专利名称：含有根据猪生长阶段表达的脂肪特异性基因的功能cDNA芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选根据猪生长阶段表达的脂肪特异性基因的表达谱以及用该表达谱制造的功能cDNA芯片。尤其是，本发明涉及筛选在生长阶段的猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的脂肪特异性基因表达谱以及用来评价肉的高质量以及筛选猪的特异性基因的功能cDNA芯片，该功能cDNA芯片采用仅仅整合脂肪特异性基因的方法制备得到。
背景技术：
由于原产的黑猪具有很厚的背部脂肪层，生长速度慢且繁殖率低，因此养猪的农民不愿意养这类猪。但是，这种猪具有结实的脂肪组织、白色的脂肪颜色、良好的质地、丰富且甜的肉汁，口感好，因此目前对这种猪肉的消耗量趋向于增加。可是，对这种原产猪的基因研究、谱系的保存和控制，以及肉质相关基因的分析仍然很不够。尤其是，与肉产量相关性状相比，肉质相关基因性状是更多基因特性综合的结果，这方面的研究尚未完全展开(Cameron，1993)。
一些重要的基因影响猪的肉质，目前已知的有ryanodine受体基因(RYR)，它导致了PSE(苍白的，柔软的，渗出的)猪肉(Eikelenboom andMinkema，1974；Smith and Bampton，1977；Webb，1981；Christian andMabry，1989；Fujii el al.，1991)，以及酸肉基因(Rendement Napole，Le Royel al.，1990；Lundstrom el al.，1996)。此外，通过QTL(数量性状座)分析可以知道肉质相关区域或各种候选基因。已知存在于第7号染色体上的猪白细胞抗原(SLA)复合物(Geffrotin el al.，1984)以及围绕该区域的微卫星标记S0064，S0066，S0102或TNF与背部脂肪厚度、上部腰肉位置、肉质特性以及猪肉腐败相关(Jung el al.，1989；Rothschild el al.，1995；Bidanel elal.，1996)。并且，已经发现背部脂肪厚度和腹部脂肪含量相关的QTL位于微卫星标记S0001-S0175(Andersson el al.，1994)的位置。此外，已有报道，垂体特异性的转录因子(PIT1)基因是一种激素调节因子(Yu el al.，1995)。并且已知肌肉间的脂肪含量(IMF)能极大地影响肉嫩、肉汁和口感(Devol elal.，1988；Cameron，1990)。有报道HFAPB(心脏脂肪酸结合蛋白)基因能影响肌肉间的脂肪含量(Gerbens el al.，1997)。现在，位于第6号染色体上的微卫星SW1823至S0003(74至79cM)位置与肉的这些特性的相互关系已得到了研究(Grindflek el al.，2001)。
因此，由于第4、6和7号染色体上大量发现了影响肉的质量性状的QTL(Clamp el al.，1992；Andersson el al.，1994；Renard el al.，1996；Rohrerand Keele 1998a，1998b；Wang el al.，1998；de Koning el al.，1999；Oviloel al.，2000；Gerbens el al.，2000)，已有许多研究围绕这些染色体开发了肉质相关标记。
在过去的几年里，已经有研究尝试开发含有无名的猪肉质相关基因标记和已知标记的基因图谱。到现在，已有多种在mRNA水平分析基因表达的技术被用来分析猪的基因差异，例如northern印迹，差异展示、基因表达的顺序分析以及点印迹分析等。但是，这些方法的缺陷是不适合用于多种表达产品的同时分析。近来已发展出一项新技术如cDNA微阵列能够克服上述缺陷。cDNA微阵列已成为在各种活体上研究基因表达的最有力的方法之一。该技术用于多基因的同时表达，大规模地发现基因，以及用于基因DNA克隆的多态性筛选和图谱的制定。该技术用来对从已知或未知的基因中转录的RNA进行定量分析，是一种非常先进的RNA表达分析技术。
目前使用的DNA芯片类型包括复合的DNA芯片，该DNA芯片的构建是通过设计引物，并根据数据库信息将来自cDNA文库的基因与功能DNA芯片结合，该功能DNA芯片是通过将现有文献中相关的基因结合而构建得到的。当复合的DNA芯片用于翻译时，由于非相关基因的作用而导致了翻译上的困难，因此需要很大的努力来最终解释生物学功能。并且，由于芯片的构建是基于数据库的，因此，没有信息或相关基因存在部分缺失的新基因可能就会有困难。同时，功能DNA芯片容易被翻译，但是需要另外收集基因用来表征那些在现有文件中未描述过的或功能未知的基因。因此，芯片上DNA的构建对于有效的解释生物功能是非常重要的。
