专利名称：一种蒙古黄芪异黄酮合成酶基因及其全长cDNA序列的制作方法
所属领域本发明涉及一种在蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus)中表达的异黄酮合成酶基因及其核苷酸序列，即蒙古黄芪异黄酮合成酶(Astragalusmembranaceus Bge.var.mongholicus 2-Hydroisoflavone Synthase，AMIFS)的基因及其核苷酸序列。
背景技术：
异黄酮是豆科(Leguminosae)植物抗微生物的植保素，参与防御病原体的侵染；一些异黄酮类化合物能够阻止害虫的侵食(Phytochemistry，1986，25979-995；PhysiolPlant，1995385-392)。异黄酮在豆科植物与土壤微生物形成根瘤菌的早期反应中起信号作用(Annu Rev Phytopathol，1995，33345-368)。同时，异黄酮对人体有很多的好处，引起了人们的广泛关注，如抗肿瘤(J Natl Cancer Inst，1991，83541-546)、防治冠状心脏病(BioFactors，2000，12209-215)、减轻更年期综合症(International Journalof Gynecology & Obstetrics，1995，5163-64)和预防骨质疏松症(Menopause，1998，59-15)等；近20年来异黄酮在生物学方面的应用研究发展迅速。
异黄酮是苯丙氨酸代谢分枝途径中的次生代谢物。在异黄酮合成中最关键的环节是类黄酮代谢进入异黄酮代谢的反应步骤，该步骤由异黄酮合成酶催化。蒙古黄芪异黄酮合成酶是蒙古黄芪异黄酮合成的催化酶，在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因及其核苷酸序列。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因及其全长cDNA序列。
在本发明中，“分离的”cDNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在产生本发明的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因时，可以将蒙古黄芪异黄酮合成酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长cDNA序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
获得有关的序列后，用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的核苷酸序列。然后，可将该核苷酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
表2为本发明的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因与大豆异黄酮合成酶基因全长cDNA序列(GenBank Accession No.AF195798)的同源比较图。
下面结合具体步骤，进一步阐述本发明。应理解，这些步骤仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》、《实验室手册》(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤1蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的克隆1.组织分离(isolation)
蒙古黄芪种子来源于山西农业大学，经25℃暗培养4d，用10mmol/L还原型谷光甘肽诱导10h后，取其根部，用液氮速冻。
2.总RNA的分离(total RNA isolation)和检测取根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，电泳图谱呈现出3条清晰可区分的条带，其中28SRNA∶18S RNA比值约为2∶1，表明总RNA基本上未降解，可用于蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长克隆。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行(1).RT-PCR根据大豆和其它豆科植物异黄酮合成酶基因的核苷酸保守序列，设计保守引物RT-F(SEQ ID NO.1)和RT-R(SEQ ID NO.2)，采用RT-PCR的方法(TaKaRa试剂盒)，得到1995PX1(673bp)连接到T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列与己知豆科植物如大豆(Glycinemax)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和刺甘草(Glycyrrhiza echinata)的异黄酮合成酶基因的同源性分别为81％、84％、84％，故初步认为它是一个异黄酮合成酶基因。
