专利名称：一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13)，全称R-glutaminyl-peptideaminee γ-glutamyltransferase，简称TG，是一种催化酰基转移反应的转移酶。它可以催化大多数蛋白质的谷氨酰胺残基上的γ-羧酰胺基和赖氨酸残基上的γ-氨基之间形成ε-(γ-谷胺酰基)赖氨酸共价键。谷氨酰胺转胺酶可以催化大多数的食品蛋白质分子内或分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间连接，以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，很大程度上改善各种蛋白质的结构和功能性质，被誉为“21世纪超级粘合剂”。因此广泛被应用于肉制品、乳制品、小麦制品、豆制品及可食膜的制备中。在日本，谷氨酰胺转胺酶已成为食品工业的第二大酶种，其用量仅次于α-淀粉酶。此外谷氨酰胺转胺酶还应用于化妆品工业、制药工业及纺织工业和医学研究领域。
目前报道的生产TG的方法主要有从动植物组织中提取和从微生物发酵法生产两种。源于动植物的谷氨酰胺转胺酶来源稀少，提取工艺复杂，因此这种酶的售价较高，很难用于工业应用。采用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶(MTG)可以大幅度降低其生产成本，故而是拓宽谷氨酰胺转胺酶应用范围的根本途径。MTG是一种胞外酶，分泌在发酵液中。在发酵过程中，菌体从基质菌丝转化为气生菌丝及孢子形成时，需分泌出核酸酶和蛋白酶降解核酸和蛋白质来支持气生菌丝的生长。此外，相关研究表明降解酶可能在链霉菌的形态改变中起关键作用，同时MTG酶原产出后菌体需要分泌金属蛋白酶TAMEP切割酶原N端的41个氨基酸而使酶原具有活性，继而再分泌丝氨酸氨基肽酶SM-TAP切去4肽使其成为成熟的MTG，因此，MTG发酵中不可避免的存在蛋白酶。蛋白酶对蛋白质的水解作用与MTG的交联作用正好是两个相互矛盾的过程，在MTG产品的制备或应用过程中必须对蛋白酶进行抑制才可以避免蛋白酶对MTG作用的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种在MTG产品的制备或应用过程中对其中的蛋白酶进行抑制的方法，从而避免蛋白酶对MTG的作用产生不利的影响。
本发明的技术方案谷氨酰胺转胺酶发酵液中所含有的蛋白酶为金属离子依赖型蛋白酶，本发明采用谷氨酰胺转胺酶发酵液，在酶制剂的制备过程中或酶制剂的应用过程中，以添加金属离子鳌合剂的方式来抑制蛋白酶的活性，避免蛋白酶的水解作用，使MTG的交联作用不受其影响。具体操作工序为将MTG发酵液的浓缩酶液，添加辅料及保护剂的同时添加金属离子鳌合剂六偏磷酸钠或乙二胺四乙酸钠(EDTA)，添加量为0.002-0.01mmol螯合剂/U蛋白酶，经干燥、成品包装而制得MTG酶活为50-100U/g，蛋白酶活几乎全部被抑制的固体MTG产品；或者在应用MTG的时候同时添加金属离子鳌合剂六偏磷酸钠或EDTA。所添加的金属离子鳌合剂根据应用领域不同进行选择，纺织工业应用选择EDTA，食品、医药及化妆品领域应用选择六偏磷酸钠。
本发明的有益效果本发明采用六偏磷酸钠或EDTA对金属离子的鳌合作用抑制MTG酶制剂中蛋白酶的活力，避免蛋白酶对MTG的交联作用产生不利的影响。本发明的关键点是采用添加鳌合剂对MTG应用中的蛋白酶活进行抑制，方法简单，适用于工业化生产和应用，避免了必须的分离纯化工作带来的MTG酶活损失。
具体实施例方式
