专利名称：雨生红球藻原生质体制备与再生技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程中微藻原生质体制备和再生技术，具体说涉及雨生红球藻原生质体制备和再生的技术。
虾青素是一种优质天然色素，它的抗氧化能力比β-胡萝卜素更强，具有抑制肿瘤和增强免疫功能等生理作用，在医药、食品、畜牧和水产上均有广泛用途。雨生红球藻作为自然界中虾青素含量最高的生物，逐渐成为重点开发的微藻。但由于它是自养型生物，因此生长缓慢，生物量低，生产成本高，生产规模和市场受到限制。原生质体技术，特别是原生质体融合，可以在亲缘关系较远的双亲间交换重组遗传物质，还能交换和重组细胞质遗传。将雨生红球藻与生长快、产量高的异养微生物融合杂交，选育优良后代，弥补其自身不足，是开发雨生红球藻的理想途径。原生质体制备和再生是进行融合的前提条件和关键技术。因此，雨生红球藻原生质体制备和再生技术具有理论和实用价值。
从有关资料检索表明，目前国内尚无雨生红球藻原生质体制备和再生的报道。国外仅见日本的Agus Eko Tjahjono等在Journal of fermentation and bioengin-eering.1993，75(3)196-200中进行了报道，其制备方法为离心收集微藻细胞，加入含0.06％蛋白酶K、0.2mol/L山梨醇和甘露醇的酶解液，于35℃下处理15min，获得对渗透压敏感的原生质体，最高制备率约70％，再生率不明确。并且该方法存在几个问题用蛋白酶K为细胞壁水解酶，对细胞壁中的纤维素和果胶质等主要成份无作用，去壁不彻底，影响融合效果；用0.2mol/L甘露醇或0.2mol/L山梨醇单一化合物为高渗溶液，因浓度高产生毒害，降低细胞活性，影响原生质体再生；再生培养基成份与普通培养基组成相同，再生效率低。
本发明的目的就是为了克服现有方法存在水解酶成本高，制备的原生质体细胞壁残留过多，影响融合，高渗溶液浓度高、毒害大，原生质体活性低，再生能力弱等问题。
为实现上述目的本发明采用的主要技术方案(1)用酸性(柠檬酸+柠檬酸钠)缓冲液(pH4.0)、乙二胺四乙酸(EDTA)和二硫苏糖醇(DTT)等配成的预处理剂浸泡细胞，破坏细胞壁致密结构，加速水解酶和细胞壁接触面积，缩短释放原生质体的时间，提高活性和再生能力。
(2)水解酶由纤维素酶、蜗牛酶和果胶酶制备而成，溶解在复合高渗溶液(NaCl 0.1mol/L，KCl 0.1mol/L，MgSO40.02mol/L，CaCl20.01mol/L)中，维持溶液总浓度约0.2mol/L。由于每种盐浓度相对较低，因而有效地缓解了高渗溶液对细胞毒害程度，进而较大地提高原生质体制备率、活性和再生能力。
(3)再生培养基中加入三十烷醇，更有利于促进细胞再生与分裂，缩短原生质体再生时间，提高再生效率。
本发明的配方1、预处理剂的制备将30～50mmol/L的乙二胺四乙酸和25～45mmol/L二硫苏糖醇溶解在pH4.0的酸性缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠)中。
2、复合高渗溶液制备用pH6.5的磷酸缓冲液配成含NaCl 0.1mol/L、KCl0.1mol/L、MgSO40.02mol/和CaCl20.01mol/L的复合高渗溶液。
3、高渗复合酶液的制备用前述的复合高渗溶液加入多种水解酶配制成高渗复合酶液，其中纤维素酶1～2％、蜗牛酶0.5～1.5％、果胶酶0.3～1.0％、复合高渗溶液95.5～98％。
4、保存液的制备用常规的BBM培养液配成含葡萄糖0.1mol/L、蔗糖0.1mol/L和CaCl20.01mol/L的保存液。
5、再生培养基用前述保存液配成含三十烷醇0.1～0.5ppm的再生培养基。
本发明操作过程为收集培养4天的对数生长期藻细胞，用酸性缓冲液(pH4.0)、30～50mmol/L乙二胺四乙酸和25～45mmol/L二硫苏糖醇配制而成的预处理剂，25～34℃恒温处理30～60min。然后转入高渗复合酶液中，25～35℃，恒温振荡，水解去除细胞壁。3h后离心收集所得原生质体，稀释，分离到再生培养基平板上，于25℃光照培养，直至出现再生藻落。
本发明操作简便，设备要求低，所制备的雨生红球藻原生质体透明，活力高，具有较为鲜艳的颜色，形态较圆，原生质体制备率超过80％；原生质体制备和再生速度快，可缩短三分之一，再生率提高70％以上。利用本发明制备的原生质体完全能满足原生质体融合的要求，融合率和再生率相对较高。
下面结合实例对本发明作进一步说明。
