专利名称：肌酐含量测定方法及肌酐诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。
化学测定法——成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。
高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。
毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。
酶学测定法——主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物—还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的肌酐含量的测定方法，同时给出实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行肌酐含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定肌酐含量的步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、谷氨酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用肌酐脱亚胺酶偶联N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、谷氨酸脱氢酶反应比色或连续监测法。肌酐脱亚胺酶水解肌酐产生N-甲基海因，然后N-甲基海因酶作用于N-甲基海因和腺苷三磷酸产生氨甲酰肌氨酸，再通过氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(NADH、NADPH或其它类似物——在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(NAD+、NADP+或其它类似物——在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速(程)度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算肌酐的含量。
用以实现本发明方法的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l肌酐脱亚胺酶 1000--20000U/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l谷氨酸脱氢酶 5000--90000U/l稳定剂 10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源氨污染试剂I缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l谷氨酸脱氢酶 5000--90000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/l
肌酐脱亚胺酶 1000--20000U/l稳定剂10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，腺苷三磷酸、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，肌酐脱亚胺酶等也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源氨污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l谷氨酸脱氢酶 5000--90000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l肌酐脱亚胺酶 1000--20000U/l稳定剂 10--80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方。其中的试剂I的成分，腺苷三磷酸可以放在试剂II或试剂III中，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶可以放在试剂II中。试剂II其中的成分，N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶等也可以放在试剂I或试剂III中，谷氨酸脱氢酶也可以放在试剂I中。试剂III其中的成分，肌酐脱亚胺酶也可以放在试剂I或试剂II中。如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明肌酐诊断试剂盒较为理想缓冲液 80--120mmol/l腺苷三磷酸 2--6mmol/l2-酮戊二酸酯 6--12mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l肌酐脱亚胺酶 5000--10000U/l
N-甲基海因酶 5000--10000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 2000--8000U/l谷氨酸脱氢酶 8000--40000U/l稳定剂 20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源氨的污染，消除内、外源氨的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源氨已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试肌酐含量所需要的氨都是产生于肌酐的含量。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的肌酐诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l腺苷三磷酸 2mmol/l2-酮戊二酸酯 6mmol/l还原型辅酶 0.2mmol/l肌酐脱亚胺酶 5000U/lN-甲基海因酶 5000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 2000U/l谷氨酸脱氢酶 8000U/l
稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，从而测算出肌酐的含量。
本实施例应用肌酐脱亚胺酶偶联N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、谷氨酸脱氢酶反应比色或连续监测法。肌酐脱亚胺酶水解肌酐产生N-甲基海因，然后N-甲基海因酶作用于N-甲基海因和腺苷三磷酸产生氨甲酰肌氨酸，再通过氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(NADH、NADPH或其它类似物——在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(NAD+、NADP+或其它类似物——在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速(程)度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算肌酐的含量。
实施例二(双剂)本实施例的肌酐诊断试剂有
试剂I缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l2-酮戊二酸酯 9mmol/l还原型辅酶 0.25mmol/lN-甲基海因酶 8000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 5000U/l谷氨酸脱氢酶 24000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂II缓冲液 100mmol/l肌酐脱亚胺酶 8000U/l稳定剂 50％(总体积)测定肌酐含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，从而测算出肌酐的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的肌酐诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/l腺苷三磷酸6mmol/l2-酮戊二酸酯 12mmol/l还原型辅酶0.3mmol/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液120mmol/lN-甲基海因酶 10000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶8000U/l谷氨酸脱氢酶 40000U/l稳定剂50％(总体积)试剂III缓冲液120mmol/l肌酐脱亚胺酶 10000U/l稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子
N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，从而测算出肌酐的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的肌酐诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l2-酮戊二酸酯 8mmol/l还原型辅酶 0.25mmol/l谷氨酸脱氢酶 12000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂II缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 3mmol/l肌酐脱亚胺酶 6000U/lN-甲基海因酶 5000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 4000U/l稳定剂 50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，从而测算出肌酐的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种肌酐含量测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、谷氨酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水+H+肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨离子+碳酸氢根氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
2.根据权利要求1所述肌酐含量测定方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，测算出肌酐的含量。
3.根据权利要求1或2所述肌酐含量测定方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述肌酐含量测定方法，其特征在于被测肌酐样品与试剂的比例控制在1/10到1/500。
5.一种肌酐诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液40——200mmol/l腺苷三磷酸0.2——20mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5——50mmol/l还原型辅酶0.2——0.3mmol/l肌酐脱亚胺酶 1000——20000U/lN-甲基海因酶 1000——20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶1000——10000U/l谷氨酸脱氢酶 5000——90000U/l稳定剂10——80％(总体积)
6.根据权利要求5所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0-11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本发明还涉及肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、2－酮戊二酸酯、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、N－甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、谷氨酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出肌酐的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/32GK1757754SQ200410064889
公开日2006年4月12日 申请日期2004年10月10日 优先权日2004年10月10日
发明者王尔中 申请人:王尔中