专利名称：单个核细胞白细胞相容性抗原a和b特异核糖核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、免疫学检测领域，具体说是一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法。
背景技术：
通过检测人外周血单个核细胞，所含HLA-I特异核糖核酸的含量，用以评估人体的免疫力高低的方法，在临床常用的CD4+/CD8+比值，它的敏感性和特异性均不能满足临床需求，近几年发展的流式细胞术，测定HLA-I蛋白，影响因素较多，其评估值较难真实反映其客观性。其它LDH释放试验、MTT试验也不适合于临床上的监测。为此，国际上曾开展过有关细胞免疫标志性指标的讨论，至今仍无法定论。
发明内容
本发明目的是，提供一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，通过其检测结果评估人体的免疫力，提高肿瘤的诊治水平，依此筛选对肿瘤患者生物治疗的药物或方法等，对尚未有临床症状的人群，寻求提高细胞免疫力的中草药等。
本发明为了完成发明目的，提供以下技术方案首先抽取外周血，提取淋巴细胞(PBL)，然后对淋巴细胞总RNA进行鉴定，当可见5s，18s，28s，三条清晰条带时，可用于逆转录聚合酶链反应，使逆转录聚合酶链反应体系为25ul，其中逆转录酶1ul，随机引物1ul，Taq酶0.2ul，上下游引物各是0.4ul，其中HLA-B和HLA-A引物均是4对，使用其中任何一对均可，其中RNA是10ul，得出多聚酶链反应参数是42℃30min，95℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，5个循环，94℃10sec，60℃40sec，40个循环，72℃5min，对扩增产物电泳扫描及序列分析，最后进行荧光定量检测，即以引物为基础合成荧光探针，建立荧光定量逆转录聚合酶链反应，获得检测结果。HLA-B引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′，下游引物5′-AGA GCC CTG GGCACT GTC GCT-3′。上游引物5′-GGG CAG CTG TGG TGC CT-3′，下游引物是5′-CACTGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′。HLA-B引物是上游引物5′-CTG CCG AAG CCCCTC ACC CTCT-3′，下游引物是5′-AGG ACC AGA CCC AGG ACA-3′。HLA-B引物是上游引物5′-GCC GTC TTC CCA GTC CAC CGT-3′，下游引物是5′-ATG CCCACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′，下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-ATGAGGCGGAGCAGTTGA-3′，下游引物5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GAGGCGGAGCAGTTGAGA-3′，下游引物5′-GGAAGGGCAGGAACAACTC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GGAGGACCAGACCCAGGACA-3′，下游引物5’-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3’。本发明所述的引物，其中HLA-B有一对最佳引物，即上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′，下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。HLA-A有一对最佳引物，即HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′，下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。其它各对引物均可达到本发明所述的检测结果。
本发明通过研究、临床及试验得出单个核细胞的HLA-A和HLA-B是个很好的评估细胞免疫力的指标，肿瘤病人敏感性和特异性均为80％以上，远高于其他指标。采用本发明检测方法，检测结果是用1-2％琼脂糖凝胶电泳，正常人在287bp处可见明显亮带，免疫力低的人群则明显减弱或缺失，以此结果，可以判断是否是肿瘤患者，若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法，可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果，对尚未有临床症状的人群，提供应当增强免疫力的警示，对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本发明可以普遍应用于健康查体。
具体实施例方式
一、外周血淋巴细胞(PBL)的提取1.一次性注射器无菌抽取2ml外周血于含有EDTA-K2抗凝剂的无菌试管中。
2.4小时内分离血浆，3000r/min离心5分钟(普通离心机)，以无菌吸管吸取白细胞层，加入盛有2ml生理盐水的无菌管中稀释，沿管壁缓慢加入盛有2ml淋巴细胞分离液的无菌管中(所有器材预先均用DEPC水处理)。
3.3000r/min离心(普通离心机)25分钟，以无菌吸管小心吸取单个核细胞层至一灭菌EP管中，3500r/min离心(普通离心机)4分钟，吸弃上清液。
4.加入0.5ml红细胞裂解液溶解其中少量残余红细胞，3500r/min离心(普通离心机)4分钟，吸弃上清液，加50μl TE水溶解沉淀。
5.另取一灭菌EP管加入150μl白细胞裂解液，加入50μl上述溶解的单个核细胞，反复吹打。然后加入-20℃预冷的氯仿50μl，颠倒混匀。
6.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，小心吸取上清加入盛有100μl预致冷异丙醇的EP管中，颠倒混匀。
7.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，弃上清(注意标记离心方向)，吸水纸上吸干，加300μl预致冷的75％乙醇，轻轻混匀。
8.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，弃上清(注意标记离心方向)，吸水纸上吸干，4000r/min离心(高速冷冻离心机)10秒钟，以无菌吸头吸干残液。
9.加入适量的DEPC水溶解RNA，2000r/min离心(台式高速离心机)5秒钟，将管壁残余液体甩至底部。
二、外周血淋巴细胞总RNA的鉴定提取的外周血淋巴细胞总RNA，在紫外分光光度计上测定RNA的吸光度，将提取的RNA在1.5％低熔点琼脂糖凝胶变性电泳，可见5s，18s，28s三条清晰条带，表明所提RNA浓度较纯，且RNA完整无裂解，可用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