考虑到这些问题，本发明人引入了cDNA微阵列技术来筛选猪的特定组织中与肉质相关的基因表达谱，并通过仅仅整合筛选到的特定基因而制备功能cDNA芯片，该芯片可用于高肉质猪的改良，以及根据猪的品种和组织来评价肉质。
发明内容
因此，本发明的目的在于根据脂肪的生长阶段筛选差异表达的特定基因的表达谱，这种筛选是通过将与探针整合的基底和来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA杂交，其中探针是从猪的肌肉和脂肪组织中分离到的总RNA中制备而来的。
本发明的另一个目的在于提供一种功能cDNA芯片，用于猪的肉质评价和筛选特定基因，该芯片是通过仅仅整合筛选到的特定基因而制备得到的。
根据本发明，上述目的是通过下述步骤实现的首先，用PCR从总RNA中制备数以千计的ESTs，所述总RNA是从猪的肌肉和脂肪组织中分离到的，然后将ESTs克隆分析，并在数据库中筛选它们的核苷酸序列，用PCR扩增ESTs，接着分离纯化，使用DNA芯片阵列在载玻片上排列产物和对照组，从猪的肌肉和脂肪组织里分离到的总RNA中制备靶DNA，来筛选生长相关基因的表达谱，将载玻片(探针DNA)和靶DNA杂交，扫描产物以获得一个图像文件，根据图像文件上猪的生长阶段检测差异表达的脂肪相关基因的表达情况，并通过仅仅整合根据生长阶段的猪的脂肪特异性基因来制备功能cDNA芯片。
本发明包含下述步骤从猪的肌肉和脂肪组织中制备ESTs以及鉴定序列信息；用ESTs制备探针DNA；将猪的肌肉和脂肪组织中获得的荧光标记的靶DNA(ESTs)与探针DNA杂交，接着扫描和分析图像文件；根据猪的生长阶段检测脂肪相关基因的表达谱；并通过仅仅整合脂肪特异性基因制备功能cDNA。
用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片是由下述步骤制备的从猪的肌肉和脂肪组织中分离到总RNA，用PCR从分离到的总RNA制备4434 ESTs；用DNA芯片阵列在载玻片上排列ESTs和酶对照；从猪的肌肉和脂肪组织分离到的总RNA中制备具有3-dCTP和5-dCTP结合的靶DNA；将载玻片(探针DNA)与靶DNA杂交，扫描产物并分析图像，以便根据猪的生长阶段检测特异性表达的脂肪相关基因的表达情况；并通过仅仅整合筛选到的猪生长阶段的脂肪特异性基因来制备功能cDNA芯片。
根据本发明的用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片包含探针和固定探针的基底，该探针含有在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的脂肪特异性基因。
根据本发明，用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的功能cDNA芯片的DNA微阵列上所固定的探针DNA包含胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin)、金属蛋白酶3抑制剂和整合素(integrin)β-1亚基。
本发明功能cDNA芯片的基底优选是聚合物膜，例如硅树脂晶片、玻璃、聚碳酸脂、膜、聚苯乙烯或聚亚胺酯。本发明所述的DNA微阵列可以采用制备DNA微阵列的常规方法将探针固定在基底上，采用的方法包括光刻法、压电影印、微吸量、点印法等。在本发明中，采用了点印法。
用于猪的肉质评价和特异性基因筛选的试剂盒包含功能cDNA芯片、从筛选的组织分离到的RNA中制备的具有3-dCTP和5-dCTP连接的cDNA，以及荧光扫描系统和计算机分析系统，其中功能cDNA芯片中整合了猪生长阶段的脂肪特异性基因。
具体实施例方式
本发明的详细描述参见下述实施例，但是这些实施例并不是用来限制本发明的。
实施例1根据猪的生长阶段筛选脂肪特异性基因的表达谱为了根据猪的生长阶段筛选脂肪特异性基因的表达谱，从KagoshimaBerkshire的肌肉和脂肪组织里分离到总RNA，并利用该总RNA制备探针DNA，将组织的总RNA进行荧光标记用于制备靶DNA。这些DNA杂交后扫描。分析所得图像结果，用来根据猪的生长阶段筛选脂肪特异性基因。
