。VIGS原本是针对病毒的生物体防御系统，是与病毒内的基因同源性高的寄主基因的转录产物被特异性分解的现象。通常，与导入病毒内的植物基因片段显示80％或以上的同源性的mRNA被分解，不仅是1个基因，对敲除多基因家族的基因也有效。该方法与制备转化体或突变体相比简便且迅速。其中，作为回顾性遗传学功能分析方法，目前对于马铃薯X病毒(PVX)和本塞姆氏烟草体系已经积累了很多的研究成果(文献67、文献70)。这里，由VIGS敲除SIPK或WIPK，通过农杆菌将上述的PVS3GUS瞬时导入叶组织，以此研究PVS3启动子活性。
以下的实施例9-12中所使用的生物学材料、试剂、实验方法等如下。没有特别说明，材料等与上述实施例中所使用的相同。
1.供试植物使用由日本烟草株式会社提供的本塞姆氏烟草作为供试植物。将本塞姆氏烟草种子播种于装有Kureha土壤(吴羽化学)的聚乙烯花盆，在25℃的恒温室中、24小时照明条件下使其生长。使用播种第30-35天时植物体的第6-8片叶进行经由农杆菌的瞬时表达测定。
2.INF1的制备对本塞姆氏烟草进行处理的Infestin(INF1)使用在大肠杆菌(大肠杆菌菌株pBF53)中表达的融合蛋白，其中所述大肠杆菌中导入了含有inf1基因的FLAG-ATS载体(FLAG-INF1)(文献62)。融合蛋白的制备如下进行。
将大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中、在37℃振荡(140rpm)培养过夜。将大肠杆菌培养液加入到100倍量，即含有50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃振荡(140rpm)培养，直至OD600＝0.6。添加IPTG，使终浓度为1mM，诱导蛋白质的表达，再在37℃振荡培养3小时(140rpm)，然后将培养液离心(5,000×g、10分钟)。上清用过滤器过滤，转移至透析管(排阻限分子量为3,500)，在4℃用灭菌蒸馏水透析24小时。将以上操作得到的组分调节为蛋白质浓度10mg/ml，制成FLAG-INF1溶液。对植物进行处理时，使用用蒸馏水稀释为3倍的INF1溶液。
3.插入有连接GUS基因的PVS3启动子的双元载体的构建MUG测定所使用的表达载体如下构建。以PVS3基因组克隆为模板，使用附加有限制酶切位点(EcoRI或ClaI)的引物(图24)，通过PCR扩增含有推定启动子区和PVS3基因编码区起始位点的碱基序列。PCR如下进行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火温度，根据所附说明进行反应。将该PCR产物用EcoRI和ClaI消化，通过1％琼脂糖凝胶电泳分级，然后用QIAquick Gel提取试剂盒(qiagen)纯化目标DNA片段，作为插入片段使用。载体使用含有GUS基因的pGreen 0229(Hellens等。2000)，其中所述GUS基因含有内含子。与插入片段同样地用EcoRI和ClaI消化，通过1％琼脂糖凝胶电泳分级。用QIAquick Gel提取试剂盒纯化目标DNA片段，做为载体使用。将如上所述制备的载体和插入片段调整为载体插入片段摩尔比为1∶3，用DNA连接试剂盒ver.2(Takara)连接，用连接好的质粒DNA转化E.coli JM109感受态细胞(Takara)，然后接种于LB琼脂培养基上[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、50μg/ml卡那霉素、1％琼脂糖]，在37℃下培养过夜。挑取单一菌落在含有卡那霉素溶液(50μg/ml)的2ml LB液体培养基[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、1％琼脂糖]上、在37℃下培养过夜。回收质粒DNA。图25表示插入了PVS3启动子的双元载体的图谱。
4.用于在本塞姆氏烟草叶中瞬时表达测定的缺失克隆的构建以上述3.中制备的GUS表达载体为模板，使用由目标缺失点开始的、附加有限制酶切位点(EcoRI或ClaI)的引物(图24)，通过PCR扩增含有推定启动子区和PVS3基因编码区起始位点的碱基序列。PCR如下进行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火温度，根据所附说明进行反应。双元载体的制备按照上述3.的操作进行，按照6.所述的方法导入农杆菌。确认所得缺失克隆的碱基序列没有错误。