(2).3′-RACEAP反转录总RNA，得到第一链cDNA，PCR(AUAP+1995PXF1(SEQ ID NO.3))得到1995PX1(898bp)，其它过程同(1)所示，测序结果已有的数据库(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列与已知豆科植物如大豆、鹰嘴豆和豌豆(Pisum sativum)的异黄酮合成酶基因的同源性分别为83％、83％、82％，故可进一步确认它是一个异黄酮合成酶基因。
(3).5′-RACE第一轮PCR(AAP+1995PR1(SEQ ID NO.4))第二轮PCR(AUAP+1995PR2(SEQ ID NO.5))得到1995PX 2(970bp)其它过程如同(1)所示。
(4).PCR扩增1995PX编码区通过组合使用上述3种方法，拼接候选的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的全长cDNA序列，在该序列(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物F15′-ATGTTGTTAGAACTTGCAGTAAC-3′(SEQ ID NO.6)为正向引物，寡核苷酸R15′-TCAAGAGGAAAGGAGTTTAGTC-3′(SEQ ID NO.7)为反向引物，以总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的Pyrobest酶，进行PCR扩增，F1/R1的PCR条件为94℃4min，随之以94℃1min、58℃1min和72℃1min 30sec进行35个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1,578bp。(其它过程同(1))。
因此，组合上述4种方法得到的结果，获得了蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的全长cDNA序列(表1)。
BLAST的结果证明从蒙古黄芪中新得到的基因确为一个异黄酮合成酶基因。由于已知的同源异黄酮合成酶能够催化黄烷酮生成异黄酮，故推测此基因具有相同的功能。
步骤2蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的序列信息与同源性分析本发明新的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长cDNA的长度为1,995bp，详细序列见表1，其中开放读框位于106-1684位核苷酸。将蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果发现它与大豆异黄酮合成酶基因(GenBank Accession No.AF195798)在核苷酸水平上有81％的相同性(表2)，可以认为两者在功能上有很高相似性。
步骤3蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的功能分析在该步骤中，将全长蒙古黄芪异黄酮合成酶的编码序列构建入酵母真核表达载体之中，以分析该基因的功能。
1.酵母表达载体的构建依据蒙古黄芪异黄酮合成酶的全长cDNA序列(表1)，设计扩增出完整开放阅读框的引物，分别在正、反引物上分别引入限制性内切酶位点HindIII和Xba I(根据酵母表达质粒pYES2和蒙古黄芪异黄酮合成酶的全长cDNA序列而定)。以步骤1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，保证蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的阅读框完全正确，并用HindIII和Xba I内切酶进行37℃酶切3h，回收目的片段1,595bp；酵母表达载体pYES2(Invitrogen)用HindIII和Xba I内切酶37℃酶切3h，回收目的片段5,806bp。将经酶切的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的目的片段克隆至酶切过的pYES2表达载体上，转化大肠杆菌TOP 10F’，37℃培养20h，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。
2.变性鲑精DNA的制备1)溶解1g的鲑精DNA于100ml 1×TE中，并用10ml的枪头不断上下吸取促进完全溶解。
2)4℃过夜。
3)用大探头、3/4功率超声波处理两次，共30sec，处理过的鲑精DNA片段大约为7Kb。
4)等分超声波处理过的DNA到4个新的50ml的离心管中。
5)用25mlTE饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次。
6)重力离心力10,000g，4℃离心5min，取上清液到另一新的50ml的离心管中。
7)用25ml氯仿抽提，重力离心力10,000g，4℃离心5min，吸取上清液到250ml离心瓶中。
8)加入5ml 3M醋酸钠(pH＝6.0)和125ml-20℃预冷的95％乙醇沉淀DNA。
9)重力离心力12,000g，4℃离心15min。
10)用200ml 70％乙醇洗涤一次，重力离心力12,000g，4℃离心15min。
11)在空气或真空离心蒸发浓缩器中干燥DNA 20min。
12)转移DNA到250ml无菌的烧瓶中，用100ml无菌的1×TE溶解DNA。
13)煮沸DNA 20min以变性DNA，立即置于冰上，小等分变性的鲑精DNA，-20℃保存。