实施例1取培养4天的对数生长期雨生红球藻培养液5mL，3500r/min离心10min，等量无菌水洗涤后，离心收集微藻细胞，加入5mL预先配制好的预处理剂(50mmol/L EDTA，25mmol/L二硫苏糖醇，pH4.0酸性缓冲液配制而成)，34℃处理60min，离心收集藻细胞，加入5mL复合高渗酶液(含0.1mol/L NaCl，0.1mol/LKCl，0.02mol/L MgSO4，0.01mol/L CaCl2，2.0％纤维素酶，0.5％蜗牛酶，1.0％果胶酶，pH6.5磷酸缓冲液)，25℃，60r/min振荡，水解破壁3h，离心收集原生质体，用含0.1mol/L葡萄糖，0.1mol/L蔗糖和0.01mol/L CaCl2的保存液稀释，分离到含有0.5ppm三十烷醇的再生培养基上，25℃下光照培养，直至出现再生藻落。
实例2取培养4天的对数生长期雨生红球藻培养液5mL，3500r/min离心10min，等量无菌水洗涤后，离心收集微藻细胞，加入5mL预处理剂(40mmol/L EDTA，35mmol/L二硫苏糖醇，pH4.0柠檬酸缓冲液配制而成)，28℃处理30min，离心收集藻细胞，加入5mL高渗复合酶溶液(含0.1mol/L NaCl，0.1mol/L KCl，0.02mol/L MgSO4，0.01mol/L CaCl2，1.5％纤维素酶，1.0％蜗牛酶，0.5％果胶酶，pH6.5磷酸缓冲液)，30℃，60r/min振荡，水解破壁3h，离心收集原生质体，用含0.1mol/L葡萄糖，0.1mol/L蔗糖和0.01mol/L CaCl2的保存液稀释，分离到含有0.3ppm三十烷醇再生培养基上，25℃下光照培养，直至出现再生藻落。
实例3取培养4天的对数生长期雨生红球藻培养液5mL，3500r/min离心10min，等量无菌水洗涤后，离心收集微藻细胞，加入5mL预处理剂(30mmol/L EDTA，45mmol/L二硫苏糖醇，pH4.0柠檬酸缓冲液配制而成)，25℃处理40min，离心收集藻细胞，加入5mL高渗复合酶溶液(含0.1mol/L NaCl，0.1mol/L KCl，0.02mol/L MgSO4，0.01mol/L CaCl2，1.0％纤维素酶，1.5％蜗牛酶，0.8％果胶酶，pH6.5磷酸缓冲液)，35℃，60r/min振荡，水解破壁3h，离心收集原生质体，用含0.1mol/L葡萄糖，0.1mol/L蔗糖和0.01mol/L CaCl2的保存液稀释，分离到含有0.1ppm三十烷醇再生培养基上，25℃下光照培养，直至出现再生藻落。
权利要求
1.一种利用复合水解酶为破壁剂，以BBM为培养基的雨生红球藻原生质体制备和再生技术，其特征是藻细胞用含有乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇的酸性缓冲液预处理剂25～34℃恒温处理30～60min，后转入含有纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶的复合高渗酶溶液中降解细胞壁，分离到含三十烷醇的再生培养基上再生。
2.根据权利要求1所述的制备和再生技术，其特征是预处理剂配方为乙二胺四乙酸30～50m mol/L二硫苏糖醇 25～45m mol/L酸性缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠，pH4.0)
3.根据权利要求1所述的制备和再生技术，其特征是复合高渗溶液配方(摩尔浓度)为NaCl 0.1mol/LKCl0.1mol/LMgSO40.02mol/LCaCl20.01mol/L磷酸缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠，pH6.5)
4.根据权利要求1所述的制备和再生技术，其特征是使用高渗复合酶液的组成为(重量百分比)纤维素酶 1～2％蜗牛酶 0.5～1.5％果胶酶 0.3～1.0％复合高渗溶液 95.5～98％
5.根据权利要求1所述的制备和再生技术，其特征是再生培养基中加入了三十烷醇，浓度为0.1～0.5ppm。
全文摘要
本发明涉及一种微藻，特别是雨生红球藻原生质体制备和再生的技术。该技术通过用酸性缓冲液、EDTA和二硫苏糖醇配制而成的预处理剂，25～34℃恒温处理微藻细胞30～60min；用NaCl，KCl，MgSO
文档编号C12N1/12GK1560227SQ20041000753
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者王明兹, 施巧琴, 庄惠如 申请人:福建师范大学