5.StMEK1DD表达载体的构建本塞姆氏烟草叶MUG测定所使用的表达载体如下构建。使用附加有限制酶切位点(ApaI或SpeI)的引物(5’-TTGGGCCCATGCGACCTCTTCAACCACC-3’SEQ ID NO.36，5’-GACTAGTACAAAAGAGTGTGGAATTAC-3’SEQ ID NO.37)，通过PCR扩增5’一侧含有非翻译区的StMEK1DD(文献64)的碱基序列。PCR反应如下进行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火温度，根据所附说明进行反应。将该PCR产物用ApaI和SpeI消化，通过1％琼脂糖凝胶电泳分级，然后用QIAquick Gel提取试剂盒(qiagen)纯化目标DNA片段，作为插入片段使用。载体使用由β-雌二醇诱导转基因的表达的pER8(文献74)，与插入片段同样地用ApaI和ApeI消化，通过1％琼脂糖凝胶电泳分级。用QIAquick Gel提取试剂盒纯化目标DNA片段，做为载体使用。以后按照上述3.的连接操作进行。
6.转化农杆菌将要导入的载体用TE调节为10ng/μl，用于转化农杆菌。将80μl农杆菌GV3101菌株的感受态细胞在冰上溶解，加入2μl载体溶液，用移液管混合，在冰上静置30分钟。将该溶液移入杯中，通过Micro PulserTM(BioRad)实施电穿孔(V＝1.44kV、T＝2.5kV/电阻、C＝all out、R＝R5 129)，进行转化。将溶液转移至1.5ml Eppendorf管中，加入1ml SOC培养基[2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、0.05％NaCl、10mM MgCl2、10mMMgSO4]，在室温下静置1小时。然后接种于LB琼脂培养基[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平、1％琼脂糖]，在28℃培养两天。回收单一菌落，用于下述7.的土壤杆菌浸润(Agroinfiltration)试验。
7.使用本塞姆氏烟草通过土壤杆菌浸润法转基因根据Thoma等人(2000)的方法(文献41)，如下进行土壤杆菌浸润试验。将导入有双元载体的农杆菌在含有规定抗生物质的LB液体培养基中、在28℃振荡培养2天。将2ml培养液悬浮于8ml含有抗生物质的LB液体培养基中，再在28℃振荡培养3小时。使用紫外可见光分析系统(DU系列600、Beckman)测定悬浮液中农杆菌的密度，测定600nm波长下的吸光度。将悬浮液在室温下离心(3,000×g、15分钟)，将沉淀再悬浮于含有150μM acetonitocilingon、10mM MgCl2的10mM MES(pH5.6)中，使OD600＝0.5。
将保有PVS:GUSint的农杆菌单独进行土壤杆菌浸润试验时，将OD600＝0.5的悬浮液注入叶中，一天后注入10μg/ml的INF1溶液，诱导PVS3启动子(图26)。另一方面，将用pER8载体对保有XVE:StMEK1DD或PVS:GUSint的农杆菌进行土壤杆菌浸润试验时，分别稀释为OD600＝0.005和OD600＝0.25，通过20μM的β-雌二醇诱导在G10-90启动子的下游连接的XVE(LexA、VP16、雌激素受体)系统，使StMEK1DD表达(文献74)。在对照区使用pER8载体代替XVE:StMEK1DD，注入20μM的β-雌二醇(图26)。
将悬浮液在室温(20℃)静置1小时，然后使用没有注射针的注射筒注入到本塞姆氏烟草叶的细胞间隙。注入后，将植物体在25℃、24小时照明的条件下静置，用于下述9.的MUG(4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖醛酸苷)测定。
8.本塞姆氏烟草中病毒诱导的基因沉默已知植物所感染的病毒的碱基序列包含与植物的基因同源的序列，则植物内发生基因沉默(病毒诱导的基因沉默；VIGS)(文献67)。本实施例中采用了基因沉默稳定发生的PVX和本塞姆氏烟草系。含有PVX的双元载体pGR106中插入有由SIPK翻译起始密码子开始的230bp的cDNA片段、由WIPK翻译起始密码子开始的178bp的cDNA片段、或者使SIPK和WIPK串联连接的cDNA片段，将由此得到的基因沉默载体导入农杆菌。按照上述7.的方法培养农杆菌，注入播种后生长3周的本塞姆氏烟草叶中，生长1个月，取上部叶用于试验(图27)。