制备实施例1探针DNA的制备和排列首先，制备探针DNA并将其结合到载玻片上，该探针DNA也就是用PCR扩增的cDNA。采用RNA抽提试剂盒(Qiagen，Germany)，根据手册说明从Kagoshima Berkshire(体重30kg和90kg)的背最长肌的肌肉和脂肪组织中抽提总RNA，用oligo(dT)柱子提取mRNA。使用SP6，T3正向引物和T7反向引物(Amersham Pharmacia Biotech，England)对提取的mRNA样品进行RT-PCR用来合成cDNA。每一份PCR反应物的总体积均为100μl。100pM的正向和反向引物都转移至96孔PCR板上(Genetics，England)。每孔含有2.5mM的dNTP、10×PCR缓冲液、25mM MgCl2、0.2μg的DNA模板和2.5U的Taq聚合酶。在GeneAmp PCR系统5700(AB AppliedBioSystem，Canada)中进行PCR，条件为94℃30秒，58℃45秒，72℃1分钟，30个循环。
扩增的DNA片段大小通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物在96孔板中经乙醇沉淀，干燥并在-20℃保存。
上述制备得到的总4434 cDNAs(ESTs)克隆后分析猪的基因核苷酸序列，利用NCBI的数据库鉴定它们的基因信息。具有信息的基因被分离后用PCR纯化。构建总4434 cDNAs(ESTs)的基因座和图谱。总4434 cDNAs(ESTs)和300个酵母对照被排列在1.7cm2大小的区域。然后，用显微镜(Corning制造)在载玻片上将探针DNA点样，用Microgrid II(Biorobotics)将探针DNA包被上CMT-GAPSTM氨基硅烷。用开口针(split pin)将探针印迹到Microgrid II上。该针样装置靠近微板上的孔，往载玻片上注入溶液(1-2nL)。探针DNA印迹后，干燥载玻片，用Stratalinker TM(Stratagene，USA)在90mJ条件下将点印的DNA和载玻片进行UV交联，室温下用0.2％SDS洗两次共2分钟，然后用三蒸水在室温下洗一次共2分钟。洗涤后，95℃下将载玻片浸入水槽中2分钟，再加入封闭液(1.0g的NaBH4溶于300mLpH7.4的磷酸缓冲液，与100mL无水乙醇形成的混合物)封闭15分钟。然后，载玻片在室温下用0.2％SDS洗3次共1分钟，然后用三蒸水在室温下洗一次共2分钟，在空气中凉干。
制备实施例2靶DNA的制备和杂交为了制备靶DNA来筛选猪的肌肉和脂肪组织中的脂肪特异性基因，从体重为30kg和90kg的Kagoshima Berkshires的背最长肌中取出肌肉组织。从体重为30kg的Kagoshima Berkshires中取出脂肪组织。肌肉和脂肪组织被切成5-8mm长，用液氮冷冻，保存在-70℃。
根据TrizolTM试剂盒(Life Technologies，Inc.)手册，从0.2-1.0g的实验组和对照组中分离出总RNAs，用来制备靶DNA。每50-100mg的组织中加入1mL TrizolTM，使用玻璃-特氟纶或Polytron匀浆器进行破碎。破碎的颗粒在4℃下12,000g离心10分钟，将1mL的上清液等分。在每个等分液中加入200ul的氯仿，震荡15秒，冰上放置15分钟，4℃下12,000g离心10分钟。加入同样量的氯仿，震荡15秒，冰上放置15分钟，4℃下12,000g离心10分钟。将上清转移到一个新管中。在管中加入500μl的异丙醇，震荡，冰上放置15分钟。冷却后，4℃下12,000g离心5分钟。移出上清，与1mL 75％冷却的乙醇混合，4℃下12,000g离心5分钟。移出上清，在净化台上冻干30分钟，加入20μl无Rnase的水或DEPC水来溶解RNA。总DNA浓度设定在40μg/17μl，用于电泳。
根据标准的第一链cDNA合成方法来制备靶DNA。简言之，根据Schuler(1996)描述的方法，40μg的总RNA和oligo dT-18mer的引物(InvitrogenLife Technologies)混合，65℃下加热10分钟，4℃冷却5分钟。然后，加入1μl的25mM dATP、dGTP和dTTP的混合物、1μl的1mM dCTP(Promega)、和2μl的1mM氰蓝3-dCTP或2μl的1mM氰蓝5-dCTP、20U的RNA酶抑制剂(Invitrogen Life Technology)、100U的M-MLVRtase以及2μl的10×第一链缓冲液，用吸液管混匀。反应混合物在38℃下温育2小时，用乙醇沉淀去除未连接的核苷酸。步骤中使用DEPC处理的无菌水。
