专利名称：重组复合干扰素工程菌的构建方法
技术领域：
本发明属于一种基因工程技术，特别是一种重组复合干扰素工程菌的构建方法。
背景技术：
干扰素(Interferon)是1957年首次由Issacs和Lindemann作为一种自然发生的抗病毒物质而提出，是一种具有广泛生物活性的调节蛋白质，几乎可以抑制敏感细胞感染的所有病毒。干扰素可以分I型、II型和α、β、γ三大类，其抗病毒作用以α、β最好，γ最差。流行常用的α干扰素又分α1、α2等等。不管哪一种α亚型，干扰素的治疗效果均较接近。从比活性方面分析，一种人工合成的组合干扰素活性最高，但按产生抗体的程度和疗效来看，最好的是天然a干扰素(纯度在98％以上者)，其次是α-1b和α-2b，其他则较差。总的来说，α干扰素治疗肝炎的效果还是有限的，最多为50％，一般为30～40％。因此科学家研究各种办法以提高a干扰素治疗肝炎的效果。注射用干扰素的主要类型为α-1b，α-2a，α-2b和γ，进口注射用干扰素主要来自罗氏和先灵公司的产品。国内目前生产注射用干扰素能力至少在2000万支以上，因此用量很大。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组复合干扰素工程菌的构建方法，旨在构建一种基因工程菌，使其能够遗传、复制。并在相应的条件下表达重组复合干扰素，提高α干扰素治疗肝炎的效果。
本发明提供的复合干扰素(Consensus Interferon，简称cIFN)是一种重组的I型干扰素，用于治疗乙肝和丙肝。其氨基酸数为166个，分子量为19,434道尔顿，而且，cIFN仅有20个氨基酸与IFNα-2a不同，即有88％的同源性；与IFNα-2b相比，仅有19个氨基酸有差别，有89％同源性。cIFN所含的氨基酸序列，是通过对几种天然α亚型干扰素序列的扫描，经重组DNA技术，把十多种α干扰素亚型蛋白质结构中每一位点上最常见的氨基酸序列排列成一复合序列而产生。在构造过程中，为了便于分子构造，另外对四个氨基酸作了改变，并用化学合成方法构造了一个对应的合成DNA序列。因其氨基酸来源于不同的α亚型干扰素，故名复合α干扰素。我们根据文献资料(Blatt LM，Davis JM，Klein SB，Taylor MW.The biologic activityand molecular characterization of a novel syntheticinterferon-alpha species，consensus interferon.Journal ofInterferon and Cytokine Research.1996；16489-499)cIFN的全序列为CDLPQTHSLG NRRALILLAQ MRRISPFSCL KDRHDFGFPQ EEFDGNQFQKAQAISVLHEM IQQTFNLFST KDSSAAWDES LLEKFYTELY QQLNDLEACVIQEVGVEETP LMNVDSILAV KKYFQRITLY LTEKKYSPCA WEVVRAEIMRSFSLSTNLQE RLRRKE，根据计算机优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，经计算机处理，获得自由能较低的一条DNA序列，利用重组技术构建带有上述cIFN cDNA的原核表达工程菌，化学热诱导表达后，经过多步骤分离纯化制得。工程菌名称BL21/pET-cIFN，菌株名称BL21。
本发明的目的通过如下技术方案实现的首先将含重组复合干扰素DNA序列的杂交质粒，转入大肠杆菌K12，进行扩增杂交质粒，经过培养传代筛选抗四环素但对氨卞青霉素敏感的细菌克隆，采用杂交翻译法挑选含有重组复合干扰素cDNA的克隆，将重组复合干扰素cDNA克隆转入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达。
本发明的优点是构建的基因工程菌能够在LB培养基或M9培养基中生长良好。产物以包含体形式存在于细胞内，外源基因最大表达量可占细胞总蛋白的50％。中试生产中，可以用乳糖代替IPTG作为诱导剂，不影响表达率，大大降低发酵成本。该工程菌所表达的产物，临床研究表明，对治疗病毒性肝炎疗效稳定，提高疗效。使用的剂量低，能有效减少副反应，在临床应用上更为广泛、更为方便。