9.MUG测定按照Gallagher(1992)的方法(文献60)，为了对GUS表达定量而进行MUG(4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖醛酸苷)测定。将3片注入了农杆菌的1平方厘米的本塞姆氏烟草叶在液氮中磨碎，然后加入200μl提取缓冲液[50mM NaHPO4(pH7.0)、10mM β-巯基乙醇、10mM EDTA、0.1％月桂酰肌氨酸钠、0.1％Triton X-100]，离心(12,000rpm、4℃、5分钟)回收上清。根据上述13.的蛋白质定量方法测定提取液的蛋白质浓度，将10μl提取液加入到90μl、37℃的荧光测定缓冲液中[提取缓冲液、2mMMUG]，将反应液制成100μl，在37℃静置1小时。将反应液加入到900μl的反应终止液(0.2M Na2CO3)中用于测定。使用荧光分光光度计RF-5300PC(Shimadzu)，用365nm的激发光，测定455nm的发射光谱。校正曲线使用4-MU(7-羟基-4-甲基香豆素)制作，测定值换算为4-MUnM/分钟·mg蛋白。为了从测定值中去掉内源GUS活性，，准备使酶热变性的样品，由此得到换算值的差，从而计算来自表达载体的GUS活性。
10.由本塞姆氏烟草叶中提取总RNA由本塞姆氏烟草叶中提取总RNA，可以依据SDS/苯酚法，按以下的方法进行。将1g本塞姆氏烟草叶在乳钵中边加入液氮边磨碎，将其加入到已装有5ml提取缓冲液(EB)[50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM氯化钠、5mM EDTA、5％SDS]、0.4ml PCI[苯酚/氯仿/异戊醇(50∶49∶1，v/v/v)、10μl巯基乙醇的50ml容量灭菌离心管中，剧烈混合1分钟，加入4.8ml PCI，轻缓搅拌。使用polytron匀浆器(HG30、日立)磨碎2分钟，然后离心(1,300×g、15分钟)。将水层(上层)移入新的50ml容量灭菌离心管中，加入6ml PCI，搅拌2分钟，然后再在常温下离心(1,300×g、15分钟)。向水层(上层)中加入1/40量的4M氯化钠和2倍量的乙醇，混合，在-20℃静置2小时或以上，然后离心(1,300×g、15分钟)。向所得沉淀中加入2ml再悬浮缓冲液(RB)[50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.5％SDS]，轻缓振荡15分钟，悬浮。向悬浮液中加入0.2ml 4M氯化钠和4ml乙醇，在-20℃静置2小时或以上，然后离心(1,300×g、15分钟)。用1ml 70％冷乙醇洗涤所得沉淀，然后悬浮于1ml TE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA]，移入Eppendorf管中，加入250μl10M氯化锂，在冰上静置1小时。将悬浮液在4℃离心(22,000×g、15分钟)，RNA作为沉淀回收。将该锂沉淀操作重复两次，将所得沉淀悬浮于300μl TE缓冲液，加入100μl氯仿/异戊醇(24∶1；v/v)，剧烈搅拌后，在4℃离心(22,000×g、15分钟)。向水层(上层)中加入1/10量的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍量的乙醇，在-20℃静置2小时或以上，然后离心(22,000×g、5分钟)。用70％冷乙醇洗涤所得沉淀，风干10分钟，悬浮于40μl TE缓冲液，制成总RNA。以此作为RNA样品，在-80℃保存。
11.Nortern印迹分析用甲醛琼脂糖凝胶电泳将总RNA分级(文献37)，通过碱印迹法(参照文献68)转印并固定在Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上。
将吸附有RNA的尼龙膜在42℃的预杂交溶液[50％甲酰胺、5×Denhardt溶液(文献37)、5×SSPE(文献37)、0.5％SDS、100μg/ml热变性鲑精DNA(Pharmacia)]中放置1小时或以上，然后添加32P标记DNA探针，在42℃下杂交16小时或以上。将该膜在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在室温下洗涤15分钟(2次)，再在含有0.1％SDS的4×SSP E中、在60℃下洗涤15分钟，再在含有0.1％SDS的2×SSPE中、在60℃下洗涤15分钟(1次)。使用X射线胶片OMAT-AR(Kodak)和增感纸Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下进行放射自显影。
