专利名称：嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)MIP基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中嗜肺军团菌MIP基因的重构后表达、纯化方法，特别是嗜肺军团菌MIP基因的重组、表达和纯化；在军团菌感染临床诊断、治疗方面的应用。
为了稳定的获得足量的蛋白，同时为制备用于研究蛋白的高效的抗MIP抗体，本发明的发明人通过基因重组的方法，获得了重组嗜肺军团菌MIP基因，为了加强其抗原性，发明人同时稳定、高效的表达了嗜肺军团菌MIP蛋白。
本发明的目的是提供上述嗜肺军团菌MIP基因、表达和蛋白纯化的方法。
本发明的技术方案为克隆、重组、表达纯化嗜肺军团菌MIP蛋白的方法，包括以下步骤(1)、克隆嗜肺军团菌MIP的基因，用PCR法扩增MIP的基因；(2)、将上述扩增的MIP基因与克隆载体连接，构建嗜肺军团菌MIP基因克隆质粒；(3)、将上述克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达人嗜肺军团菌MIP基因a、将上述带有嗜肺军团菌MIP基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基(含抗生素)培养瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；
(5)、纯化嗜肺军团菌MIP蛋白a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次；离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化嗜肺军团菌MIP；d、用离子交换和镍柱层析法进行纯化。
本发明专用引物的序列为引物1 5′AAGGATAAGTTGTCTTATAG 3′引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA 3′下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为嗜肺军团菌MIP基因表达的蛋白电泳(SDS-PAGE)实施例一、嗜肺军团菌MIP基因的获得1、取嗜肺军团菌1毫升，离心，12,000转/分，3分钟，去上清液，用0.3毫升Tris缓冲液悬浮菌体沉淀，置100度水中10分钟，离心12000转/分5分钟。
取上请液(含嗜肺军团菌基因组DNA)为模板作PCR扩增。
2、设计引物如下引物1 5′AAGGATAAGTTGTCTTATAG 3 ′引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA 3′3、将上述DNA为模版，PCR扩增，PCR反应条件为94℃变性50秒，55℃退火1分钟，
72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃保温10分钟4、PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收；二、构建嗜肺军团菌基因克隆质粒1、将PCR产物用胶回收纯化。
2、将A-T克隆载体(任何克隆载体均可以，如T-easy，pGEX等)和PCR产物连接，连接反应体系如下A-T克隆载体 1ul5x连接缓冲液2ulT4 DNA连接酶1ulPCR产物 4ulH2O 2ul以上混合物在16℃连接反应12小时；3、将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，涂布含氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆，用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA进行测序。将测序结果和基因库(genbank)发表的序列进行基因同源性比较，证实基因序列正确无误。
三、表达质粒pQE30-MIP的构建1、将上述克隆载体中嗜肺军团菌的基因片段用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切下，经1％琼脂糖电泳，回收嗜肺军团菌基因片段；2、将上述基因片段与相同酶切的pQE30表达载体(表达载体也可为其它载体如pET，pGST等)连接，连接反应体系如下pQE30(BamHI，HindIII酶切后) 1ul5x连接缓冲液2ulT4DNA连接酶 1ul嗜肺军团菌MIP基因片断 5ul
H2O1ul以上混合物在16℃连接反应12小时3、将连接产物转化M15感受态细胞，涂布卡那霉素和青霉素LB板，挑取阳性克隆；4、用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用BamHI和HindIII双酶切鉴定出重组质粒pQE30-MIP含有嗜肺军团菌MIP基因片断。
四、pQE30-嗜肺军团菌MIP基因在大肠杆菌中的表达1、将筛选出的带有重组质粒pQE30-MIP基区工程菌接种10ml LB(含卡那霉素和氨苄青霉素)试管内，37℃，300r/min摇床培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时终止培养。
2、将上述10ml菌液放入装有1000ml LB培养基(含含卡那霉素和氨苄青霉素)的培养瓶中，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值，其OD值为0.6-0.8时，向菌液内加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，使其终浓度为0.5mM，继续培养4-6小时；3、收集细菌，以5000转/分，4℃，离心20分钟，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至终浓度1mM，放于-20℃冻溶，并取样品用SDS-PAGE分析，如图1所示。
五、嗜肺军团菌MIP蛋白的分离纯化1、用超声破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使细菌裂解，然后在4℃条件下12,000r/min离心10min，沉淀重悬于30ml基础缓冲液(8M尿素，10mM Tris，pH8.0)，12,000r/min离心20min，取上清液；2、上清液经DEAE离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析DEAE离子交换层析柱分别以基础液加100mM、200mM、400mM的NaCl进行洗脱。各组分经12.5％SDS-PAGE分析。含所需蛋白的组分进行Ni-NTG-His柱亲和层析，分别以基础液加15nM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脱。将收集的各组份作12.5％SDS-PAGE分析。
如图2所示，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳分析呈现一条带。
在上述实施例中，表达质粒的构建还可以用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以嗜肺军团菌MIP克隆质粒DNA为模板，将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。
权利要求
1.一种表达纯化嗜肺军团菌MIP基因和重组嗜肺军团菌MIP的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、克隆嗜肺军团菌MIP的基因，用PCR法扩增嗜肺军团菌MIP的基因；(2)、将上述扩增的嗜肺军团菌MIP基因与克隆载体连接，构建嗜肺军团菌MIP克隆质粒；(3)、将上述嗜肺军团菌MIP克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达嗜肺军团菌MIP蛋白。a、将上述带有嗜肺军团菌MIP基因的表达载体的大肠杆菌接种含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，接种LB培养基(含有抗生素)瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养4-6小时；d、收获细菌；(5)、纯化嗜肺军团菌MIP蛋白。a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、超声裂解细菌，离心，将沉淀加8M尿素悬浮，离心，取上清液；c、纯化人用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。
2.根据权利要求1所述的表达纯化重组嗜肺军团菌MIP基因和方法，其特征在于所述PCR法扩增嗜肺军团菌MIP的基因和所用的引物为引物15′AAGGATAAGTTGTCTTATAG，引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA。
全文摘要
本发明涉及一种嗜肺军团菌Legionellapneumophila macrophage infectivity potentiator MIP基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MIP蛋白及其类似物、衍生物在军团菌感染病人的临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的嗜肺军团菌(Legionalla Neomaphalla)MIP基因组DNA，用PCR方法获得MIP基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MIP蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步诊断嗜肺军团菌感染应用于检测嗜肺军团菌抗原和抗体。
文档编号C12P21/00GK1664105SQ20041000636
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月1日 优先权日2004年3月1日
发明者杨建国, 王金良, 李晓眠, 张楷 申请人:天津瑞爱金生物科技有限公司