专利名称：胡萝卜黑腐病的pcr检测及鉴定优化方法
技术领域：
本发明涉及一种胡萝卜黑腐病的PCR检测及鉴定优化方法，属于农作物病害防治领域。
背景技术：
我国是优质胡萝卜原料的生产大国。黑龙江、吉林、青海、陕西、内蒙古、新疆、甘肃、宁夏等省区是我国优质胡萝卜原料的主要产区，资源优势和技术优势的结合，将使我国可能成为国际上最大胡萝卜优质工业原料和胡萝卜功能食品的加工、出口国。近年来各地胡萝卜种植面积迅速扩大，由于生产管理不善等因素，胡萝卜病害逐渐加重。
由真菌Alternaria radicina和A.dauci是胡萝卜上最重要的种传、土传真菌，在全世界胡萝卜产区都能发现，在大田和储藏期均可发病，引起叶片黑斑病和根部黑腐病。黑腐病主要特征是在胡萝卜的叶柄，冠部和根部有坏死斑，在储藏期发病严重，在潮湿的条件下很容易从一个胡萝卜传到另一个胡萝卜上。Alternaria的分生孢子可以在显微镜下检测，但是由于Alternaria radicina的分生孢子在大小和形态上与Alternaria dauci很相似。Alternaria dauci分生孢子单个着生，2个成串的很少见，5-11个横隔，1个或几个竖隔或纵隔。Alternaria radicina分生孢子单个着生，少数2个或3个成串，卵圆形，椭圆的，孢子两端圆形，1-10个横隔，几个竖隔或纵隔，但从形态上很难准确鉴定。虽然已有冰冻封闭法和选择性培养基法，但需7-14天才能判定结果，由于形态太相似，易导致鉴定有误，况且，一旦病菌量太少就有可能无法鉴定。随着现代分子生物学技术的发展，特别是PCR技术，为鉴定提供了了准确而又快速的方法。国外开展了这项研究，分别设计了特异性引物ARF25-AAT CAG CGTCAG TAA ACA AAC G-3，ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3鉴定出现频率较高的Alternaria radicina和易与该种混淆的Alternaria dauci的特异引物对ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3，ADR15-CGC AAG GGG AGA CAAAAA-3。已有的PCR程序无预变性，导致扩增后经常检测不到产物。
发明内容
本发明克服已有技术中的不足，提供一种操作简单、结果可靠、效率高的植物病害的快速诊断鉴定方法。
用于检测胡萝卜黑腐病菌的PCR方法，其步骤是1胡萝卜黑腐病菌菌株分离胡萝卜病样取病健交界处1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分钟，再用灭菌水漂洗三次，每次3分钟，凉干，在PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基25℃培养7天。
2胡萝卜黑腐病病菌基因组DNA提取采用CTAB法进行(1)供试菌株在PDA液体培养基上25℃，100rpm生长5-7天，菌丝用灭菌的漏斗和滤纸过滤，放在50℃烘箱中烘24小时。
(2)用无菌刀片刮下菌丝放入灭菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状。
(3)粉末转入离心管中，加入750μLDNA提取液(100mM Tris pH8.0，100mMEDTA 250mM Nacl)100μL 10％的SDS，75μL的5mM Nacl，65μL10％CTAB充分混合后放入65℃水浴锅中30分钟。
(4)取出离心管于12000rpm离心10分钟吸取上清液。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)充分混匀后12000rpm离心10分钟，吸上清液，重复抽提1-2次。
(5)加入2倍体积的冰无水乙醇，置于4℃冰箱中沉淀，12000rpm离心(6)10分钟收集DNA沉淀。
(7)用70％乙醇洗涤一次；加入100-200μLTE溶液溶解，-20℃保存。3用于检测胡萝卜黑腐病特异性引物引物ARF25-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀释至10um，分装，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡萝卜黑腐病特异性扩增出343bp的产物。
4PCR反应扩增的体系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每个dNTP200um，每个引物1.5um，1.5单位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反应体积。
5PCR反应扩增反程序94℃预变性4min，PCR反应条件按每循环94℃变性2min，70℃40sec退火，72℃1min。扩增共进行35个循环。最后72℃延伸5min，PCR反应产物4℃保存。
6PCR产物鉴定取5μL扩增产物于3％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，脱色，置于UPV紫外成像系统上观察成像。根据扩增产物的大小来判定结果。
本发明的有益效果对胡萝卜黑腐病的早期快速诊断和病害防治具有重要的实用价值。本方案中加入了94℃预变性4min，使扩增的灵敏度提高。预变性在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环，模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要。经多次试验，我们在已有的PCR扩增反应程序中增加了94℃预变性4min，使扩增效率大幅度提高，弥补了原技术的不足。
附图是引物ARF2/ARR3对胡萝卜病样分离菌株进行的优化和未优化PCR扩增结果。