12.探针的制备以掺入烟草的TEAS cDNA的质粒pTEAS(Facchini和Chappel，1992)为模板，使用引物(5’-GTCGACGACACAGCCACGTACGAGGT-3’SEQID NO.38、5’-ATCGATAGACTTTCTCCGGATGAGTG-3’SEQ IDNO.39)，通过PCR扩增TEAS cDNA片段。反应如下进行使用2ng掺入TaKaRa TaqTM(宝酒造)和插入片段DNA的质粒，用DNA热循环仪(PJ 2000、Perkin Elmer Cetus)在94℃-1分钟(热变性)、53℃-45秒(退火)、72℃-2分钟(DNA延伸反应)，25个循环的条件下进行反应。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确认扩增的DNA片段的大小。使用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶中纯化DNA片段。根据随机引物法(文献17)，使用[α-32P]dCTP(111TBq/mmol、ICN Biochemicals)和Megaprime DNALabelling systems(Amersham)制备32P标记DNA探针。
<实施例9>通过土壤农杆菌浸润法导入的PVS3启动子缺失克隆对INF1的应答来自晚疫病菌的引发物蛋白INF1是对本塞姆氏烟草有效的引发物(文献63)。将含有内含子的GUS基因框内连接到PVS3启动子的下游，形成双元载体，将该双元载体通过土壤杆菌浸润法导入本塞姆氏烟草叶中，由此研究INF1诱导的GUS活性(图27)。在导入几乎插入了PVS3启动子全长的双元载体pPVS3-1时，与水处理对照区相比，可观察到显著的GUS活性(图28)。为了研究应答INF1的PVS3启动子的顺式序列，制备缺失克隆，构建双元载体，研究GUS活性。结果在-1337(pPVS3-2SEQ ID NO.22)保持了INF1应答性，但如果缺失至-1287(pPVS3-3)之前，则INF1对GUS活性的诱导显著降低。该结果显示PVS3启动子的顺式序列与pPVS3-2和pPVS3-3之间的50bp(SEQ ID NO.23)有关(图29)。
<实施例10>StMEK1DD对PVS3启动子的诱导StMEK1DD是由于MAPKK的氨基酸取代而产生的组成型活性突变体，通过土壤农杆菌浸润法导入本塞姆氏烟草叶中，可诱导SIPK和WIPK(文献64)。为了研究PVS3启动子区针对INF1处理的应答区与针对StMEK1DD的应答区是否相同，将含有内含子的GUS基因与PVS3启动子连接，形成双元载体，将该双元载体通过土壤农杆菌浸润法导入本塞姆氏烟草中。同时使该烟草用经双元载体转化的农杆菌共感染，所述双元载体具有连接到由β-雌二醇诱导的XVE的下游连接的StMEK1DD。注入β-雌二醇后(B)，再静置一天，使StMEK1DD表达以研究GUS活性(图27)。结果与对照区相比，缺失至-1337(pPVS3-2SEQ ID NO.22)注入β-雌二醇后(B)诱导GUS活性(图30)。而如果PVS3启动子缺失至-1287(pPVS3-3)之前，则β-雌二醇处理对GUS活性的诱导显著降低。该结果显示pPVS3-2和pPVS3-3之间的50bp(SEQ ID NO.23)与应答StMEK1DD的顺式序列有关，其与针对INF1的顺式序列相同(图29)。
<实施例11>SIPK和WIPK沉默对于StMEK1DD诱导的PVS3启动子活性的影响通过土壤农杆菌浸润法将pPVS3-1导入使SIPK、WIPK单独或SIPK和WIPK双方基因沉默的本塞姆氏烟草，进行GUS活性的研究。此时，将连接在XVE下游的StMEK1DD通过土壤农杆菌浸润法共感染该本塞姆氏烟草，感染1天后注入β-雌二醇，再静置一天，使StMEK1DD表达(图31)。与接种PVX的对照植物比较，在分别使SIPK、WIPK沉默的植物体中，并未观察到GUS活性的显著降低(图32)。而在使SIPK、WIPK双方沉默的植物体中，可观察到GUS活性的显著降低。
<实施例12>SIPK和WIPK沉默对于StMEK1DD诱导的TEAS表达的影响为了研究烟草的倍半萜环化酶TEAS的控制机理，通过土壤农杆菌浸润法将含有与35S启动子连接的StMEK1DD的表达载体导入使SIPK和WIPK沉默的本塞姆氏烟草，在不同时间提取总RNA。使用TEAScDNA作为探针进行Nortern印迹分析时，在使SIPK和WIPK两者均沉默的区，TEAS mRNA的蓄积得到显著抑制(图32)。该结果显示SIPK和WIPK对于PVS3启动子的活性的作用相同。
如以上实施例所示，为了研究对于PVS3基因表达重要的启动子区，将PVS3启动子连接到GUS基因的上游，构建缺失克隆，实施INF1处理，测定GUS活性(图28)。缺失pPVS3-2(SEQ ID NO.22)中，可见INF1处理使活性显著增加，但缺失pPVS3-3中未见活性增加(图28)。已知基因的转录是由于因刺激而产生的转录因子蛋白与启动子区中的顺式序列结合而被诱导的。可以认为缺失pPVS3-2和pPVS3-3之间存在与转录因子结合的顺式序列。目前该50bp的区(SEQ ID NO.23)中还未发现已知的调控元件(图29)。