3.酵母遗传转化1)接种单克隆的INVSc1入10ml的YPD培养基，30℃摇菌过夜。
2)测定过夜培养酵母菌液的OD600值，稀释菌液浓度至OD600＝0.4，继续摇菌2-4h。
3)转速2,500rpm，室温离心10min，用40ml 1×TE重悬。
4)转速2,500rpm，室温离心10min，用2ml 1×LiAc/0.5×TE重悬，室温温浴10min。
5)取100ul酵母悬浮液，加入1ug含目的基因的重组质粒和100ug变性的切割的鲑精DNA。
6)加入700ul 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE混匀。
7)30℃温浴30min。
8)加入88ul DMSO混匀，42℃热击7min。
9)小离心机离心10sec，弃上清，用1ml 1×TE重悬。
10)小离心机离心10sec，用50-100ul 1×TE重悬，涂布于选择培养基SC-U上。
4.蒙古黄芪异黄酮合成酶的诱导表达1)挑取含目的基因的酵母菌INVSc1到SC-U培养基(含2％棉子糖)中，30℃摇菌过夜。
2)测量菌液的OD600值，计算稀释到50ml诱导培养基中、菌液的OD600＝0.4所需步骤1的菌液量。
3)吸取步骤2计算出来的过夜酵母菌液量，重力离心力1,500g，4℃离心5min。
4)用1-2ml诱导培养基(SC-U培养基含2％半乳糖)重悬酵母菌，接种到50ml诱导培养基中，30℃摇菌。
5)0、2、4、6、8、10h后分别吸取5ml的酵母菌液，测量每个样品的OD600值。
6)重力离心力1,500g，4℃离心5min。
7)弃上清，用500ul无菌水重悬酵母菌。
8)移取酵母菌液到1.5ml离心管中，在小离心机中最高转速离心30sec。
9)弃上清，-80℃保存，或继续下一步实验以裂解酵母菌、检测重组蛋白。
5.蒙古黄芪异黄酮合成酶的检测1)取上一步的酵母细胞，加500ul裂解缓冲液重悬，重力离心力1,500g，4℃离心5min。
2)弃上清，用裂解缓冲液重悬至OD600＝50-100。
3)加入等体积的酸洗玻璃珠。
4)漩涡混匀30sec，然后至冰上30sec，重复4次以裂解酵母细胞，同时可以吸取小量的细胞在显微镜下检测裂解的程度。
5)在小离心机上最大速度离心10min。
6)吸取上清液到一新的小离心管中。
7)加入SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸样品5min。
8)以BSA作为标样，取20ug裂解物进行SDS-PAGE电泳。
6.酵母微粒体的制备1)取上一步检测得到蒙古黄芪异黄酮合成酶含量最高的酵母菌，用消解酶20T消化成原生质球。
2)酵母原生质球在4℃下用玻璃珠和buffer A进行裂解。
3)裂解物连续用重力离心力10,000g和15,000g各离心10min。
4)取上清液，重力离心力160,000g，4℃超速离心90min。
5)沉淀用bufferA重悬，约1.5-2.5mg/ml蛋白。
7.蒙古黄芪异黄酮合成酶活性的分析1)取上述1ml的蛋白酶液，加入30ul含670-1670Bq甘草根廷配基的β-巯基乙醇和20ul的NADPH。
2)25℃温浴2h，加入30ul乙酸终止反应。
3)乙酸乙酯提取反应混合液，然后用高效液相色谱进行酶活分析，CLC-ODS柱(6.0×150mm)，40％(V/V)甲醇作为流动相，流速1ml/min，柱温40℃，λ＝285nm检测大豆黄素是否存在。
本发明涉及的记号及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TGTGCCCTTGGAACTGTGAG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性
(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CTGAGGACGAGACCATGGAGA(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1AGCACGAGAGGAGGTTGACAC(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4GAGAAGAAATCCACAACAAGACC(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸
(iii).序列描述SEQ ID NO.5TCTCCATGGTCTCGTCCTCAG(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGTTGTTAGAACTTGCAGTAAC(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.7TCAAGAGGAAAGGAGTTTAGTC
