专利名称：一种带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的制备及鉴定方法
技术领域：
本发明是一种单克隆抗体的制备及鉴定方法，属于抗体工程的技术领域。
背景技术：
我们从野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)胚胎cDNA文库中筛选得到一个新的未知功能基因，命名为ecp(Genbank登陆号AF325529)。Blast结果表明ECP蛋白与BZAP45氨基酸序列有51％的一致性和74％的同源性、与Bdm2有49％的一致性和73％的同源性、与HSPC028、agcp1517、MSTP017也都具有近50％的一致性和约70％的同源性。这些蛋白在N-端均有一个亮氨酸拉链结构域，C-段有一个核苷酸(ATP或GTP)结合结构域。BZAP45含419个氨基酸，分子量约为45kd，在Hela S3细胞中，它能通过与Site II位点的间接相互作用反式激活组蛋白H4启动子的转录活性。推测它可能是G1/S转换过程中的调节因子，在细胞周期调控中具有重要作用。bdm2编码419个氨基酸，Northern blot结果表明，bdm2 mRNA在大鼠晚期胎脑中高表达，出生后的早期仍可检出低水平的表达，在成鼠脑中几乎检测不出bdm2 mRNA。另一方面，当用retinoic acid和Ara C诱导mousecarcinoma细胞株P19向神经细胞分化时，bdm2高表达，再经DMSO处理向非神经细胞分化时，bdm2的表达则明显随时间逐渐降低。据此，我们认为bdm2可能是一个与神经细胞增殖和分化有关的基因。
ecp cDNA全长1572bp，含有一个1266bp的开放阅读框，编码422个氨基酸。生物信息学分析表明在小鼠、大鼠、人等物种基因组中均存在同源序列散在不同的染色体上。它们编码的氨基酸序列在物种进化过程中十分保守，N-端都有一个亮氨酸拉链结构域，C-端有一个核苷酸(ATP或GTP)结合结构域，表明其功能十分相似而重要。另一方面，我们已经对ecp的功能进行了初步的研究。RNAin-situ Hybridization结果表明，贯穿果蝇胚胎发育的不同时期，均有ECP mRNA的持续高表达，且无明显组织特异性，由此可见，ecp在果蝇发育过程中必定具有重要的功能。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的制备及鉴定方法，利用该抗体可以高效、特异性的在果蝇各组织中检测到ECP蛋白的表达；同时，利用该抗体，在小鼠不同组织中也能检测到阳性信号，具有潜在的广谱性应用价值。
技术方案根据ecp基因全长cDNA序列设计上、下游两条引物进行PCR扩增，扩增产物与载体连接构成重组质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达ECP-GST重组蛋白并将其纯化。用纯化的ECP-GST融合蛋白免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体(mAb)。为了获得抗体的抗原表位，将ECP蛋白分为四段，诱导表达四段截短蛋白。采用间接ELISA法、免疫印迹试验(Western blot)对单克隆抗体进行鉴定。结果，获得一株稳定分泌抗ECP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，命名为8G9。经鉴定，8G9分泌的抗ECP单克隆抗体的Ig亚类为IgG1，轻链属于κ型，其效价为1∶1×105～1∶1×106。此抗体所针对的抗原表位在第231～300个氨基酸这一区域。
本发明的带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的制备方法具体为步骤1)、根据ecp基因全长cDNA序列设计上、下游两条引物进行PCR扩增，扩增产物与载体连接构成重组质粒，转化大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到ECP-谷光甘肽转移酶(ECP-GST)融合蛋白，并将其纯化，步骤2)、用纯化的ECP-GST融合蛋白免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，步骤3)、取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞在聚乙二醇(PEG)作用下进行体外融合，经筛选，得到能稳定分泌抗ECP单克隆抗体的细胞株，用抗体纯化试剂盒从该细胞株的培养上清中纯化得到抗ECP的单克隆抗体。
本发明的带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的鉴定方法为1)细胞上清mAb的效价测定将纯化的抗ECP单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价；经测定8G9细胞株分泌的抗ECP单克隆抗体的效价为1∶1×105～1∶1×106；2)mAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒(Mouse Mab Isotyping test Kit)的亚类检测试纸进行测定，抗ECP单克隆抗体8G9重链为IgG1型，轻链属于κ型；
