专利名称：激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法
技术领域：
本发明属于微生物诱变技术领域，特别涉及利用激光诱变手段选育达托霉素高产突变株技术。
背景技术：
病原菌对抗生素产生耐药性是我国乃至全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗药菌的抗生素是解决这一问题的根本途径。万古霉素，曾被人们公认为是抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，然而，目前我国乃至世界范围内发现越来越多的抗该药耐药菌。开发新型高效的新一代抗生素迫在眉睫。
“玫瑰孢链霉菌”(拉丁文名称为“Streptomyces roseosporus”)是一种链霉菌属放线菌，其发酵产物可提取达托霉素(英文名“daptomycin”)，一种由一个十碳烷侧链与一个由13个氨基酸残基组成的环状β-氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成的酸性脂肽类抗生素。
达托霉素由于其独特的结构和作用机制，在临床上与万古霉素相比表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点，是目前世界公认的万古霉素等现用一线抗生素的最佳替代品。因此，达托霉素具有广阔的市场前景和巨大的经济效益，应加快该产品的产业化研究。
达托霉素2003年在美国已经实现工业化生产，2004年年销售额已超过8000万美元。尽管国内已有制备达托霉素的菌种，但该菌为未经有效的正诱变的普通菌株，制备达托霉素能力弱，效能低。
激光诱变技术在微生物诱变育种中的应用较为广泛，其作用于微生物细胞产生光、热、压力、点、电磁场、弱磁场作用等，改变了微生物细胞中DNA和RNA遗传密码的次序，引起变异。滕利荣等用He-Ne激光诱变处理透明质酸产生菌——兽疫链球菌，得到的正突变株透明质酸产量比原始菌株提高4.5倍。韩建荣等采用激光对青霉PT95菌株的原生质体进行了诱变处理，选育到一株类胡萝卜素提高28.3％的突变菌株。而把激光应用在生产达托霉素菌种的选育方面，则未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法，依此方法可以有效地提高达托霉素的产量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法，其特征在于包括以下过程将该模式菌为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在室温下，取斜面孢子用无菌水制成104～106个孢子/ml的孢子悬液，将0.1～0.3ml孢子悬液分装于无菌石英槽内，采用波长为632.8nm的He-Ne激光在照射功率5～30mW下，对该孢子辐照5～150min，然后把经辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释10～10000倍后，涂布于高氏一号培养基平板中28～30℃培养7～10d，选取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶，于28～30℃，180～220rpm摇床中培养90～120h，从而获得诱变的遗传性状稳定的纯菌玫瑰孢链霉菌。
上述的液体发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖0.6～1.0g，糊精2～4g，干酪素0.5～1.0g，花生饼粉0.4～0.6g，L-天冬素0.08～0.12g，K2SO40.4～0.6g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH 7.5。
本发明采用的He-Ne激光照射的方式进行对制备达托霉素的菌种进行激光诱变的诱变方法，激光诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，在微生物制药菌种选育中有较大的推广价值。本发明通过利用He-Ne激光辐照进行诱变，可选育出高产抗生素达托霉素链霉菌突变株。突变株正变率5～30％。发酵单位比原始菌株提高0.5～3.5倍。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照5min，辐照功率10mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率8～9％。发酵单位比原始菌株提高1.3～1.4倍。
实施例2在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照25min，辐照功率30mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率18～19％。发酵单位比原始菌株提高2.3～2.4倍。
实施例3在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照30min，辐照功率25mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率25～26％。发酵单位比原始菌株提高3.0～3.3倍。
实施例4在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照37.5min，辐照功率20mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率23～24％。发酵单位比原始菌株提高2.7～2.8倍。
实施例5在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照50min，辐照功率15mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率18～19％。发酵单位比原始菌株提高1.7～1.8倍。
实施例6在室温下，取玫瑰孢链霉菌斜面用无菌水制成104～105个孢子/ml的孢子悬液，吸取0.2ml置于总体积3.5ml(10×10×35mm)无菌石英槽内，进行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距离20cm，激光束直径10mm)辐照150min，辐照功率5mW。吸取辐照处理后的悬液0.1ml稀释100～1000倍后涂布于高氏一号培养基平板，30℃培养10d，挑取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基(组成为葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生饼粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml摇瓶中，于30℃，200rpm摇床中培养110h，HPLC法检测发酵液中达托霉素产量，挑选高产达托霉素的遗传稳定突变株。突变株正变率8～9％。发酵单位比原始菌株提高0.8～0.9倍。
权利要求
1.一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法，其特征在于包括以下过程将该模式菌为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在室温下，取斜面孢子用无菌水制成104～106个孢子/ml的孢子悬液，将0.1～0.3ml孢子悬液分装于无菌石英槽内，采用波长为632.8nm的He-Ne激光在照射功率5～30mW下，对该孢子辐照5～150min，然后把经辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释10～10000倍后，涂布于高氏一号培养基平板中28～30℃培养7～10d，选取生长良好的单菌株接种于盛有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶，于28～30℃，180～220rpm摇床中培养90～120h，从而获得诱变的遗传性状稳定的纯菌玫瑰孢链霉菌。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，液体发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖0.6～1.0g，糊精2～4g，干酪素0.5～1.0g，花生饼粉0.4～0.6g，L-天冬素0.08～0.12g，K2SO40.4～0.6g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.5。
全文摘要
本发明公开了一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法，属于菌种的诱变选育技术。该方法包括以下过程在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，将悬液分装于无菌石英槽内，采用He－Ne激光辐照一定时间，然后把经激光辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释后，涂布于高氏一号培养基平板中培养，从中获得诱变的遗传性状稳定的纯玫瑰孢链霉菌，选取纯菌株转接于液体发酵培养基中培养后选取遗传性状稳定的高产菌株。本发明的优点在于采用的激光诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，依此方法诱变得到的玫瑰孢链霉菌，同原始菌株相比，发酵单位提高0.5～3.3倍。
文档编号C12R1/465GK1793356SQ20051001584
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者闻建平, 卢文玉, 范晶华, 冯伟, 财音青格乐 申请人:天津大学