有报道显示烟草的MAPK即SIPK控制在倍半萜烯植物抗毒素合成中发挥重要作用的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的表达(文献73)。已知MAPK级联在植物的信号转导途径中担负着重要的控制功能，在其下游激活各种防御反应(文献71)。最近有报道显示将StMEK1DD连接到35S启动子的下游，构建表达载体，将该表达载体通过土壤农杆菌浸润法导入本塞姆氏烟草，则TEAS在转录水平被诱导(文献64)。为了研究PVS3启动子针对INF1处理的应答区与针对StMEK1DD的应答区是否相同，通过土壤农杆菌浸润法使缺失克隆和StMEK1DD在本塞姆氏烟草叶中共表达，以此研究GUS活性。与INF1的情况相同。缺失pPVS3-2中，可见StMEK1DD使活性显著增加，但缺失PVS3-3中未见活性显著增加(图30)。Zhang等人(1998)报道用隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)生产的隐地蛋白激发素或寄生疫霉(P.parasitica)生产的parasiticein激发素处理烟草培养细胞，则SIPK和WIPK被激活(文献72)。结合本试验结果考虑，则显示MAPK级联与晚疫病菌生产的INF1激发素的信号转导诱导PVS3的过程可能有关。为了研究该可能性，通过土壤农杆菌浸润法将含有PVS3启动子的双元载体导入使SIPK、WIPK或SIPK和WIPK双方沉默的本塞姆氏烟草叶中，用INF1激发素处理，研究GUS活性(图32)。与接种PVX的对照植物比较，在使SIPK或WIPK沉默的植物体中，仅仅看到GUS活性的降低。而在使SIPK和WIPK双方沉默的植物体中，可观察到GUS活性的显著降低。这些结果显示内源性倍半萜环化酶TEAS也可能受SIPK和WIPK的控制。因此，使StMEK1DD基因在使SIPK和WIPK沉默的本塞姆氏烟草中表达时，只在SIPK和WIPK双方沉默的区中，TEAS mRNA的蓄积受到显著抑制(图32)。
Samuel和Ellis(2002)报告将烟草植物置于高浓度臭氧环境中，则SIPK和WIPK被激活，诱导了伴随着活性氧生成的细胞死亡(文献69)。他们发现将由于RNAi(RNA干扰)使SIPK沉默的转基因植物置于臭氧中，则WIPK活性显著增高，诱导细胞死亡。结合该报告，可以认为SIPK和WIPK以彼此互补的形式控制下游的PVS3基因的表达本发明并不受上述发明的实施方式和实施例说明的任何限制。只要不脱离权利要求的范围，本领域技术人员可容易想到的范围内的各种变化方案也包含在本发明中。
序列表<110>NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTEYOSHIOKA，Hirofumi<120>病原菌应答性启动子<130>P0206402<150>JP P2002-351701<151>2002-12-03<150>JP P2003-294409<151>2003-08-18<160>39<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2648<212>DNA<213>马铃薯<220>
<221>misc_feature<222>(246)..(246)<223>n代表任意碱基<220>
<221>misc_feature<222>(278)..(278)<223>n代表任意碱基<400>1ctcttctgtt gatgtgctat agtcttttat atagcgctct attcatgttg taatttggcc 60tctactttaa tttttttcaa cctaaaccaa cgtacaataa tgtgtaatga tactaatttg120actcacataa tagcatggtg ctagaagagt cacttgaaag agtatactga agagtattaa180aaatataatt ctaaagaatt tcgaagattc aattataatt gatcaagaag gtgataagag240
ccttcnacaa caacgtaaag tttgggtagc ctctatanat gactatgaaa atagccaaaa300aaaaattcaa attcgaattc ttgtaatcct tatttaggat tattgcgacc atcacttgtg360ggtgccttac ttgactaaat atttgattaa acattaattt ttggtcagtg gatatacatg420ccactcaatt ttaaataaat tagtgatccc ttacgatctt aaaaaaattg tatttttgtg480tgtaatgtca actttggttc aaatgtctaa tataataagt attaattcca