三、优化后的聚合酶链反应(PCR)扩增体系逆转录反应体系25μl，其中逆转录酶1μl，随机引物1μl，Taq酶0.2μl，上、下游引物各是0.4μl，以脱氧核苷酸为原料，在DNA合成仪上合成引物序。本发明所述的引物，HLA-B最佳引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′；下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。等同效果的引物是上游引物15′-GGG CAG CTG TGGTGC CT-3′；25′-CTG CCG AAG CCC CTC ACC CTCT-3′；35′-GCC GTC TTC CCA GTCCAC CGT-3′。下游引物1′5′-CAC TGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′；2′5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’；3′5′-ATG CCC ACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A最佳引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′；下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。等同效果的引物是上游引物15′-ATGAGGCGGAGCAGTTGA-3′；25′-GAGGCGGAGCAGTTGAGA-3′；35′-GGAGGACCAGACCCAGGACA-3′。下游引物1′5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′；2′5′-GGAAGGGCAGGAACAACTC-3′；3′5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′。上述引物HLA-B等同引物的上下游引物的组合是1和1′，2和2′，3和3′，HLA-B等同引物的上下游引物的组合是1和1′，2和2′，3和3′，有效的组合是上游引物1和下游引物3′，上游引物2分别和下游引物1′、2′，上游引物3分别和下游引物1′、2′。RNA 10μl。PCR反应参数为42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，5个循环，94℃ 10sec，60℃ 40sec，40个循环，72℃ 5min。
四、扩增产物的电泳扫描及序列分析扩增产物电泳扫描及序列分析PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统上扫描分析。HLA-A、B cDNA在全自动测序仪上测序，并用Blastn服务器对序列进行查询和比较。
五、荧光定量检测以上述引物为基础合成的荧光探针建立的荧光定量逆转录聚合酶链反应检测外周血淋巴细胞HLA-A、BmRNA方法得到的检测结果是1-2％琼脂糖凝胶电泳，正常人在287bp处可见明显亮带，免疫力低的人群则明显减弱或缺失，以此结果为肿瘤患者提供诊断指标及选择治疗药物或方法，对尚未有临床症状的人群，提供应当增强免疫力的警示。
权利要求
1.单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，首先抽取外周血，提取淋巴细胞(PBL)，然后对淋巴细胞总RNA进行鉴定，当可见5s，18s，28s，三条清晰条带时，可用于逆转录聚合酶链反应，其特征在于使逆转录聚合酶链反应体系为25ul，其中逆转录酶1ul，随机引物1ul，Taq酶0.2ul，上下游引物各是0.4ul，其中HLA-B和HLA-A引物均是4对，使用其中任何一对均可，其中RNA是10ul，得出多聚酶链反应参数是42℃30min，95℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，5个循环，94℃10sec，60℃40sec，40个循环，72℃5min，对扩增产物电泳扫描及序列分析，最后进行荧光定量检测，即以引物为基础合成荧光探针，建立荧光定量逆转录聚合酶链反应，获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-B引物是上游引物5′-CAC ACT GACCTG GCA GCG GGAT-3′，下游引物5′-AGA GCC CTG GGC ACT GTC GCT-3′。
3.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-B引物是上游引物5′-GGG CAG CTGTGG TGC CT-3′，下游引物是5′-CAC TGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′。
4.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-B引物是上游引物5′-CTG CCG AAGCCC CTC ACC CTCT-3′，下游引物是5′-AGG ACC AGA CCC AGG ACA-3′。
5.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-B引物是上游引物5′-GCC GTC TTCCCA GTC CAC CGT-3′，下游引物是5′-ATG CCC ACG ATG GGG ACG GT-3′。
6.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′，下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。
7.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-A引物是上游引物5′-ATGAGGCGGAGCAGTTGA-3′，下游引物5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′。
8.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-A引物是上游引物5′-GAGGCGGAGCAGTTGAGA-3′，下游引物5′-GGAAGGGCAGGAACAACTC-3′。
9.根据权利要求1所述的单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，其特征在于HLA-A引物是上游引物5′GGAGGACCAGACCCAGGACA-3′，下游引物5’-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3’。
全文摘要
本发明是单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，一、外周血淋巴细胞(PBL)的提取，二、外周血淋巴细胞总RNA的鉴定，三、优化后的聚合酶链反应(PCR)扩增体系，四、扩增产物的电泳扫描及序列分析，五、荧光定量检测。采用本发明检测方法，检测结果是用1－2％琼脂糖凝胶电泳，正常人在287bp处可见明显亮带，免疫力低的人群则明显减弱或缺失，以此结果，可以判断是否是肿瘤患者，若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法，可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果，对尚未有临床症状的人群，提供应当增强免疫力的警示，对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本发明可以普遍应用于健康查体。
文档编号C12Q1/68GK1570147SQ20041002407
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月8日 优先权日2004年5月8日
发明者邹雄, 张义, 杨晓静 申请人:山东大学齐鲁医院