上述制备的载玻片，用杂交溶液(5×SSC，0.2％SDS，1mg/mL鲱鱼精DNA)在65℃下预杂交1小时。标记有氰蓝3(Cy-3)和氰蓝5(Cy-5)的靶DNA在95℃下的20μl杂交溶液中重新悬浮，变性2分钟。然后，载玻片在65℃下与溶液杂交过夜。杂交是在一个盖有玻璃(Grace Bio-Lab)的潮湿箱中进行的。
杂交后，载玻片在室温下用2×SSC、0.1％SDS洗涤4次，共5分钟，同时在振荡器上剧烈震动。然后，载玻片在室温下用0.2×SSC 5分钟以及0.1×SSC 5分钟洗涤两次。
载玻片用象素大小为50μm的ScanArray 5000(GSI Lumonics Version3.1)进行扫描。氰蓝3-dCTP标记的靶DNA在565nm下扫描，氰蓝5-dCTP化钾或碳酸氢钠。
本发明两步反应可以连续在同一反应釜中进行，因此操作方便，节约能源。所得水性环氧乳液外观细腻，过200目筛网无凝聚物，乳液乳胶粒粒经均匀，粒径分布测试表明99％的乳胶粒粒径在0.25μm以下。经测试，该水性环氧乳液的各项指标性能如下
注1-8为水性环氧树脂性能；9-11为涂膜的机械物理性能。
该水性环氧乳液在标准条件下成膜后，胶膜透明，并具有良好的耐水性胶膜在水中浸泡7天无泛白迹象。
采用本发明的水性环氧乳液，按常规可配制成内墙乳胶漆、金属防锈涂料等。例如采用本发明的水性环氧乳液，按照下列配比与颜填料，分散剂，消泡剂，防锈剂，防霉杀菌剂等按常规操作法混合，经高速分散研磨可制得各种颜色的水性环氧防腐蚀底漆。该底漆在容器中搅拌均匀，无结块现象。
水性环氧防腐蚀底漆(甲组分)按下列配方组成组份 重量％水性环氧乳液 45～55防锈剂1.5～2.5
如表1所示，在ASM中表达的14个基因已在表1中被鉴定且知道了它们的功能，但是并没有精确测定。这些基因包括肌动蛋白α1、原肌球蛋白α链、醛缩酶A、果糖-1，6-二磷酸酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、葡萄糖磷酸变位酶异构体1 mRNA、丙酮酸激酶、线粒体、kel-样蛋白(表2)。包含微丝的肌动蛋白细胞骨架负责真核细胞的各种功能，如细胞内传输以及结构支持。肌动蛋白以单体(G-肌动蛋白)或细丝(F-肌动蛋白)的形式存在。F-肌动蛋白是微丝的主要成分。许多蛋白调节微丝的长度、位置和变形。肌动蛋白细胞骨架具有一个可变的结构，它可以根据刺激以及细胞周期过程立即变化形状和结构。肌动蛋白细胞骨架的结构不是固定的，而是根据细胞环境发生改变。结合有肌钙蛋白复合物(肌钙蛋白-I，-T和C)的原肌球蛋白在脊椎动物门线性肌肉收缩引起的Ca2+依赖性调节中起重要作用。原肌球蛋白与包含二聚体的α卷曲螺旋结构的蛋白质组紧密相关。催化哺乳动物PEP到ADP转磷酸作用的丙酮酸激酶是重要的调节酶之一，它的调节代谢途径的特性与途径调节中其它组织需要的各种代谢要求紧密联系。因此，本发明人将它用于本发明目的的研究中。
此外，在ESM中表达的5个基因已在表1和2中被鉴定且它们的功能未知，对此并没有精确测定。这些基因包括胶原蛋白、disk/大同源物5(果蝇)，酸性分泌蛋白和波形纤维蛋白(vimentin)。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，并包含至少18种类型的不同的大蛋白质组，这在胚胎发育和各种形态学分化过程中的细胞分裂、复制、迁移和连接中能观察到，并且被外周细胞基质的细胞相互作用部分调节。
在白细胞分化为巨噬细胞过程的一系列基因表达之后，波形纤维蛋白编码基因(Vim)的表达是其中的一个终止标记。因此，对转录调节机理的评价是理解负责白细胞分化的基因调节途径的重要阶段。
表2ESM和ESF间差异表达基因的表达比率
同意的登录号**和数据库相符的信息没有匹配没有和数据库相符的信息；新的ESTESM早期肌肉(体重30kg)，ESF早期脂肪(体重30kg)，SM猪的肌肉。
如表2所示，在ESF中表达的13个基因包括肌钙蛋白-C、L-乳酸脱氢酶M链、LIM域1蛋白、丙酮酸激酶、核糖体蛋白P0和转运RNA-Trp合成酶。包含编码M1型和M2型同功酶的人丙酮酸激酶M(PKM)基因的基因组克隆被分离，测定它们的外显子序列。基因大约是32kb，包含12个外显子和11个内含子。外显子9和10分别包含对M1型和M2型特异的序列，这表明人同功酶是从相同的基因中通过选择性剪切制备得到的，如脂肪基因。4LIM域蛋白1(FHL1)首先被用作丰富的骨骼肌蛋白，该蛋白具有4个LIM域和1个例如锌指结构的GATA。FHL1在骨骼肌和各种组织中表达。近来，选择性地插入FHL1 mRNA编码C末端缺失的蛋白质已得到鉴定。现已发现，FHL1C在猪的骨骼肌中通过一种新鉴定到的起始密码子最终产生含有16个氨基酸的N末端。从上述的这些结果可以看到，这些基因可作为肉质相关的候选基因来评价。