acagtattag540aattttattt ctaagatcac tcttacggtc ttaccactga aagattaaaa ttctaaccaa600gaatttgaac tttaaatagt acttatgaat tttacttgcc gtttgaattt tatgtacatg660cttagaataa ttaggtcctc atgtagtcaa ctttaagaaa attacaatgt tacgttctaa720caagaacaaa tttgactcta gatttttaat tttttttttt taaaaaaaaa ctaaatactc780atccgattca atttgtttga aactatgttc caattattaa tccgtttcaa aaacaatgtt840acattcagat atttaaaatc aattaactta aatttctcat catcagtaag aagttttaat900aatcacatga aggaaagcct gtttggagaa agttatgcgt aaaatattgc atatatctct960tccattgaat tagttacatc tggatttgca taaaatcaac atttagtaaa atacgatggc 1020ttagatgatt gaactttgaa caggaaaaat aagcgtgcaa ataagccatc aatcttgaac 1080tttagaaata tatatatata attcaataag ttactttatt ggaatagcta tagtgacggc 1140ggatttagaa ttttcattaa agggactcta aaaaaatata gtgcctaaga tttgaacttg 1200aaactcaaga tgccactaaa caacctctaa tcttacattc agaaggttca aaatcaatat 1260atatagacat aattttttaa atttttttta acctccctcg actacctcta ggtccgccct 1320tactattccc atccgatctc ttgggaagcg ggggagaaaa ttttataata gtgcactcat 1380gctataatta catactaaga ttttatgtaa tgctatattt tttcaagttg aagacggaaa 1440caatagcatt ggatcaagac agacgccatt gaaggaagaa aaaacctaaa aaaataaaca 1500aaaggagaga cactttcttg gtcccttcga ggccatatat cccattaata taaaaatata 1560
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<400>2tttatgtaca tgcttagaat aattaggtcc tcatgtagtc aactttaaga aaattacaat 60gttacgttct aacaagaaca aatttgactc tagattttta attttttttt tttaaaaaaa120aactaaatac tcatccgatt caatttgttt gaaactatgt tccaattatt aatccgtttc180aaaaacaatg ttacattcag atatttaaaa tcaattaact taaatttctc atcatcagta240agaagtttta ataatcacat gaaggaaagc ctgtttggag aaagttatgc gtaaaatatt300gcatatatct cttccattga attagttaca tctggatttg cataaaatca acatttagta360aaatacgatg gcttagatga ttgaactttg aacaggaaaa ataagcgtgc aaataagcca420tcaatcttga actttagaaa tatatatata taattcaata agttacttta ttggaatagc480tatagtgacg gcggatttag aattttcatt aaagggactc taaaaaaata tagtgcctaa540gatttgaact tgaaactcaa gatgccacta aacaacctct aatcttacat tcagaaggtt600caaaatcaat atatatagac ataatttttt aaattttttt taacctccct cgactacctc660taggtccgcc cttactattc ccatccgatc