表1、蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长序列表<110>福建农林大学<120>蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长序列表<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>1995<212>DNA<213>蒙古黄芪(Astragalus membranaceus)<221>gene<222>(1)…(1995)<400>Full length sequence of isoflavone synthase gene from Astragalus membranaceus1CAAAAACACA AAATCCTACT AGCTGTTTAG CCTCAACAGA CTCGAGACTCTTACTTGTTC GTTCCTATAG CAAGTTAATT AATTAATTTA GCAAAATCAA101 AGACGATGTT GTTAGAACTT GCAGTAACTC TATTGGTGAT AGCTCTCTTCATACACCTTC GTCCCACACC TTCTGCAAAA TCAAAGGCTC TTCGCCACCT201 TCCTAATCCT CCAAGTCCTA AACCTCGTCT CCCTTTCATT GGCCACCTTCACCTATTGGA CAAACCTCTT CTTCATCAAT CTCTCATCCG TCTAGGTGAA301 CGCTATGGCC CTTTGTACTC TCTCTACTTT GGCTCCATGC CTTGCGTTGTTGCATCCACC CCTGAACTGT TCAAACTCTT TCTTCAAACC CATGAGGCTT401 CTTCCTTTAA TACCAGGTTC CAAACCTCTG CTATTAGACG CCTCACCTATGATAACTCTG TTGCCATGGT TCCCTTTGGA CCTTACTGGA AGTTCATTAG501 GAAGCTCATC ATGAATGACC TTCTCAACGC CACCACTGTC AACAAGTTGAGGCCTTTGAG GAGCCAGGAA ATCCGTAAGG TTCTTAATGT CATGGCAAAG601 AGTGCTGAGG CTCAGCAGCC CCTCAATGTT ACCGAGGAGC TTCTCAAGTGGACCAATAGC ACCATCTCTA GGATGATGTT GGGTGAAGCT GAAGAGATTA701 GAGATATTGC TCGTGATGTG CTTAAGATCT TTGGGGAGTA TAGTCTTACAGACTTCATTT GGCCATTGAA GAAGTTCAAG GTTGGGCAGT ATGAGAAGAG801 AATTGACGAT ATTTTCAACA GGTTTGATCC TGTGATTGAG AAGGTCATCAAGAAACGCCA AGAGATAATC AAGAGAAGAA AGGAGAGAAA TGGAGAACTT901 GAAGAGGGTG AGCAGAGTGT AGTGTTTCTC GATACTTTGC TTCAATATGCTGAGGACGAG ACGATGGAGA TCAAAATTAC CAAAGAACAA ATCAAGGGTC1001 TTGTTGTGGA TTTCTTCTCT GCTGGAACGG ATTCAACCGC CGTCGCAACAGATTATGCTT TGGCGGAGCT GATCAACAAC CCCAAGGTCC TTAGAAAAGC1101 ACGAGAGGAG GTTGACACGG TTGTGGGAAA AGATAGACTG GTTGATGAAT
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1020 TGCTGGAACGGATTCAACCGCCGTCGCAACAGATTATGCTTTGGCGGAGCTGATCAACAA||| || || ||||| || || || |||||||| | || ||||| ||||| ||||||||975 TGCAGGGACAGATTCCACAGCGGTGGCAACAGAGTGGGCATTGGCAGAGCTCATCAACAA1080 CCCCAAGGTCCTTAGAAAAGCACGAGAGGAGGTTGACACGGTTGTGGGAAAAGATAGACT|||| ||| | ||| || || |||||||| ||| |||||||| |||||||||||1035 TCCCAGGGTGTTGCAAAAGGCTCGTGAGGAGGTCTACAGTGTTGTGGGCAAAGATAGACT1140 GGTTGATGAATCAGATGTTCAACATCTTCATTACATTAGAGCTATTGTGAAGGAGACATT||||| ||| || |||| | |||| ||||||||| || |||||||||||||||||1095 CGTTGACGAAGTTGACACTCAAAACCTTCCTTACATTAGGGCCATTGTGAAGGAGACATT1200 CCGTATGCACCCACCACTGCCCGTTGTGAAAAGAAAGTGTACACAAGACTGTGAGATCGA||| |||||||||||||| || || || ||||||||||| ||| |||| |||||||| |1155 CCGAATGCACCCACCACTCCCAGTGGTCAAAAGAAAGTGCACAGAAGAGTGTGAGATTAA1260 CGGCTTTGTCATCCCAGAGGGAGCACTGATACTTTTCAATGTTTGGGCCGTTGGAAGAGA|| | ||| ||||||||||||||| || | ||||||||||||||| || ||||| ||1215 TGGGTATGTGATCCCAGAGGGAGCATTGGTTCTTTTCAATGTTTGGCAAGTAGGAAGGGA1320 