具体实施例方式
(一)构造工程菌a.体外包装的λ噬菌体(含重组复合干扰素DNA序列的杂交质粒)感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑，使质粒进入细菌内。
b.将大肠杆菌K12在LB培养基上培养，让其复制、遗传、扩增。
c.根据重组体的表型进行筛选。
用抗四环素但对氨卞青霉素敏感的培养基对细菌克隆进行筛选。
d.对每一个翻译体系的克隆产物进行抗病毒的活性检测从cDNA文库分离特异cDNA克隆。
e.将重组复合干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达。
(二)发酵取一支工作种子批菌种接种于1000mlLB培养基中，置摇床30℃200rpm/min培养16-20小时，按5-8％的比例接种入发酵罐中，发酵控制条件温度30-35℃pH值7.0-4.0通气量3.0-4.0L/min溶解氧25-30％搅拌转数100-500rpm发酵至菌体达到一定浓度，加入IPTG至终浓度2mM，4小时后终止。菌体置-20℃冰箱保存。
(三)纯化a.细菌破碎取出菌体，1∶9(W/V)加入45mM UItra Pure三羟甲基氨基丙烷1mM乙二胺四乙酸二钠PH8.0缓冲液制成悬液，冰浴下超声10次，每次1min，间隔3min，功率500W，镜检应无完整细菌。
b.制备包含体将超声后悬液7000rpm离心20min，收集沉淀，加入2M盐酸胍、40mM UItra Pure三羟甲基氨基丙烷2mM乙二胺四乙酸二钠PH8.0缓冲液，制成悬液，室温下搅拌洗涤30min，4℃、7000rpm离心20min收集沉淀。加入40mM UItra Pure三羟甲基氨基丙烷2mM乙二胺四乙酸二钠PH8.0缓冲液，制成悬液，室温下搅拌洗涤30min，最后用10mMPB(磷酸盐缓冲液)PH7.2缓冲液搅拌洗涤沉淀一次，离心收集沉淀备用。
c.初步纯化制备的包含体中，1∶10加入6M盐酸胍、7mM C4H10O2S2(DTT)、1mMEDTA、40mMPB PH7.2的溶液，充分搅拌，直至包含体完全溶解。4℃、7000rpm离心20min，取上清，用8mMPB PH7.2缓冲液10倍稀释后，灌透析袋流水透析过夜。4℃7000rpm离心20min，收集上清加入1％体积的1M Tris PH7.5即为cIFN粗提液。
d.高度纯化①DEAE Sepharose(聚丙烯酰氨离子交换柱)离子交换层析层析柱为DEAE Sepharose FF阴离子交换填料，柱体积为200ml。柱子经1％缓冲液A平衡400ml后，将重组复合干扰素粗提液以20ml/min流速上样后，用0-100％缓冲液B/1％缓冲液A线形梯度洗脱，收集洗脱蛋白峰。
缓冲液A1M Tris PH7.5缓冲液B1M NaCl②凝胶过滤层析柱为Sephacryl S-200HP，柱体积为1800ml，柱子经PBS缓冲液(每升含NaH2PO40.4g、NaCl 6g，PH7.0)平衡4000ml后，将DEAE Sepharose洗脱液经超滤浓缩至20-60ml，上样，流速为90ml/h。收集蛋白峰，即为半成品原液。
(四)制剂工艺a.用稀释液(PBS)将半成品原液稀释至合适浓度，用0.22um孔径滤膜除菌过滤，无菌分装入西林瓶中，轧盖，4℃保存。
b.稀释液(PBS)每升含NaH2PO40.4g、NaCl 6g，加少量注射用水溶解，用6NaOH调PH7.0±0.2，加注射用水定容。
本发明经过如下实验(一)体外实验a.抗病毒活性方面在HBV病毒感染的细胞中重组复合干扰素的特异活性≥3×109U/mg蛋白质，而其他干扰素α亚型为≤2×108U/mg蛋白质。
b.抗增殖活性重组复合干扰素和干扰素α对人肾癌细胞(KU-2、OS-RC-2、ACHN细胞)，人多骨髓瘤细胞(RPMI8226、ARH-77细胞)，人慢性髓性白血症(K562、KU-812细胞)，人急性黑素瘤细胞(A375细胞)，人Burkitt淋巴瘤细胞(Daudi细胞)，人急性淋巴母细胞性白血病(CCRF-HSB-2)的直接抗增殖作用进行了研究。IC50值(是指与未治疗细胞比，增殖肿瘤细胞引起50％的抑制率)在0.0107和535μg/L之间，表明在大多数细胞中重组复合干扰素的抗增殖能力比干扰素α大(约1.9-260倍)。例外的是KU-2和CCRF-HSB-2细胞，干扰素α表现出比重组复合干扰素更强的抗增殖能力(分别为3.9和1.7倍)。