因此，鉴定到的基因表达比率在ESM比ASM中以及ESM比ESF中是两倍多。通过cDNA微阵列分析，鉴定到了极大地过度表达的总共128个基因。肌动蛋白、β-肌球蛋白、糖原磷酸酶、肌球蛋白重链、新基因(novelgenes)、丙酮酸激酶和肌钙蛋白C在ESM中特异性表达。胶原蛋白、纤维连接蛋白、金属蛋白酶3抑制剂、整合素(intergrin)β-1亚基在ESF中特异性表达。1-α动力蛋白重链、601446467F1，假设的蛋白、纤维连接蛋白前体物、MHC的I型、新基因、无名蛋白产物在ASM中特异性表达。这些基因被作为肉质相关的候选基因来评价。此外，本发明人还将对更多基因的功能进行研究，以便培育高肉质的猪。
实施例2用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的本发明功能cDNA芯片的构建在实施例1中筛选到的猪生长阶段脂肪特异性基因，包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、金属蛋白酶3抑制剂和整合素(integrin)β-1亚基被固定在DNA微阵列上，用制备实施例1的方法来构建用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的功能cDNA芯片。
实施例3构建用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的本发明的试剂盒用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的本发明的试剂盒包括如实施例2构建的功能cDNA芯片、从筛选组织的RNA中获得的结合有Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA、以及荧光扫描系统和计算机分析系统。
工业应用性如实施例所述，本发明涉及根据猪的生长阶段来筛选脂肪特异性基因的表达谱，以及采用该表达谱构建的功能cDNA芯片，并且根据猪的肌肉和脂肪组织的生长阶段提供了脂肪特异性基因的表达谱。此外，本发明还提供了用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的功能cDNA芯片，该芯片是通过仅仅整合上述筛选到的脂肪特异性基因而制备的。因此，该功能cDNA芯片可用来根据猪的品种评价肉质，并培育高肉质的猪，因而本发明对养猪业是非常有用的。
权利要求
1.用于肉质评价和筛选特异性基因的功能cDNA芯片，该芯片包括含有脂肪特异性基因的DNA探针和固定探针的基底，其中脂肪特异性基因是在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达。
2.根据权利要求1所述的功能cDNA芯片，其中探针DNA包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、金属蛋白酶3抑制剂和整合素β-1亚基的基因。
3.用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的试剂盒，包括权利要求1所述的功能cDNA芯片、整合在芯片上的从筛选组织的RNA中获得的结合有Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA、以及荧光扫描系统和计算机分析系统。
全文摘要
本发明涉及根据猪的生长阶段来筛选脂肪特异性基因的表达谱，以及采用该表达谱构建的功能cDNA芯片，并且根据猪的肌肉和脂肪组织的生长阶段提供了脂肪特异性基因的表达谱。此外，本发明还提供了用于猪的肉质评价和筛选特异性基因的功能cDNA芯片，该芯片是通过仅仅整合上述筛选到的脂肪特异性基因而制备到的。因此，该功能cDNA芯片可用来根据猪的品种评价肉质，并培育高肉质的猪。
文档编号C12M1/34GK1621530SQ20041000752
公开日2005年6月1日 申请日期2004年3月12日 优先权日2003年11月24日
发明者金哲旭, 吕政秀, 李正圭, 宋瑛敏, 曹光根, 郑起和, 金一锡, 阵祥根, 朴修贤, 郑智媛, 李旼晶, 权银贞, 赵恩锡, 赵碻来, 慎诜敏, 南喜善, 洪娟喜, 洪星光, 姜阳守, 河永主, 卢正晚, 郭石俊, 崔仁灏, 金炳宇 申请人:庆尚南道, 金哲旭