其中1、2、3泳道为胡萝卜黑腐病菌用未优化PCR程序扩增结果，4、5泳道为胡萝卜黑腐病菌用优化PCR程序扩增结果，6泳道为50bp DNALadder.7泳道为镰刀菌菌株(Fusarium solani)。8泳道为阴性对照。
具体实施例方式
实施例一1引物ARF2/ARR3对胡萝卜病样分离出的两种菌株(一种是镰刀菌属的菌株，一种是胡萝卜黑腐病菌株)采用本优化程序进行的PCR扩增结果具体步骤如下1)胡萝卜黑腐病菌菌株分离胡萝卜病样取病健交界处1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分钟，再用灭菌水漂洗三次，每次3分钟，凉干，在PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基25℃培养7天。
2)胡萝卜黑腐病病菌基因组DNA提取采用CTAB法进行3)用于检测胡萝卜黑腐病特异性引物引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀释至10um，分装，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡萝卜黑腐病特异性扩增出343bp的产物。
4)PCR反应扩增的体系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每个dNTP200um，每个引物1.5um，1.5单位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反应体积。
5)PCR反应扩增反程序94℃预变性4min，PCR反应条件按每循环94℃变性2min，70℃40sec退火，72℃1min。扩增共进行35个循环。最后72℃延伸5min，PCR反应产物4℃保存。
6)PCR产物鉴定取5μL扩增产物于3％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，脱色，置于UPV紫外成像系统上观察成像。根据扩增产物的大小来判定结果。
实施结果利用引物ARF2/ARR3以胡萝卜病样分离出的两种菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，胡萝卜黑腐病菌株扩增出产物为343bp的条带，而镰刀菌菌株没有扩增出产物。说明镰刀菌不是引起胡萝卜黑腐病的病原菌。
2引物ARF2/ARR3对胡萝卜黑腐病菌采用非优化程序的PCR扩增结果方法同实例优化程序的PCR扩增，不同的是PCR反应扩增程序中没有94℃，4min的预变性。
实施结果同时利用引物ARF2/ARR3以胡萝卜黑腐病菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果只有三分之一样品有扩增结果，三分之二样品无扩增结果。而且条带的亮度与PCR反应扩增程序中有94℃，4min的预变性条带的亮度相比，扩增效果不如后者好。
实施例二利用Alternaria dauci的特异性引物ADF2/ADR1以胡萝卜黑腐病菌菌株的基因组DNA为模板进行优化与非优化程序PCR扩增方法同实例1，只是采用用Alternaria dauci的特异性引物ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3ADR15-CGC AAG GGG AGA CAA AAA-3引物稀释至10um，分装，-20℃保存。(由北京三博远志有限公司合成)实施结果利用Alternaria dauci的特异性引物ADF2/ADR1以胡萝卜黑腐病菌菌株的基因组DNA为模板进行优化与非优化PCR扩增，均没有扩增出条带。说明我国胡萝卜黑腐病是由真菌Alternaria radicina引起的。
权利要求
1.一种胡萝卜黑腐病的PCR检测及鉴定优化方法，包括以下步骤1)胡萝卜黑腐病菌菌株分离胡萝卜病样取病健交界处1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分钟，再用灭菌水漂洗三次，每次3分钟，凉干，在PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基25℃培养7天；2)胡萝卜黑腐病病菌基因组DNA提取采用CTAB法进行；3)胡萝卜黑腐病病菌的PCR检测中使用的特异性引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-34)PCR的反应体系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每个dNTP200um，每个引物1.5um，1.5单位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反应体积；5)PCR的扩增程序94℃预变性4min，PCR反应条件按每循环94℃变性2min，70℃40sec退火，72℃1min，扩增共进行35个循环，最后72℃延伸5min；6)取5μL扩增产物于3％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，脱色，置于UPV紫外成像系统上观察，根据343bp扩增产物的有无来判定结果。
全文摘要
本发明用于检测及鉴定胡萝卜黑腐病菌的PCR方法，适用于检测胡萝卜黑腐病和早期诊断，准确鉴定引起该病的病原(Alternaria radicina)。属于农作物病害防治领域。该方法根据胡萝卜黑腐病菌的特异性引物检测胡萝卜黑腐病菌，扩增产物大小为343bp。同时，本方法对PCR的扩增程序进行了优化，增加了94℃预变性4min，提高了检测的灵敏性。是对胡萝卜黑腐病菌特异性引物检测方法的补充和改进。
文档编号C12Q1/68GK1824799SQ200510048769
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者黄琼, 赵莹莹, 王云月, 孙跃先, 焦玉霞 申请人:云南农业大学