3)mAb特异性鉴定采用免疫印迹法(Western blot)进行特异性检测。我们以制备的抗ECP单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗进行Western blot，结果表明，该抗体能特异检测到ECP在果蝇组织中的表达；4)抗原表位的确定根据ecp基因cDNA序列分别设计四对引物进行PCR扩增，将ECP全长422个氨基酸分成了四个区段，分别为1～130aa、131～230aa、181～300aa、301～422aa。将扩增产物分别连接到表达载体pGEX-4T-1(His)6C中构建成重组质粒，转化E.coli BL21菌株体外诱导表达蛋白并纯化，结果表明，此抗体识别的抗原表位在231～300aa这一区段内。
有益效果本发明提供了一种获得高度特异性抗ECP的单克隆抗体制备和鉴定方法，其与ECP蛋白作用位点在第231～300氨基酸这一区域。利用此抗体，可以在果蝇不同组织中检测到ECP的表达，同时在小鼠及其他物种中也能检测到与ECP类似蛋白的的阳性信号，具有潜在广谱性应用价值。
具体实施例方式
重组蛋白ECP-GST、生理盐水、福氏(Freund)完全佐剂按体积比40∶360∶400混合乳化，免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，ECP-GST剂量为40μg/只，每只小鼠腹腔注射0.4ml，两周后加强免疫一次，剂量相同，佐剂改为福氏不完全佐剂。两周后加强免疫第二次，佐剂同样为福氏不完全佐剂。第二次加强免疫四周后进行冲击免疫，剂量相同，不加佐剂。末次免疫第四天融合，融合当日摘取小鼠眼球采血，分离收集血清作为阳性对照。将ECP-GST免疫小鼠制备脾细胞悬液，在50％PEG作用下与处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，脾细胞与骨髓瘤细胞细胞数比以10∶1为佳。采用间接ELISA法筛检抗体。用ECP-GST重组蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为阴性对照，根据方阵滴定结果，ECP按1∶1000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔。间接ELISA法检测，TMB底物显色。GST-ECP阳性，同时GST阴性者为阳性。阳性孔用有限稀释法亚克隆3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为8G9。收集细胞分泌上清，采用Millipore公司抗体纯化试剂盒纯化抗体。
1.ECP-GST蛋白的诱导表达根据ecp基因cDNA序列设计上、下游两条引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，进行BamHI/XhoI双酶切，并与经同样酶切的pGEX-4T-1(His)6C(含有GST融合标签)载体连接，转化E.coli BL21菌株，细菌培养至A600＝0.4，加IPTG 0.1mM，26℃过夜诱导表达ECP-GST蛋白，收集细菌，1×PBS重悬，高压破碎，离心(12000g，4℃)收集上清，过滤，按说明书操作，采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B柱纯化纯化ECP-GST重组蛋白并对蛋白进行定量。
2.杂交瘤技术制备抗ECP单克隆抗体重组蛋白ECP-GST、生理盐水、福氏完全佐剂按体积比40∶360∶400混合乳化，免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，ECP-GST剂量为40μg/只，每只小鼠腹腔注射0.4ml，两周后加强免疫一次，剂量相同，佐剂改为福氏不完全佐剂。两周后加强免疫第二次，佐剂同样为福氏不完全佐剂。第二次加强免疫四周后进行冲击免疫，剂量相同，不加佐剂。末次免疫第四天融合，融合当日摘取小鼠眼球采血，分离收集血清作为阳性对照。将ECP-GST免疫小鼠制备脾细胞悬液，在50％聚乙二醇(PEG)作用下与处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，脾细胞与骨髓瘤细胞细胞数比以10∶1为佳。采用间接ELISA法筛检抗体。用ECP-GST重组蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为阴性对照，根据方阵滴定结果，ECP按1∶1000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔。间接ELISA法检测，TMB底物显色。GST-ECP阳性，同时GST阴性者为阳性。阳性孔用有限稀释法亚克隆3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为8G9。收集细胞分泌上清，采用Millipore公司抗体纯化试剂盒纯化抗体。