tcttgggaag cgggggagaa aattttataa720tagtgcactc atgctataat tacatactaa gattttatgt aatgctatat tttttcaagt780tgaagacgga aacaatagca ttggatcaag acagacgcca ttgaaggaag aaaaaaccta840aaaaaataaa caaaaggaga gacactttct tggtcccttc gaggccatat atcccattaa900tataaaaata taaaacaaaa aaaaagacag acggtcgccc aaggaaagaa ggcggacgtc960actaacggct aaccctaact acaaataatg taattttcca aaaacggaac tataaggaat 1020aaaaaacatg aagattattg agtattatta atttttaaaa gacagacgcc actcgaggaa 1080ataaggaatc acaaggagta aagaaagaaa ttaaaggcac gttacagtat catataatat 1140aaatttaagt ttggttgcat tgaagttata tagtttttaa aaaaaaataa aattgtccaa 1200caatacttgt ccaatttaga aaatctaaaa gataatttat tattttgtgt ttgttttacc 1260
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<223>突变的MEK<400>8Met Arg Pro Leu Gln Pro Pro Pro Pro Ala Ala Asn Ser Thr Ser Ser1 5 10 15Ala Ala Ala Ser Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ala Gly Gln Arg Ser20 25 30Arg Pro Arg Arg Arg Thr Asp Leu Thr Leu Pro Leu Pro Gln Arg Asp35 40 45Val Ala Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Thr Ser Ala Pro Ser50 55 60Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Pro Thr Pro Leu His Phe65 70 75 80Ser Glu Leu Glu Arg ValAsn Arg Ile Gly Ser Gly Thr Gly Gly Thr
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<223>PCR引物<400>25cggaattctt gtaatcctta tttaggatta 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>PCR引物<400>29cggaattcga cgccattgaa ggaagaaaaa 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>30
cggaattcac tttcttggtc ccttcgaggc30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>31cggaattcaa caaaaaaaaa gacagacggt30<210>32<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>32cggaattcgt tatatagttt ttaaaaaaaa30<210>33<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
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<220>
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<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>PCR引物<400>39atcgatagac tttctccgga tgagtg 2权利要求