c.激活自然杀伤细胞活性重组复合干扰素激活自然杀伤细胞的能力比其他干扰素亚型强。在外周血液淋巴细胞中，用K562细胞作为靶细胞，用以比较重组复合干扰素的细胞毒活性，得到结果为38.3％；干扰素α-Ly为26.3％，干扰素α-2为27.9％，干扰素α-2a1为22.3％。
d.诱导干扰素刺激基因I型干扰素结合到细胞表面受体可以引导细胞内20多种基因的合成。这些基因被称为I型干扰素诱导基因(ISGs)。在人Daudi细胞中，可以观察到重组复合干扰素和干扰素α-2a表达出3种ISGs干扰素应答因子1(IRF-1)，微球蛋白α，p68激酶蛋白质。在用干扰素治疗后的0.5，2，4，8，24小时，可以从治疗细胞中提取出全部RNA。
除此之外，重组复合干扰素还可以以更低的浓度诱导类2′，5′-OAS(2′，5-寡腺苷酸合成酶OAS)的活性。在K562细胞中，用10U/ml四种不同亚型的干扰素α治疗后19小时，2′，5′-OAS高于正常水平40pmol/h，分别为重组复合干扰素635pmol/h，干扰素α-2a1603pmol/h，干扰素α-Ly 453pmol/h，干扰素α-2482pmol/h。
e.结合特性通过重组复合干扰素和干扰素α-2b对K562细胞进行的双相Scatchard图研究表明，细胞中确实存在多个独立的结合位点。对平衡解离常数(Kd，其值分别为0.39×10-11对1.07×10-11)和低亲和结合位点(1.08×10-9对3.36×10-9)的研究表明，重组复合干扰素的受体亲和力强于干扰素α-2b。另外，重组复合干扰素的结合受体数(180对160)和继发性结合位点(81，310对69，959)比干扰素α2b多。然而重组复合干扰素和干扰素α-2b对细胞的内化作用并无明显差别，这样说明两者之间的生物学活性差异是由于细胞表面结合特性的差异而引起的。
(二)体内实验重组复合干扰素的抗病毒活性用体内HSV-2感染的金黄色叙里亚仓鼠的死亡率来表示。106病毒单位的重组复合干扰素和干扰素α-2a1保护动物的能力分别达到95％和75％。三种不同的重组复合干扰素治疗方案(感染前6小时、感染后10小时腹膜治疗和6小时与120小时之间)可以有效地保护受感染的叙里亚仓鼠，有效率分别为73％，60％，87％；而未经治疗的存活率仅为7％。重组复合干扰素也表现出抗人肾癌细胞(ACHN和OS-RC-2细胞)的抗肿瘤活性。
权利要求
1.一种重组复合干扰素工程菌的构建方法，其特征是将含重组复合干扰素DNA序列的杂交质粒，转入大肠杆菌K12，进行扩增杂交质粒，经过培养传代筛选抗四环素但对氨卞青霉素敏感的细菌克隆，采用杂交翻译法挑选含有重组复合干扰素cDNA的克隆，将重组复合干扰素cDNA克隆转入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达。
全文摘要
一种重组复合干扰素工程菌的构建方法，其特征是将含重组复合干扰素DNA序列的杂交质粒，转入大肠杆菌K12，进行扩增杂交质粒，经过筛选抗四环素但对氨卞青霉素敏感的细菌克隆，采用杂交翻译法挑选含有重组复合干扰素cDNA的克隆，将重组复合干扰素cDNA克隆转入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达。本发明的优点是构建的基因工程菌能够在LB培养基或M9培养基中生长良好。产物以包含体形式存在于细胞内，外源基因最大表达量可占细胞总蛋白的50％。生产中，可以用乳糖作为诱导剂，降低发酵成本。该工程菌所表达的产物，临床研究表明，对治疗病毒性肝炎疗效稳定，提高疗效，使用的剂量低，减少副反应，使用上更为广泛和方便。
文档编号C12N15/70GK1727470SQ200410021560
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月27日 优先权日2004年7月27日
发明者陈林生, 时彪 申请人:辽宁卫星生物制品研究所(有限公司)