专利名称：用于制备他克莫司的菌种诱变方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备他克莫司的菌种诱变方法，属于菌种的诱变选育技术。
背景技术：
自上世纪九十年代以来，我国器官移植工作已跃居亚洲首位，全国有100多家医院和200多位专家能进行25种同种异体器官移植。免疫抑制剂是进行器官移植的必需药物。环孢菌素等免疫抑制剂由于其肾毒性使其应用受到限制，新型免疫抑制剂的需求迫切。众多应运而生的许多新型免疫抑制剂在我国成功上市销售，其中以FK506(Tacrolimus)增长最快。FK506的中文名称为他克莫司，其商品名为谱乐可复(Prograf)。与环孢菌素相比，他克莫司有如下特点①免疫抑制作用强；②肝肾移植受体的急、慢性排斥反应小；③对细菌和病毒的抵抗力强等优点，已成为肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物，并将成为治疗特应性皮炎的首选药物。
尽管国内已有制备他克莫司的菌种，但该菌为未经有效的正诱变的普通菌株，制备他克莫司能力弱，效能低。其原始模式菌株为“筑波链霉菌”，拉丁文名称为“Streptomyces tsukubaensis”。
激光诱变技术在微生物诱变育种中的应用较为广泛，其作用于微生物细胞产生光、热、压力、电磁场、弱磁场作用等，改变了微生物细胞中DNA和RNA遗传密码的次序，引起变异。陈哲超等用半导体激光诱变处理果胶酶产生菌——黑曲霉，可使果胶酶产量提高3倍。韩建荣等采用激光对青霉PT95菌株的原生质体进行了诱变处理，选育到一株类胡萝卜素提高28.3％的突变菌株。而把激光应用在生产他克莫司菌种的选育方面，则未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种用于制备他克莫司的菌种诱变方法，依此方法诱变的菌种可以有效地提高他克莫司的产量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明对制备他克莫司的原始模式菌进行诱变，该模式菌为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)。该菌种诱变方法其特征在于包括以下过程在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，将悬液分装于无菌玻璃试管内，采用波长为632.8nmHe-Ne功率10～30mW下，对该孢子辐照5～25min，然后把经辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释100～10000倍后，涂布于高氏一号培养基平板中培养，从中获得诱变的遗传性状稳定、发酵单位提高5～30％的纯菌筑波链霉菌。
本发明的采用He-Ne激光照射的方式进行对制备他克莫司的菌种进行激光诱变的诱变方法，激光诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，在微生物制药菌种选育中有较大的推广价值。本发明通过利用He-Ne激光辐照进行诱变，可选育出高产免役抑制剂他克莫司链霉菌突变株。突变株正变率5～25％。发酵单位同原始菌株相比，提高5～30％。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。
实施例1在室温下，取斜面用无菌水制成105～107个孢子/mL的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照5min，辐照功率10mW，处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率6～8％。发酵单位提高12～13％。
实施例2在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，取上述经He-Ne激光辐照的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照5min，辐照功率20mW处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率12～13％。发酵单位提高17～18％。
实施例3在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，取上述经He-Ne激光辐照的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照15min，辐照功率20mW处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率22～23％。发酵单位提高27～28％。
实施例4在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，取上述经He-Ne激光辐照的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照15min，辐照功率30mW处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率17～18％，发酵单位提高12～13％。
实施例5在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，取上述经He-Ne激光辐照的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照25min，辐照功率10mW处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率17～18％，发酵单位提高12～13％。
实施例6在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，取上述经He-Ne激光辐照的悬液5mL置于直径2cm无菌小试管内进行He-Ne激光(λ＝632.8nm)辐照25min，辐照功率30mW处理后的悬液涂布于平板。突变株正变率7～8％，发酵单位提高7～8％。
权利要求
1.一种用于制备他克莫司的菌种诱变方法，其特征在于包括以下过程在室温下，取斜面孢子用无菌水制成105～107个孢子/mL悬液，将悬液分装于无菌玻璃试管内，采用波长为632.8nmHe-Ne激光在照射功率10～30mW下，对该孢子辐照5～25min，然后把经激光辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释100～10000倍后，涂布于高氏一号培养基平板中培养，从中获得诱变的遗传性状稳定、发酵单位提高5～30％的纯菌筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备他克莫司的菌种诱变方法，属于菌种的诱变选育技术。该方法包括以下过程在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，将悬液分装于无菌玻璃试管内，采用He－Ne激光辐照一定时间，然后把经激光辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释后，涂布于高氏一号培养基平板中培养，从中获得诱变的遗传性状稳定的纯筑波链霉菌。本发明的优点在于采用的激光诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，依此方法诱变得到的筑波链霉菌，同原始菌株相比，发酵单位提高5～30％。
文档编号C12N1/20GK1687398SQ20051001332
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者闻建平, 卢文玉, 冯伟, 财音青格乐 申请人:天津大学