1.病原菌应答性启动子，该启动子含有以下(a)-(c)中任意一项的DNA(a)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的DNA；(b)含有在SEQ ID NO.1所示碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(c)在严谨条件下与(a)或(b)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
2.病原菌应答性启动子，该启动子含有以下(A)-(C)中任意一项的DNA(A)含有SEQ ID NO.2所示碱基序列的DNA；(B)含有在SEQ ID NO.2所示碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(C)在严谨条件下与(A)或(B)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
3.病原菌应答性启动子，该启动子含有以下(1)-(3)中任意一项的DNA(1)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列内连续的一部分，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(2)含有在(1)的DNA中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。(3)在严谨条件下与(1)或(2)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
4.病原菌应答性启动子，该启动子含有以下(i)-(iii)中任意一项的DNA(i)含有SEQ ID NO.22所示碱基序列的DNA；(ii)含有在SEQ ID NO.22所示的碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA；(iii)在严谨条件下与(i)或(ii)的DNA杂交，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能的DNA。
5.病原菌应答性启动子，该启动子含有以下(I)-(III)中任意一项的DNA，在植物细胞内发挥病原菌应答性启动子功能(I)含有SEQ ID NO.23所示碱基序列的DNA；(II)含有在SEQ ID NO.23所示的碱基序列中有1或多个碱基取代、缺失、插入或添加的碱基序列的DNA；(III)在严谨条件下与(I)或(II)的DNA杂交的DNA。
6.如权利要求5所述的病原菌应答性启动子，其特征在于对病原菌感染有特异性应答。
7.DNA，该DNA含有SEQ ID NO.23所示碱基序列。
8.DNA，该DNA含有SEQ ID NO.23所示碱基序列中连续10个或以上的碱基序列，具有病原菌应答性启动子活性。
9.载体，该载体包含权利要求5的病原菌应答性启动子。
10.载体，该载体包含权利要求8的DNA。
11.DNA构建体，该DNA构建体包括权利要求5的启动子；与该启动子相连并受其控制的、在植物体内表达并激活该植物的防御应答的基因。
12.DNA构建体，该DNA构建体包括权利要求8的DNA；与该DNA协同作用构成病原菌应答性启动子的DNA；与所构建的病原菌应答性启动子相连并受其控制的、在植物体内表达并激活该植物的防御应答的基因。
13.权利要求11的DNA构建体，其中上述基因具有其表达产物激活控制植物的防御应答的信息转导途径的功能。
14.权利要求11的DNA构建体，其中上述基因具有其表达产物激活SIPK或WIPK的功能。
15.权利要求11的DNA构建体，其中上述基因是编码组成型活性形式MEK的基因。
16.转化体，该转化体是用权利要求11的DNA构建体转化宿主植物而得到的。
17.权利要求16的转化体，其中上述宿主植物是茄科植物。
18.权利要求16的转化体，其中上述宿主植物是马铃薯属的植物。
19.转基因植物的制备方法，包括用权利要求11的DNA构建体转化宿主植物的步骤。
20.赋予宿主植物病原菌抗性的方法，包括用权利要求11的DNA构建体转化宿主植物的步骤。
21.植物，该植物外源导入了权利要求5的病原菌应答性启动子。
22.植物，该植物外源导入了权利要求8的DNA。
全文摘要
本发明提供对于病原菌感染特异性应答的启动子(病原菌应答性启动子)。公开了含有由马铃薯植物的PVS3启动子区(SEQ ID NO.1)形成的DNA的病原菌应答性启动子。还公开了对于启动子活性重要的区(SEQ IDNO.23)。
文档编号C12N15/82GK1745171SQ20038010929
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月1日 优先权日2002年12月3日
发明者吉冈博文 申请人:财团法人名古屋产业科学研究所