TCCAAAGTACTGGGATAGGCCCTCAGAATTTCTTCCTGAGAGATTTTTAGAAAAAGCCGG|| || |||||||| || || |||||||| | ||| ||||| || ||||||| ||1275 CCCCAAATACTGGGACAGACCATCAGAATTCCGTCCCGAGAGGTTCTTAGAAACT...GG1380 TGGTGAAGGGGAAGTAGGTCCGATTGATCTTAGGGGTCAACATTTCCAACTTTTGCCATT|| ||||||||||| ||| || ||||||||||||| || ||||||||||| | |||||1332 TGCTGAAGGGGAAGCAGGGCCTCTTGATCTTAGGGGCCAGCATTTCCAACTCCTCCCATT1440 TGGGTCTGGTAGGAGGATGTGCCCGGGAGTAAATTTGGCTACTGCTGGAATGGCCACGCT||||||||| ||||| |||||||| || || |||||||||||| | |||||||| || ||1392 TGGGTCTGGGAGGAGAATGTGCCCTGGTGTCAATTTGGCTACTTCAGGAATGGCAACACT1500 GCTTGCATCCGTTATCCAAACCTTTGATCTACAGGTACCAGGCCCACAAGGCCAAATATT|||||||| |||||||| |||||| || || || | ||||| ||||| ||||||||1452 TCTTGCATCTCTTATCCAATGCTTTGACCTGCAAGTGCTGGGCCCTCAAGGACAAATATT1560 AAAAGGAGATGAGGCTAAGGTTAGCATGGAAGAAAGAGCTGGTCTCACTGTTCCAAGGGC||||| ||||| || || |||||||||||||| |||||||| ||||| |||||||||||1512 GAAAGGTGATGATGCCAAAGTTAGCATGGAAGAGAGAGCTGGCCTCACAGTTCCAAGGGC1620 ACATAATCTCATCTGTGTTCCGCTTGCAAGAGCAGGTGTCGCAGCTAAACTCCTTTCCTC||||| |||| | |||||||| |||||||||| || ||| ||||||||||||| |1572 ACATAGTCTCGTTTGTGTTCCACTTGCAAGGATCGGCGTTGCATCTAAACTCCTTTCTTA1680 TTGAAACCTACAACAAAAAAGACAAGAATAATGATGTCATGGAAGATGTTATTTTATAAT
| ||| | | | | | || | | || ||| | || || | |||||1632 ATTAAGATAATCATCATATACAATAGTAGTGTCTTGCCATCGCAGTTGCTTTTTATGTAT1740 TTATATATGTTTTGTAGTAATACTCATTTTCAATAAGGCGTCATTAATTAAGAGACAATG| |||| | || | |1692 TCATAATCATCATTTCAATAAGGTGTGACTGGTACT........................
1800 AGTCCAAGCCACGACACCCACAGGATGTTGTTGGAAGAGACACGTATATGCATAGTCTCA1728 ............................................................
1860 ACTAGTCTCTCTTGTTATACAATGTACTTCTTTTTTAGTCACAAATGAAAATTGTTGCAA1728 ............................................................
1920 CTTCTATTTGTATTTTTAAGGGCATATCCACTAATACTACAATCTTGGTTTATCTCTACA|||| ||| |||| |1728 ..............................TAATCAAGTAATTAAGGTTACATACATGC1980 AAAAAAAAAAAAAAAA||||||||||||||||1757 AAAAAAAAAAAAAAAAAA上列蒙古黄芪异黄酮合成酶的核酸序列下列大豆异黄酮合成酶的核酸序列(GenBank Accession No.AF195798)
权利要求