3.ECP单克隆抗体的特性鉴定(1)细胞上清mAb的效价测定将纯化的抗ECP单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接ELISA法测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。经测定8G9细胞株分泌的抗ECP单克隆抗体的效价为1∶1×105～1∶1×106。
(2)mAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒(Mouse Mab Isotyping test Kit)的亚类检测试纸进行测定，抗ECP单克隆抗体重链为IgG1，轻链属于κ型。
(3)mAb特异性鉴定采用免疫印迹法(Western blot)进行特异性检测。我们以制备的抗ECP单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗进行Western blot。结果表明，该抗体能特异检测到ECP在果蝇组织中的表达。
(4)抗原表位的确定根据ecp基因cDNA序列分别设计四对引物进行PCR扩增，将ECP全长422个氨基酸分成了四个区段，分别为1～130aa、131～230aa、181～300aa、301～422aa。将扩增产物分别连接到表达载体pGEX-4T-1(His)6C中构建成重组质粒，转化E.coliBL21菌株体外诱导表达蛋白并纯化。以本文制备的抗ECP单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗，进行Western blot。结果表明，此抗体识别的抗原表位在231～300aa这一区段内。
权利要求
1.一种带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于制备的方法为步骤1)、根据ecp基因全长cDNA序列设计上、下游两条引物进行PCR扩增，扩增产物与载体连接构成重组质粒，转化大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达得到ECP-谷光甘肽转移酶融合蛋白，并将其纯化，步骤2)、用纯化的ECP-GST融合蛋白免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，步骤3)、取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，经筛选，得到能稳定分泌抗ECP单克隆抗体的细胞株，用抗体纯化试剂盒从该细胞株的培养上清中纯化得到抗ECP的单克隆抗体。
2.一种如权利要求1所述的带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的鉴定方法，其特征在于鉴定的方法为1)细胞上清mAb的效价测定将纯化的抗ECP单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接酶联免疫吸附实验测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价；经测定“8G9”细胞株分泌的抗ECP单克隆抗体的效价为1∶1×105～1∶1×106；(2)mAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒的亚类检测试纸进行测定，抗ECP单克隆抗体8G9重链为IgG1型，轻链属于κ型；(3)mAb特异性鉴定采用免疫印迹法进行特异性检测。我们以制备的抗ECP单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗进行Western blot，结果表明，该抗体能特异检测到ECP在果蝇组织中的表达；(4)抗原表位的确定根据ecp基因cDNA序列分别设计四对引物进行PCR扩增，将ECP全长422个氨基酸分成了四个区段，分别为1～130aa、131～230aa、181～300aa、301～422aa。将扩增产物分别连接到表达载体pGEX-4T-1(His)6C中构建成重组质粒，转化E.coli BL21菌株体外诱导表达蛋白并纯化，结果表明，此抗体识别的抗原表位在231～300aa这一区段内。
全文摘要
带亮氨酸拉链结构域蛋白单克隆抗体的制备及鉴定方法，是一种单克隆抗体的制备及鉴定方法，其制备的方法为根据ecp基因全长cDNA序列设计上、下游两条引物进行PCR扩增；用纯化的ECP－GST融合蛋白免疫6～8周龄Balb/c雌鼠；取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，得到抗ECP的单克隆抗体。鉴定的方法为细胞上清mAb的效价测定mAb的Ig亚类测定mAb特异性鉴定抗原表位的确定结果表明，此抗体识别的抗原表位在231～300aa这一区段内。利用该抗体可以高效、特异性的在果蝇各组织中检测到ECP蛋白的表达；同时，利用该抗体，在小鼠不同组织中也能检测到阳性信号，具有潜在的广谱性应用价值。
文档编号C12N15/62GK1710078SQ20051004040
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者谢维, 刘加彬, 汪道涌, 张建琼 申请人:东南大学