实施例1发酵得到的MTG固体酶制剂产品1，MTG酶活为80U/g，蛋白酶酶活为3000U/g。以酪蛋白为底物进行应用性实验，酶液中添加8mmol六偏磷酸钠/g酶粉(0.0027mmol六偏磷酸钠/U蛋白酶)，其中的蛋白酶被全部抑制，MTG酶活不受影响，并且电泳实验证实形成了交联蛋白。
实施例2发酵得到的MTG固体酶制剂2，MTG酶活为40U/g，蛋白酶酶活为80U/g。以酪蛋白为底物进行应用性实验，酶液中添加0.8mmol六偏磷酸钠/g酶粉(0.01mmol六偏磷酸钠/U蛋白酶)，其中的蛋白酶被全部抑制，MTG酶活不受影响，电泳实验证实形成了交联蛋白，并且形成了可倒置的强度较大的凝胶。
实施例3发酵得到的MTG发酵液，在提取的过程中，在超滤或干燥前添加六偏磷酸钠，超滤前添加金属离子螯合剂，使发酵液中的金属离子被螯合，通过超滤过程被除去；或干燥前添加金属离子螯合剂，使酶制剂中的金属离子被螯合。添加量为0.002-0.01mmol螯合剂/U蛋白酶，制得的固体酶制剂中蛋白酶的活性全部被抑制，同时MTG的收率不受影响。以酪蛋白为底物进行应用性实验，电泳实验证实形成了交联蛋白，并且很快形成了可倒置的强度较大的凝胶。
实施例4操作过程同实施例3，金属离子螯合剂改用EDTA。
对比实施例1发酵得到的MTG固体酶制剂产品1，MTG酶活为80U/g，蛋白酶酶活为3000U/g。在以酪蛋白为底物的应用实验中，始终没有形成可以倒置的凝胶，电泳实验证实也没有形成交联蛋白。说明蛋白酶的水解作用远超过MTG作用，无法实现MTG对蛋白质的交联反应。
对比实施例2发酵得到的MTG固体酶制剂2，MTG酶活为40U/g，蛋白酶酶活为80U/g。在以酪蛋白为底物的应用实验中，初期形成了强度很弱但仍无法倒置的凝胶，电泳实验证实形成了交联蛋白，但是随着时间的延长，形成的凝胶逐渐被蛋白酶水解。说明蛋白酶的作用影响了MTG的交联反应。
权利要求
1.一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法，其特征是采用谷氨酰胺转胺酶发酵液制备酶制剂，在酶制剂的制备过程中或应用过程中添加金属离子鳌合剂抑制其中蛋白酶活性，添加量为0.002-0.01mmol螯合剂/U蛋白酶，螯合剂为六偏磷酸钠或乙二胺四乙酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法，其特征是在酶制剂的制备过程中添加鳌合剂在超滤前添加金属离子螯合剂，使发酵液中的金属离子被螯合，通过超滤过程被除去；或干燥前添加金属离子螯合剂，使酶制剂中的金属离子被螯合。
3.据权利要求1所述的一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法，其特征是所添加的金属离子鳌合剂根据应用领域不同进行选择，纺织工业应用选择乙二胺四乙酸钠，食品、医药及化妆品领域应用选择六偏磷酸钠。
全文摘要
一种抑制谷氨酰胺转胺酶发酵法制酶制剂中蛋白酶的方法，属于酶制剂技术领域。本发明采用谷氨酰胺转胺酶发酵液制备酶制剂，在酶制剂的制备过程中或应用过程中通过添加金属离子鳌合剂抑制其中的蛋白酶活性，避免蛋白酶的水解作用对谷氨酰胺转胺酶的交联作用产生不利的影响。本发明方法操作简便、高效，省去了分离纯化等工序带来的繁琐，极易在工业生产中运用。
文档编号C12N9/99GK1724658SQ200510040489
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月8日 优先权日2005年6月8日
发明者陈坚, 刘和, 崔莉, 张东旭, 堵国成 申请人:江南大学