1.一种蒙古黄芪异黄酮合成酶基因，其特征是从蒙古黄芪克隆分离而得，该基因的全长cDNA长度为1,995bp，其中开放阅读框位于106-1684位核苷酸，详细序列为1 CAAAAACACA AAATCCTACT AGCTGTTTAG CCTCAACAGA CTCGAGACTC51TTACTTGTTC GTTCCTATAG CAAGTTAATT AATTAATTTA GCAAAATCAA101 AGACGATGTT GTTAGAACTT GCAGTAACTC TATTGGTGAT AGCTCTCTTC151 ATACACCTTC GTCCCACACC TTCTGCAAAA TCAAAGGCTC TTCGCCACCT201 TCCTAATCCT CCAAGTCCTA AACCTCGTCT CCCTTTCATT GGCCACCTTC251 ACCTATTGGA CAAACCTCTT CTTCATCAAT CTCTCATCCG TCTAGGTGAA301 CGCTATGGCC CTTTGTACTC TCTCTACTTT GGCTCCATGC CTTGCGTTGT351 TGCATCCACC CCTGAACTGT TCAAACTCTT TCTTCAAACC CATGAGGCTT401 CTTCCTTTAA TACCAGGTTC CAAACCTCTG CTATTAGACG CCTCACCTAT451 GATAACTCTG TTGCCATGGT TCCCTTTGGA CCTTACTGGA AGTTCATTAG501 GAAGCTCATC ATGAATGACC TTCTCAACGC CACCACTGTC AACAAGTTGA551 GGCCTTTGAG GAGCCAGGAA ATCCGTAAGG TTCTTAATGT CATGGCAAAG601 AGTGCTGAGG CTCAGCAGCC CCTCAATGTT ACCGAGGAGC TTCTCAAGTG651 GACCAATAGC ACCATCTCTA GGATGATGTT GGGTGAAGCT GAAGAGATTA701 GAGATATTGC TCGTGATGTG CTTAAGATCT TTGGGGAGTA TAGTCTTACA751 GACTTCATTT GGCCATTGAA GAAGTTCAAG GTTGGGCAGT ATGAGAAGAG801 AATTGACGAT ATTTTCAACA GGTTTGATCC TGTGATTGAG AAGGTCATCA851 AGAAACGCCA AGAGATAATC AAGAGAAGAA AGGAGAGAAA TGGAGAACTT901 GAAGAGGGTG AGCAGAGTGT AGTGTTTCTC GATACTTTGC TTCAATATGC951 TGAGGACGAG ACGATGGAGA TCAAAATTAC CAAAGAACAA ATCAAGGGTC1001 TTGTTGTGGA TTTCTTCTCT GCTGGAACGG ATTCAACCGC CGTCGCAACA1051 GATTATGCTT TGGCGGAGCT GATCAACAAC CCCAAGGTCC TTAGAAAAGC1101 ACGAGAGGAG GTTGACACGG TTGTGGGAAA AGATAGACTG GTTGATGAAT1151 CAGATGTTCA ACATCTTCAT TACATTAGAG CTATTGTGAA GGAGACATTC1201 CGTATGCACC CACCACTGCC CGTTGTGAAA AGAAAGTGTA CACAAGACTG1251 TGAGATCGAC GGCTTTGTCA TCCCAGAGGG AGCACTGATA CTTTTCAATG1301 TTTGGGCCGT TGGAAGAGAT CCAAAGTACT GGGATAGGCC CTCAGAATTT1351 CTTCCTGAGA GATTTTTAGA AAAAGCCGGT GGTGAAGGGG AAGTAGGTCC1401 GATTGATCTT AGGGGTCAAC ATTTCCAACT TTTGCCATTT GGGTCTGGTA1451 GGAGGATGTG CCCGGGAGTA AATTTGGCTA CTGCTGGAAT GGCCACGCTG1501 CTTGCATCCG TTATCCAAAC CTTTGATCTA CAGGTACCAG GCCCACAAGG1551 CCAAATATTA AAAGGAGATG AGGCTAAGGT TAGCATGGAA GAAAGAGCTG1601 GTCTCACTGT TCCAAGGGCA CATAATCTCA TCTGTGTTCC GCTTGCAAGA1651 GCAGGTGTCG CAGCTAAACT CCTTTCCTCT TGAAACCTAC AACAAAAAAG1701 ACAAGAATAA TGATGTCATG GAAGATGTTA TTTTATAATT TATATATGTT1751 TTGTAGTAAT ACTCATTTTC AATAAGGCGT CATTAATTAA GAGACAATGA1801 GTCCAAGCCA CGACACCCAC AGGATGTTGT TGGAAGAGAC ACGTATATGC1851 ATAGTCTCAA CTAGTCTCTC TTGTTATACA ATGTACTTCT TTTTTAGTCA1901 CAAATGAAAA TTGTTGCAAC TTCTATTTGT ATTTTTAAGG GCATATCCAC1951 TAATACTACA ATCTTGGTTT ATCTCTACAA AAAAAAAAAA AAAAA
全文摘要
本发明提供了一种蒙古黄芪异黄酮合成酶基因，该基因从蒙古黄芪克隆分离而得，其全长cDNA长度为1,995bp，其中开放阅读框位于106－1684位核苷酸，详细序列如表1。蒙古黄芪异黄酮合成酶是蒙古黄芪异黄酮合成的第一个关键酶，蒙古黄芪异黄酮合成酶基因控制着蒙古黄芪异黄酮合成酶的合成和表达，因此该基因对蒙古黄芪异黄酮合成酶开发有重要的应用价值。
文档编号C12P19/00GK1580274SQ20041003673
公开日2005年2月16日 申请日期2004年4月28日 优先权日2004年4月28日
发明者郑金贵, 张丹凤 申请人:福建农林大学